苯酚硫酸法测定多糖
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
改良的苯酚硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究
改良的苯酚硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究一、本文概述多糖和寡糖作为生命体系中的重要组成部分，广泛存在于各类生物体内，具有多种生物学功能，如能量储存、细胞识别、信号传导等。
因此，准确测定多糖和寡糖的含量对于理解其生物学作用以及评估其在食品、医药等领域的应用价值具有重要意义。
传统的苯酚硫酸法是一种常用的多糖和寡糖含量测定方法，但由于其存在的一些局限性，如灵敏度低、抗干扰能力差等，使得该方法在实际应用中受到一定的限制。
因此，本文旨在研究改良的苯酚硫酸法，以提高其测定多糖和寡糖含量的准确性和稳定性，为多糖和寡糖的研究和应用提供更为可靠的分析方法。
本文首先将对传统的苯酚硫酸法进行详细的介绍和分析，阐述其原理、操作步骤以及存在的问题。
在此基础上，本文将详细介绍改良的苯酚硫酸法的具体实施方案，包括试剂的选择、反应条件的优化、干扰物质的排除等方面。
随后，本文将通过一系列的实验验证改良后的方法的可行性和准确性，包括标准曲线的绘制、精密度和稳定性的考察、实际样品的测定等。
本文将对改良的苯酚硫酸法的应用前景进行展望，探讨其在多糖和寡糖研究以及相关领域的应用价值。
通过本文的研究，期望能够为多糖和寡糖含量的准确测定提供一种更为可靠的分析方法，为相关领域的研究和应用提供有益的参考。
二、材料与方法本实验所使用的主要试剂包括苯酚、硫酸、多糖标准品（如葡萄糖、果糖等）以及待测的多糖和寡糖样品。
所有试剂均为分析纯，购自国内知名试剂供应商。
实验所需设备包括电子天平、水浴锅、分光光度计、离心机等。
苯酚硫酸法是一种基于多糖和寡糖在浓硫酸作用下与苯酚发生显色反应的原理来测定其含量的方法。
在酸性条件下，多糖和寡糖会被硫酸水解成单糖，随后与苯酚发生缩合反应，生成有色化合物，其颜色深浅与多糖和寡糖的含量成正比。
（1）标准曲线的绘制：准确称取适量多糖标准品，用蒸馏水配制成不同浓度的标准溶液。
分别取各浓度标准溶液与苯酚硫酸试剂混合，于沸水浴中加热一定时间后冷却，用分光光度计测定各溶液在特定波长下的吸光度。
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1.目的要求测量蔥酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品屮的多糖含量2•方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3•主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馆装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
5 .试剂配制1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馅水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馆水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2)90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL,蒸憎水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶屮避光保存3)6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%,即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤0123456AvV丨• ■ •葡萄糖0. 00. 10. 20. 30.40. 60. 8 1.0苯酚液0. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 5浓硫酸 3. 0 3. 0 3. 0 3. 0 3.0 3. 0 3. 0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n,取出凉水冷却lOmin,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处(490nm)测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2)待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馅水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
硫酸苯酚法测多糖
一、总糖含量标准曲线的绘制
准确称取无水葡萄糖10 mg，溶解后转入100 mL容量瓶定容。
按表4所示操作。
表4 总糖含量标准曲线绘制方法
管号0 1 2 3 4 5
标准葡萄
糖溶液
（mL）
0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8
蒸馏水
（mL）
2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 6%苯酚各1.0 mL
浓硫酸各5.0 mL
检测
摇匀后沸水加热10 min，冷却至室温后于490 nm处以0号管为空白对照，测光密度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线：Y=aX+b（Y为吸光值,X为葡萄糖质量/ug）。
二、试液总糖含量的测定
用移液枪从总体积V中吸取一定体积V1ml的待测液，用蒸馏水补至体积为2 mL，加入6%苯酚1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，空白对照以蒸馏水代替待测液，摇匀后沸水加热10 min，冷却后，在490 nm处测定吸光值为A。
查标准曲线，算出总糖含量。
m(g)=V(A−b)/a
1000000V1。
苯酚-硫酸法快速测定多糖方法的优化
1.2.3 单因素试验设计以100μg/mL 葡萄糖标准溶液200μL 为研究对象，酶标仪检测波长为490nm 时的OD 值作为评价指标，分别考察苯酚用量(100、200、300、400、500μL)、浓硫酸用量(600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500μL)、反应温度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)、反应时间(5、10、15、20、25、30、40、50、60min)等因素对OD 490nm 值的影响[6]。
