IGH基因断裂检测试剂盒(荧光原位杂交法)

探针
观测值
目 预期值
点估计百分比
IGH 红色 240
240
100
IGH 绿色 240
240
100
探针
IGH 红色 IGH 绿色
表 2 特异性分析 具有预期荧光信号中期分裂相
非 特 异 性 杂 特异性杂中期细 预 期
交中期细胞
胞
值
0
120
120
0
120
120
灵敏度 点估计百分 比 100 100
【注意事项】 1、供体外检测使用。 2、本试剂盒实验操作过程中，需戴乳胶手套操作，避免试剂接触肌肤。如不
片）。
对于灵敏度评估，IGH 橙色和 IGH 绿色荧光探针的信号，计数每个间期分
裂相的染色体（正常为 2 个信号），每张片子计数 20 个中期细胞，每种探针的
预期信号值为 240（参见表 1）。对于特异性评估，具有预期荧光信号的中期分
裂相数目总共 120，（参见表 2）。
表 1 灵敏度分析
中期分裂相染色体荧光信号数 灵敏度
滤光片：建议客户处客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的 详细情况，以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组。
绿色荧光：激发波长为 496nm，发散波长为 520nm 橘红色荧光：激发波长为 551nm，发散波长为 572nm 【样本要求】 骨髓（2-3ml）或外周血（3-5ml），肝素钠抗凝，标本量依病人具体情况而 定，如再障的病人白细胞较少应加大采集。 标本保存及运输： 收集后 2 小时内处理，标本运送及保存建议 2-8℃，不超过 72h。 【检验方法】 一、样本收集： 1、取外周血或骨髓2～3ml（肝素钠抗凝）2000rpm离心5分钟，弃上清； 2、取1ml细胞加入10ml的0.075mol/L KCl 吹打混匀，静置2分钟； 3、恒温水浴锅37±1℃低渗20分钟； 4、加入固定液1ml，吹打混匀，室温欲固定10分钟； 5、吹打混匀，2000rpm离心5分钟； 6、弃上清，沉淀加入10ml固定液，吹打混匀，-20℃沉淀30分钟； 7、2000rpm离心5分钟，弃上清； 8、可重复以上洗涤步骤，直至细胞沉淀洗白洗干净为止（重复洗涤则无需静 置30分钟）。 二、 制片： 1、取一张干净的载玻片； 2、重悬细胞后取3μl，悬液滴加到载玻片上，室温下晾干； 3、用10×物镜在相差显微镜下观察细胞密度，要求细胞无重叠，且单视野细胞 数量在100～200个为宜； 3.1如果细胞密度及数目合适，继续步骤3 3.2如果细胞有重叠，则加入适当新鲜固定液稀释细胞悬浮 3.3如果细胞密度低，则2000rpm离心5分钟，小心吸去适量上清液，混匀后另 取3μl悬液制片，晾片，观察 4、在相差显微镜下观察，如果细胞碎片太多，则需要预处理并且选择合适的 杂交区域。 注意：每个病例至少要多制一张片子，细胞滴片刻放置于有无水乙醇的密闭容
核形态：细胞核的边界通常是清晰的，并且细胞核呈完整的形态； 背景状态：背景不应该含有影响计数的颗粒物质存在； 荧光信号强度：信号应该是亮的、明显的和易计算的。信号应该存在于亮 光、椭圆形的。避免过分分散的信号。 10、目标区域的荧光信号观察 使用 40×或 100×的物镜和适合的滤光片观察 IGH 信号。调节聚焦观察目标 信号和噪音（非目标杂交信号）的大小和形状。确保背景不具有强烈的荧光干 扰信号。 扫描整张片子，观察细胞的整体荧光信号分布状态，选择较具代表性的区 域进行计数。 12、在目标区域内选择细胞并计数 选择细胞核分布较好的区域（如能区分单个细胞核的区域），并保证所选的 区域能够代表观察到的信号分布特征；开始分析细胞并记录每个细胞的荧光信 号特征；重复上述操作，直到技计数满 100 个细胞为止； 13、信号计数规则 13.1 调节聚焦数深度，找到细胞核中的信号所在部位。对所选择的具有明显界 限的细胞进行分析。 13.2 以下情况细胞为阴性（IGH 基因非重排）： 细胞核存在两个融合信号，即红绿信号连在一起。 13.3 以下情况细胞为阳性（IGH 基因重排）：
体延伸区域，在所有 8 个中期分裂相，而且不会与其他位置杂交。
2 灵敏度和特异性
分析灵敏度定义为具有预期正常信号模式的染色体目标百分比。分析特异
性定义为结合到正确位置的信号百分比。
