IGH基因断裂检测试剂盒(荧光原位杂交法)
基因断裂探针(荧光原位杂交法)免疫组化
基因断裂探针(fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种分子生物学技术，用于检测染色体或基因组中的特定序列。
它利用荧光标记的DNA或RNA探针与目标序列杂交，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的位置和强度，从而确定目标序列的存在和位置。
免疫组化(immunohistochemistry，IHC)是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。
它利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过染色或荧光标记来显示目标蛋白质的存在和位置。
基因断裂探针和免疫组化是两种不同的技术，它们在应用场景和原理上有所不同。
基因断裂探针主要用于检测染色体或基因组中的特定序列，而免疫组化主要用于检测组织或细胞中特定蛋白质的存在和位置。
淋巴瘤基因克隆性重排检测
Biomed-2研究项目
专注分子诊断 | 引领精准医学
Biomed-2研究项目（IGH为例）
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van Dongen, J. J. M., et al. (2003). Leukemia 17: 2257.
Biomed-2研究项目（IGH为例）
IGH, IGK, TRB , TRG IGHV
专注分子诊断 | 引领精准医学
IGHV SHM的检测
结合 Leader 和 FR1 区域的引物在 5’端连接有通用的测序片段，这种设计，配合 JH 反向测序引物，能 够实现 PCR 扩增产物的双向测序。目前，欧洲慢性淋巴细胞性白血病研究机构（European Research Initiative on CLL，ERIC）的指南即使用双向测序判断 IGH V区体细胞超突变（Somatic Hypermutation， SHM）状态。
中国CLL/SLL的诊断与治疗指南（2018版）
基于不同方法的产品系列-Invivoscribe
基于PCR检测技术，简便、快 速、成本较低，所需DNA量少， 对DNA质量要求不高。灵敏度 高于10%，需配制胶，安全清 洁性较差。
基于PCR-毛细管电泳检测技术， 敏感性高，检测周期较长，结 果更加直观可靠
IG或TCR基因的重排不一定是谱系的标志 特别是大多数前驱淋巴细胞性肿瘤中存在谱系交叉，如血管免疫母细胞学淋巴瘤（AITL）。单一发生 可反映谱系，同时阳性只表示克隆性增生，不能判断谱系来源。
假阳性和假阴性 技术，引物，反应条件
分子克隆性结果分析，应结合临床、形态学和免疫表型特征，方可做出淋巴瘤的最终诊断和分类。
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ALK基因断裂检测试剂盒(荧光原位杂交法)
正确
存（一般不超过两星期）；
将杂交后玻片置于-20℃避光保存。
观察时所选用的滤片组 不合适
使用正确滤片组观察探针荧光情况。 详情请咨询河南赛诺特生物技术有限公司技术服务部门。
FISH检测在血液肿瘤中的应用-临床宣讲
指导临床用药（个体化治疗）
各细胞遗传学亚组MM患者生存期(n=351)
24.7
42.3
50.5
Fonseca R. Blood 2003;101:4569-4575.
各细胞遗传学亚组MM患者生存期（n=159）
Fonseca R. Leukemia 2006;20,2034-2040.
（二）白血病FISH产品
样本DNA变性
FISH技术的特点
操作简便，探针标记后稳定，利于回顾性分析； 方法敏感，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测； 标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分
化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测。
FISH探针标记类型
telomere subtelomere
着色探针 着丝粒探针
111 32 79
114
133
Dö hner H, Engl J Med. 2000;43:1910-1916.
▶ 慢性粒细胞白血病（CML）
慢性粒细胞白血病（CML）检测BCR/ABL融合基因、ASS基因。
推荐样本：骨髓
适用人群： CML初诊及治疗监测的患者
BCR/ABL融合基因检测试剂盒
•探针：GLP BCR/GLP ABL
评估预后
CBFB基因断裂重组的AML患者对化疗敏感、预后较好。
▶ 急性淋巴细胞白血病(ALL)
• ALL主要是儿童疾病，75%发生在6岁以下的儿童。 • 我国l5岁以下小儿白血病的发病率为2.73/10万，ALL是儿 童中发病率最高的恶性肿瘤。
DF探针 只可检测是否有BCR/ABL融合基因，不能区分主、次 断裂点，可用于治疗效果监测及用药指导。
BCR/ABL融合基因检测意义
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
阳性对照目录号
阳性对照目录号目录号中文名称英文名称荧光颜色规格（人份）体积 (Ul) 价格（元）应用简述阳性对照目录号 FS49104-5 19q13/19p13 探针试剂（原位杂交法）19q13/19p13 FISH 橙/绿 5 50 3717 19q13/19p13区域缺失信号检测,用于神经胶质瘤的分层和预后评估 FS49104PFS49104-20 橙/绿 20 20__17702 FS49107-5 1p36/1q25 探针试剂（原位杂交法）1p36/1q25 FISH 橙/绿 5 50 3717 1p36/1q25区域缺失信号检测,用于神经胶质瘤的分层和预后评估 FS49107P FS49107-20 橙/绿 20 20__17702 FS47863-5 ALK 基因断裂探针试剂（原位交法）ALK D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3242 ALK基因分离信号检测,指导靶向药物治疗 FS47863P FS47863-20 橙/绿 20 20__15440 FS48416-5 BCL2 基因断裂探针试剂（原位杂交法）BCL2 D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3717 