1.2.4 正交优化试验在1.2.3单因素试验结果的基础上，选择苯酚用量(A)、浓硫酸用量(B)和反应温度(C)3个因素为自变量，以OD 490nm 值为评价指标，进行L9(33)正交试验，试验因素及水平见表1。
表1 正交试验因素水平表2200700803300800901.2.5 标准曲线制作以蒸馏水为空白，分别精密吸取浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，在每支离心管中加入5%苯酚溶液200μL 、浓硫酸700μL 后，迅速摇匀，80℃水浴10min 后，冷水浴5min 终止反应，精密吸取各反应液加入96孔酶标板，每个样品加3个孔，每孔200μL ，采用酶标仪在490nm 波长下测定OD 值，以葡萄糖浓度为横坐标，OD 490nm 值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.6 酶标仪测定多糖的可行性分析精密吸取浓度为40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，按照1.2.5的操作方法加入苯酚、浓硫酸反应后，酶标仪测定OD 490nm 值，并根据标准曲线计算多糖含量。
2 结果与分析2.1 酶标仪检测波长的确定采用苯酚-硫酸法对葡萄糖标准品进行测定，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm 波长范围内进行扫描，结果如图1所示，葡萄糖标准品在490nm 处有最大吸收峰，故可选择490nm 作为酶标仪检测波长。
苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量 标准作业指导书
产品质量胞外多糖的测定
1目的
依据有关方法和标准，建立公司测量土壤中胞外多糖的标准方法。
2适用范围
本文件规定了测定胞外多糖含量的苯酚-硫酸法。
本实验采用苯酚-硫酸法，该实原理是：浓硫酸水合产生的高温快速分解多糖产生单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，生成的糖醛衍生物又与苯酚反应生成橙黄色化合物，再以比色法测定
本标准适用于蓝藻门、绿藻等藻类胞外多糖的测定。
3参考文件
无
4定义
胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS):是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。
5职责
5.1测试工程师依照国家标准的更新、或者方法的改良，不定期更新本文件。
5.2测试工程师应当对测试人员进行培训、考核、上岗认定和定期技能查验，对于技能不达标的人员予以相关处理。
5.3测试人员应当严格依照本文件方法测定相关样品的胞外多糖含量，保证安全的情况下，认真仔细地完成实验。
6程序
6.1试剂和材料
表1准备试剂和材料清单
表2混合材料和溶液配置清单
6.2仪器设备
表3仪器设备清单
6.3操作流程表
表4胞外多糖的测定操作流程表
6.4具体操作流程
表5胞外多糖的测定具体操作
7附件
附件1《实验室测试报告》。
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖原理硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法。
它基于多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物的原理。
本文将详细介绍硫酸苯酚法的测定原理及操作步骤。
一、原理多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物，同时伴随着苯酚的生成。
苯酚在测定中以红色产物的形式存在，其吸光度与多糖的含量成正比。
因此，通过测定红色产物的吸光度，就可以确定多糖的含量。
二、操作步骤1. 样品处理：将待测的多糖样品溶解于适量的水中，并进行适当的稀释，使得多糖浓度在硫酸苯酚法的线性范围内。
确保样品中没有其他干扰物质的存在。
2. 反应体制：将样品溶液与硫酸苯酚试剂混合，加入适量的浓硫酸，混匀后放置于水浴中加热。
加热时间一般为5-10分钟，加热温度为100-110摄氏度。
3. 冷却与测定：将反应体系冷却至室温后，使用紫外可见光谱仪或分光光度计测量红色产物的吸光度。
根据预先建立的标准曲线，可以计算出多糖的含量。
三、注意事项1. 操作过程中要注意安全，避免与浓硫酸直接接触，避免产生有毒气体。
2. 硫酸苯酚试剂需保存在避光的环境中，避免暴露于阳光下。
3. 加热过程中要控制温度，避免过高温度导致产物分解。
4. 测定前要校准光谱仪或分光光度计，确保准确测量吸光度。
四、优缺点硫酸苯酚法作为一种测定多糖含量的方法，具有以下优点：1. 简单易行：只需准备少量试剂和仪器设备，操作简便。
2. 灵敏度高：对于大多数多糖具有较高的灵敏度，可以检测到低浓度的多糖。
3. 可靠性好：经过多次验证，该方法的准确性和可重复性较高。
然而，硫酸苯酚法也存在一些局限性：1. 只适用于含有醛基的多糖：该方法只对具有醛基的多糖有效，对于其他类型的多糖则不适用。
2. 反应条件严格：反应温度和时间需要严格控制，否则会影响测定结果的准确性。
3. 有干扰物：一些其他物质可能与硫酸苯酚反应产生类似红色产物，从而干扰多糖的测定。
硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，其原理基于多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物的特性。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
苯酚硫酸法测定多糖
分子量大于10，000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。
2. 适用范围参照AOAC方法。
适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。
3.仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）旋转混匀器（4）恒温水浴锅4.试剂除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
（1）80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。