分析 IGH 橙色和 IGH 绿色荧光探针的特异性和分析灵敏度通过间期染色
体进行评价，从 5 个正常捐献者的外周血细胞培养物，共 6 分标本（6 个载玻
请联系显微镜制造商。
玻 片
标本制作前玻片 清洗不够干净
将玻片浸入无水乙醇中，滴片前用无绒纸巾擦干。
背
来自百度文库
确保洗脱液按说明书配制；
景
杂交后洗脱不充 确保按说明书操作；
过
分
确保洗脱液温度正确；
强
移去盖玻片，重复洗脱步骤。
问 可能的原因
题
推荐的解决方案
洗脱液使用时间 太长或不正确储 存
确保洗脱液2-8℃储存，配制7天后或者经常使用的洗脱液应丢弃。
在自然状态下可以观察到 IGH 基因区域会成为融合的红色和绿色信号。 反之，若 14q32 IGH 基因区域发生断裂：红色和绿色信号分开。
本试剂盒包含两组 IGH 探针 (红色/绿色）及 DAPI 复染液。
【储存条件及有效期】 IGH 基因扩增检测试剂盒于-20℃±3℃密封避光储存； 自生产之日起有效期为一年。
玻片，用指甲油涂抹盖玻片边缘，暗处-20℃孵育10-20 min。 7、镜检：于暗处保存切片。长期保存应放于-20℃，荧光显微镜下计数。 【结果阳性判断及参考区间】 结果分析注意事项： 1、样本需随机计数细胞。 2、计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。 3、杂交不均匀的区域不要分析。 4、细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。 5、背景深影响信号判断的区域不要分析。 6、计数结果需有两个参与人员独立完成，结果一致方可认定。 7、如果超过 25％的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析。 8、如果超过 10％的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。 9、首先判定玻片杂交的充分性
备注：当样本难处理时，如杂质过多、信号较弱等，可选择方法二进行玻 片预处理。 四、样品与探针探针变性、杂交（注意避光） 1、将探针取出后混匀离心，加10ul探针加到杂交区域，盖上盖玻片同时避免产 生气泡。 2、用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，注意封片完全以免杂交液挥发。 3、将玻片置于杂交仪上按照设定程序进行变性杂交。 五、杂交后洗涤（注意避光） 1、洗涤前30分钟，将配制好的洗液I置于水浴锅中，预热到72±1℃。 2、取出载玻片，去除橡皮胶，将载玻片置于室温的洗涤液II中孵育5min移去盖 玻片。 3、玻片放入72±1℃洗涤液I中处理2min； 4、取出玻片置于室温的洗涤液II中处理1min； 5、取出玻片后依次于在70%、85%的乙醇溶液中依次孵育切片2min。 6、DAPI染色、封片：滴加10μl DAPI复染液到切片组织上，避免气泡，盖上盖
锅中，使用前10分钟将0.1g胃蛋白酶用上述配制的胃蛋白酶溶液溶解后全部 加入50ml胃蛋白溶液中，混匀，使用一天后更换； 2、玻片放入37±1℃的1×PBS溶液中孵育5分钟； 3、取出玻片，再将其放入37±1℃胃蛋白酶溶液中消化1～5分钟（可通过预实 验确定酶效力）； 4、取出玻片，将其放入1×PBS室温洗涤2～3分钟 5、取出玻片，再将其放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟。 6、取出玻片，将其放入1×PBS室温洗涤2~3分钟 7、取出玻片，再将其放入70%、90%、100%梯度乙醇中各2分钟，取出玻片， 室温晾干
件不正确
玻片浸入洗脱液前移去盖玻片。
探针或标本玻片 储存不正确
确保探针-20℃避光保存； 将未杂交玻片干燥后置于-20℃长期保存或者室温短期保存； 将杂交后玻片置于-20℃避光保存。
观察时所选用的 滤片组不合适
使用正确滤片组观察探针荧光情况。 详情请咨询河南赛诺特生物技术有限公司技术支持部门。
显微镜构造及物 镜不适宜观察 FISH标本，或者 滤片组损伤
染
色
在标本制备阶段 降低烤片机温度，延长室温下玻片干燥时间，
体
玻片干燥过快
室温下老化至少24小时；勿在高温下烘烤玻片。