（2）2.5 mol/L NaOH溶液：100 g NaOH加蒸馏水稀释至1 L，加入固体无水硫酸钠至饱和。
（3）铜贮存液：称取3.0 g CuSO4 ·5H2O，30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。
溶液可贮存2周。
（4）铜应用溶液：取铜贮存液50 ml，加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。
（5）洗涤液：取水50 ml，加入10 ml铜应用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液，混匀。
（6）1.8 mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。
（7）20 g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。
（8）葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h 至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。
准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0 mg/ml。
（9）葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。
5. 操作方法5.1 样品处理（1）样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml （V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。
（2）沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml （V2），置于烧杯中，加热浓缩至10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。
实验一硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸苯酚法测多糖含量The pony was revised in January 2021实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求? 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．2．方法原理3．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
4．3．主要实验仪器及材料5．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
6．４．掌握要点7．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
8．５．试剂配制9．1）葡萄糖标准液的配制10．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
11．2）90%苯酚液的配制12．?准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤7.管号 0? 1 2 3 4 5 6 78.葡萄糖9.10.苯酚液11.浓硫酸?12.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL 软件求得回归方程13.2）待测样品多糖的测定与计算14.将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚-硫酸法测多糖含量
苯酚-硫酸法测多糖含量原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
试剂1．浓硫酸：分析纯，95.5%2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8． 6mol/L 盐酸操作1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。
因为其脂肪含量大容易夹带残渣。
）③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。
水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1. 目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2•方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3•主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
5 .试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤AvV 口吕号0 1 2 3 4 5 6葡萄糖0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表 2方法在操作，先在冰水浴中加入 0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n, 取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用 exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
硫酸苯酚测多糖
实验八硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求目前植物性功能多糖是食品化学领域研究的热点之一，本实验的目的是让学生掌握本方法，以及以单糖为标准建立的标准曲线在适用到多糖时添加转换系数的方法。
2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
５．实验步骤1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，用蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）苯酚液的配制准确移取苯酚6 mL，蒸馏水定容至100 mL，即得6％苯酚液，棕色瓶中避光保存。