形
态
标本变性前未充
扭
分干燥
玻片变性前乙醇梯度脱水。
曲
移去盖玻片, 室温下将玻片置于洗脱液0.1NP/40/2×SSC中
复
复染过弱
浸泡5分钟。 将玻片依次置于70％、85％和100％的乙醇
至少有一组红色和绿色荧光信号分离。 【检测方法的局限性】
本试剂盒采用荧光原位杂交技术用于血液肿瘤中IGH基因重排检测，不 能用于其他基因突变方式的检测。
1/2
【产品性能指标】
1 细胞中期染色体探针定位
IGH 探针杂交的位置经过培养的淋巴细胞滴片与 DAPI 复染技术。
IGH 橙色和 IGH 绿色荧光探针，IGH 双色分离探针显示为与 14q32 染色
淋巴瘤，发生于50% B细胞NHL中和多种其他淋巴瘤类型中，易位类型复杂。 IGH与特定基因的相互易位有助于临床进行鉴别诊断及预后判断。如MYC/IGH 融合基因可用于辅助诊断伯基特淋巴瘤（BL）（75%发生率），且可用于指导高 分级B细胞淋巴瘤的治疗；BCL1/IGH融合基因发生于75%套细胞淋巴瘤中，可 用于辅助诊断此种肿瘤；BCL2/IGH融合基因发生于85%滤泡性淋巴瘤（FL） 及1/3的弥漫性淋巴瘤（DL）。
未添加探针
探针充分解冻，短暂离心，确保移液器吸取到探针试剂。
探针添加数量不 足
确保移液器吸取准确，探针加入量到达10ul， 请不要稀释探针； 使用前确保探针解冻充分并达到室温。
玻片干燥不充分 探针滴加至玻片前，确保玻片上的乙醇溶液已经完全挥发。
探针滴加后应立即将盖玻片覆盖目标区域；
探针干燥太快
进行洗脱时，一次只能移除一张玻片上的盖玻片；
【适用仪器】 本试剂盒探针杂交需在杂交仪上进行杂交，如 ThermoBrite。 本试剂盒探针需在荧光显微镜下观察并分析结果。所需荧光显微镜的配置
包括：物镜：在 FISH 分析上，使用 100×消色差浸油类型物镜可取得满意效 果。
镜油：在浸油式物镜上使用的镜油应为低水平自发荧光配方，并专门在 荧光显微镜上使用。
本试剂盒仅供科研使用。 【检验原理】
荧光原位杂交法（Fluorescent In Situ Hybridization，FISH）能 够使细胞中特定的核苷酸片段通过荧光而清楚的呈现，FISH 试验过 程中包含了双链 DNA 的解链，荧光标记的 DNA 探针能够与目标序 列结合 [2-3]。杂交完成之后，多余的探针被清洗掉，同时，细胞核被 复染剂 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色会发出蓝色的荧光。
无
并且在移除下一张之前立即将玻片浸入洗脱液中。
信
号
杂交时盖玻片下 放盖玻片时要覆盖探针表面，轻轻挤压以便挤出气泡。
或
有气泡形成
信
确保遵守杂交所规定的时间和温度；
号
杂交条件不合适 橡皮胶封片时勿留缝隙；
微
根据情况，调整杂交时间和湿度。
弱
确保按照产品说明书要求配制洗脱液； 洗脱液或洗脱条
确保洗脱液的温度达到洗脱步骤所规定温度；
器中，在-20℃±5可以保存12个月。剩余的细胞悬液可以在2～8℃保存一个月， 以后必要时，可重新制片。 三、 玻片预处理（以下两种处理方法均可） 方法一：快速处理 1、将滴好的玻片放置于室温的2×SSC溶液中浸泡2分钟； 2、然后依次在室温70%、90%、100%的乙醇中浸泡2分钟脱水； 3、最后取出玻片，室温晾干。 方法二：胃蛋白酶消化处理法 1、胃蛋白酶溶液配置：500μl 1M HCl，加入到50ml纯水中，置于37±1℃水浴
慎接触，立即用大量水冲洗。 3、实验过程中的废弃样本及实验废弃物，需作为医疗废物统一回收处理 4、为得到理想的结果，需确保试剂按照说明书正确配制，正确储存。 5、实验过程中的常见问题及处理方法(见下表)：
问 可能的原因
题
推荐的解决方案
标本及探针变性 不充分
确保玻片进行变性时温度在75±2℃； 将玻片变性时间延长2-4分钟。
IGH 基因断裂检测试剂盒（荧光原位杂交法） 说明书
【产品名称】 通用名称：IGH 基因断裂检测试剂盒（荧光原位杂交法） 英文名称：IGH Break Apart FISH Probe Kit
【包装规格】
10 人份/盒、20 人份/盒
【预期用途】 本产品用于定性检测血液肿瘤患者中IGH基因断裂情况。 免疫球蛋白重链（IGH）基因（14q32）发生断裂及易位常见于ALL/MM/