表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8苯酚液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0浓硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0取8支干净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5 min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程3）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
糖含量测定-苯酚硫酸法
1．1原理
多糖可以被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长490nm处和一定浓度范围内，其吸光度值与糖含量呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
1．2实验步骤
1．2．1100μg/ml D-葡萄糖对照品溶液制备
精密称取10mg D-葡萄糖，加纯化水充分溶解，定容至100ml，作为对照品溶液。
1．2．26%苯酚溶液配制
称取6g苯酚，加入纯化水充分溶解，定容至100ml，备用。
1．2．3对照品管制备
取8支试管，按下表按下表加入100μg/ml D-葡萄糖对照品溶液：
1．2．4供试品管制备
将供试品采用纯化水稀释至D-葡萄糖标准曲线范围内，每步稀释应不超过10倍。
10倍及以内的稀释直接在玻璃试管中进行。
10倍稀释用移液器量取供试品100μl，加纯化水900μl，振荡混匀。
原倍稀释直接取供试品1.0ml加入玻璃试管中。
10倍以内稀释操作按下表在试管中加入相应溶液。
大于10倍的稀释需按下表操作在离心管中先做10倍或100倍稀释（2步10倍稀释）后，再在玻璃试管中按照下表量取稀释。
更高稀释倍数也按照上述原则进行。
1．2．5试验操作
向含有1ml标对照品和供试品的试管中加入0.6ml 6%苯酚溶液，混匀，迅速加入3ml浓硫酸，混匀，置沸水浴反应20分钟。
显色后，冷却至室温，依据紫外-可见分光光度计标准操。
苯酚—硫酸法测多糖
苯酚-硫酸法测多糖
实验结果
CL菌株在发酵过程中并不产胞外多糖，可以断定 抗菌物质不是多糖。 但是利用 Bradford 法测蛋白质，发酵前后蛋白质 含量有明显变化，但是并不能断定抗菌物质是蛋 白质类，有可能是 CL菌株产的胞外蛋白酶类，使 蛋白质含量发生变化。为探索其物质可能还需要 进一步验证
实验步骤
苯酚—硫酸法测多糖
试剂：
（1）90%的苯酚溶液：
称取90克苯酚，加蒸馏水10ml，在室温下可保存数月
（2）9%苯酚溶液： 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水30ml，现配现用 （3）浓硫酸
实验步骤
苯酚—硫酸法测多糖
2ml（水、空白培养基、无菌发酵液）+1ml 9% 苯酚+5mFra bibliotek 浓硫酸 =8ml
恒温条件下，30min后测A485nm
实验步骤
Bradford法测蛋白
试剂：
Bradford储存液 100ml 95%乙醇 200ml 88%磷酸 350mg Serva G蓝 Bradford 工作液 425ml 双蒸水 15ml 95%乙醇 30ml 88%磷酸 30ml Bradford贮存液 Whatman 1号滤纸过滤，保温 与室温棕色瓶中，可使用数周， 但使用前需要过滤
2min测A595 1h内完成
室温下长期保持稳定
100µl蛋白质溶液+1ml 工作液
实验步骤
培养温度与初始pH对抑菌效果的影响:
1. 取 OD=0.4 的 CL 菌株 1ml 分别接入初始 pH 为 4.0 、 5.5 、 7.0 、 8.5 的 100ml 海水牛肉膏蛋白胨培养基 中，25℃ 170r/min振荡培养4d
实验结果
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1.目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2.方法原理糖在浓硫酸作用下,水解生成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚缩合成橙黄色化合物,且颜色稳定,在波长490 nm处和一定的浓度范围内,其吸光度与多糖含量呈线性关系正比,从而可以利用分光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量,本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3.主要实验仪器及材料浓硫酸,苯酚,蒸馏装置,分光光度计,电子天平,坐标纸或电脑等。
4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作,单糖到多糖的转换系数。
5.试剂配制1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液,摇匀后准确吸取10 mL该溶液,蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100ug/mL的葡萄糖标准液。
2)90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL,蒸馏水定容至100 mL,即得90%苯酚液,棕色瓶中避光保存3)6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%,即一体积储存液对应十四体积纯水,临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作,先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液,震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸,以不放热或微量放热为宜,摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处(490nm)测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标,从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2)待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解,定容至100 mL,取溶解后的溶液,按标准曲线中的测定方法,以样液为参比液,测定溶液的吸光值,按回归方程计算待测溶液的多糖浓度,注意乘换算系数。
测定多糖的方法
测定多糖的方法：蒽酮—硫酸法，苯酚—硫酸法，比色定量法，纸色谱法，离子交换色谱法，酶法，原子吸收法，HPLC法，DNS（还原法），磷钼比色法。
一、苯酚—硫酸法1、原理：糖在浓硫酸作用下脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物。
在10～100mg范围内其颜色与糖的含量成正比。
在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖和多糖的测定方法。
简单，灵敏度高，实验室基本不受蛋白住存在的干扰。
2、实验药品浓硫酸苯酚3苯酚溶液的配制（1）先配制80%苯酚溶液，然后称取80.0g苯酚加20.0g水，使之溶解，置于冰箱中，避光长期保存。
取80%苯酚37.5mL定容到500Ml.配制成60%的苯酚溶液，避光保存。
（2）取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏收集182℃馏分。
称取7.5g加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
二、蒽酮—硫酸显色法1、实验药品蒽酮硫酸2、溶液的配制称取蒽酮0.2g，加浓硫酸100mL混均即可（现用现配）三、高效液相色谱法多糖溶液进行高效液相色谱，利用TSK—GEL G4000PW柱.RI—10A示差折光检测器，以双蒸馏水为流动相，溶液浓度为0.5mg/Ml,进样量50μL，根据峰形判断样品的纯度。
四、DNS法为排除还原性单糖的干扰，可采用DNS（3,5—二硝基水杨酸）比色法测定还原糖的含量。
1、原理在碱性溶液中3,5—二硝基水杨酸与还原性糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系。
再将通过硫酸—苯酚，或者蒽酮—硫酸法得到的总糖结果减去还原糖，即得较准确的多糖含量。
五、地衣酚—硫酸法溶液的配制称取400mg地衣酚（3，5—二羟基甲苯）溶于155mL浓盐酸中，另加45mL含0.33%三氯化铁的0.01mol·mL_1盐酸，临用前配制。
苯酚—硫酸法和蒽酮—硫酸法的缺陷：首先葡萄糖是单糖而植物多糖的组成是多样的，只是用葡萄糖作为参照不确切，其次，显色试剂的不专属单糖的干扰严重，实际上测得的结果是总糖的结果。
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苯酚—硫酸法测定党参总糖
1．材料与方法
1．1 材料与试剂，仪器
1.1.1 材料、试剂
党参（肉党、普通纹党、产于中寨的纹党）；95％乙醇；苯酚；浓硫酸均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
FA-2400分析天平，101A型电热鼓风干燥箱，Mb型可调式电热板，电热恒温水浴锅，SK5200H超声清洗器，UV-9100紫外-可见分光光度计
1.2 方法
1.2.2 供试品溶液的制备
取党参粉末2g，置圆底烧瓶中，加95％乙醇3次（20.20.20ml）每次2h,过滤，蒸干乙醇，残渣用水溶解，在电热板上加热，提取3次（50.50.50ml）,每次2h，过滤，滤液置于50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度摇匀。
1.2.3 标准溶液的配制
精密称取105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖10mg置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度摇匀，得0.1mg／mL的储备溶液，备用。
1.2.3 5％苯酚溶液的制备
精确量取6.3ml 80％的苯酚溶液转移至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后置于棕色试剂瓶中，备用。
(实验室苯酚为师姐配好的80％的溶液，避光密封保存于冰箱中，用时水浴加热使其成为透亮的溶液)
1.2.4 标准曲线的制备
精确吸取葡萄糖标准液0、1、2、3、4、5、6 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，以蒸馏水补至 10 mL摇匀，依次吸取2ml加入试管中，加入苯酚液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，混匀，在室温放置30 min后，于波长490 nm处测定吸光度值。
以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
(10*10-2mg.ml*1/10=10*10-3mg.ml-1=10μg/ml.20.30.40.50.60)
1.2.5 样品的测定
准确吸取供试品溶液0.1 mL加水定容至10mL，精确吸取此稀释液2mL于试管中，按标准曲线制备的方法测定吸光度值，并根据回归方程，求得其浓度，计算样品中总糖的含量。
（党参溶液的浓度=2/50*0.1/10=1/2500g.ml-1=1/2.5 mg.ml-1=400μg.ml-1）
2 结果与分析
2.1 标准曲线
标准曲线回归方程建立用紫外分光光度计，在4 9 0 n m 的波
长处测定吸光度，以试剂空白参比实验。
结果见表1
标液体积
(ml)
0 2 4 6 8
标液多糖含
量(μg)
0 4 8 12 16
吸光度0 0.171 0.379 0.666 0.992
Y=0.062X-0.0542，r2=0.9826，以吸光度为纵坐标葡萄糖浓度为横坐
标绘制标准曲线见图
2.2 样品中多糖含量测定结果
按上述多糖含量测定方法测的样品的吸光度，并按标准曲线测得
的多糖含量占药材总量如下表。
肉党1 肉党2 纹党1 纹党2 中寨纹党1 中寨纹党2 吸光度0.362 0.487 0.622 0.579 0.874 0.624 占药材含量百分比
（％）
0.84 1.09 1.36 1.25 1.37 1.35
上图所得的标准曲线，线性不好，按此曲线药材中所得糖含量也
不高，并且当标准溶液液为10ml时，测不出吸光度，所以改变标液
浓度浓度，取葡萄糖标准液0、1、2、3、4、5、6 mL按上述方法重(ml)
0 1 2 3 4 5 6
标液多糖含量(μg) 0 2 4 6 8 10 12
吸光度0 0.198 0.567 0.802 1.002 1.391 1.579
Y=0.135X-0.0185，r2=0.9937，以吸光度为纵坐标葡萄糖浓度为横坐
标绘制标准曲线见图
样品中多糖含量测定结果
按上述多糖含量测定方法测的样品的吸光度，并按标准曲线测得
的多糖含量占药材总量如下表。
肉党1 肉党2 纹党1 纹党2 中寨纹党1 中寨纹党2 吸光度0.783 0.680 0.942 0.809 0.874 1.047
占药材含量百分比
（％）7.42 6.5 8.9 7.66 8.5 9.87。