BCL2 基因分离信号检测,用于淋巴瘤的分类诊断及预后评估 FS48416PFS48416-20 橙/绿 20 20__17702 FS48415-5 BCL6 基因断裂探针试剂（原位杂交法）BCL6 D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3717 BCL6 基因分离信号颇,用于淋巴瘤的分类诊断及解评估 FS48415P FS48415-20 橙/绿 20 20__17702 FS48554-5 CCND1 （11q13 ）基因断裂探针试剂（原位杂交）CCND1 D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3717 CCND1 基因分离信号检测，可用于套细胞淋巴瘤、骨髓瘤的辅助诊断FS48554P FS48554-20 橙/绿 20 20__17702 FS49106-5 DDIT3 基因断裂探针试剂（原位杂交法）DDIT3 D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3717 DDIT3 基因分离信号检测，用于粘液性脂肪肉瘤的辅助诊断 FS47861PFS49106-20 橙/绿 20 20__17702 FS48042-20 EBER 探针（原位杂交法）EBV ISH (for automation) DAB 20 20__1850 CISH 探针，肿瘤等病变组织中 EB 病毒核酸的检测FS49106P FS48042-50 DAB 50 500 4550 FS48042-100 DAB 100 1000 9050 FS48042-300 DAB 300 3000 27150 FS48042-900 DAB 900 5000 81450目录号中文名称英文名称荧光颜色规格（人体积 (Ul) 价格（元）应用简述阳性对照目录号 FS49301-5 EGFR 基因扩增探针试剂（原位杂交法）EGFR FISH 橙/绿 5 50 3717 EGFR 基因扩增检测，用于实体瘤（包括非小细胞肺癌、神经胶质母细胞瘤、头颈癌、食道癌、宫颈癌等）的预后评估及评估 TKI 的治疗适应症 FS48042PFS49301-20 橙/绿 20 20__17702 FS48161-5 EWSR1 基因断裂探针试剂（原位杂交法）EWSR1 D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3717 EWSR1 基因分离信号检测,用于尤文氏肉瘤的辅助诊断 FS49301P FS48161-20 橙/绿 20 20__17702 FS49105-5 FUS 基因断裂探针试剂（原位杂交法）FUS D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3717 FUS 基因分离信号检测，用于粘液性脂肪肉瘤，粘液性纤维肉瘤，血管瘤样纤维组织细胞瘤，低度恶性纤维粘液肉瘤以及，急性髓系白血病的辅助FS48161P FS49105-20 橙/绿 20 20__17702 FS47862-5 HER2 基因扩增探针试剂（原位杂交法）HER2 FISH 橙/绿 5 50 3242 HER-2 基因扩增钢，指导靶向药物治疗 FS49105P FS47862-20 橙/绿 20 20__15440 FS48417-5 IGH 基因断裂探针试剂（原位杂交法）IGH D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3717 IGH 基因分离信号检测,用于淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、骨髓瘤的辅助诊断 FS48417P FS48417-20 橙/绿 20 20__17702 FS47893-20 Kappa 链探针试剂（原位杂交法）Kappa ISH (for automation) DAB 20 20__1850 CISH 探针,淋巴瘤克隆性增生和反应性增生的鉴别FS47893P FS47893-50 DAB 50 500 4550 FS47893-100 DAB 100 1000 9050 FS47894-20 Lambda 链探针试剂（原位杂交法）Lambda ISH (for automation) DAB 20 20__1850 FS47894P FS47894-50 DAB 50 500 4550 FS47894-100 DAB 100 1000 9050 FS49371-5 MALT1 基因断裂探针试剂（原位杂交法）MALT1 D/C Break Apart FISH 橙/绿 5 50 3717 MALT1 基因分离信号检测,用于粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的辅助诊断及治疗方案的评估。
荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的专家共识
荧光原位杂交技术（FISH）在产前诊断中的应用一直备受关注。
近年来，随着该技术在临床实践中的不断深入和发展，专家共识也逐渐形成。
在本文中，将从深度和广度上对荧光原位杂交技术在产前诊断中的专家共识进行全面评估，并撰写一篇有价值的文章，以便读者能更深入地理解这一领域的最新进展和专家观点。
1. 荧光原位杂交技术概述- 荧光原位杂交技术是一种基于DNA的细胞遗传学技术，能够定位和检测细胞中特定DNA序列的存在和定位。
该技术通过使用标记了荧光物质的探针，使得特定的DNA序列在细胞或组织的显微镜下呈现出荧光信号，从而实现对细胞遗传信息的定量和定位检测。
在产前诊断中，荧光原位杂交技术能够用于检测胎儿染色体异常、基因突变等遗传性疾病，具有高灵敏度和特异性的优势。
2. 专家共识的形成- 随着荧光原位杂交技术在产前诊断中的广泛应用，越来越多的专家学者参与其中，并在临床实践和科研工作中积累了大量的经验和数据。
通过学术会议、专家讨论会、文献研究等形式，专家们逐渐达成了对荧光原位杂交技术在产前诊断中应用的共识。
这些共识涵盖了该技术的临床适应症、操作规范、质控要求、结果解读等方面，为该领域的规范化和标准化提供了重要指导。
3. 专家共识的内容和意义- 在产前诊断中，荧光原位杂交技术的专家共识主要包括对该技术的临床应用范围和标准化操作流程的制定。
专家们一致认为，该技术在胎儿染色体异常、染色体结构异常、基因突变等方面具有重要应用意义，可以为胎儿遗传疾病的早期筛查和诊断提供可靠依据。
专家共识还对该技术的样本采集、实验操作、结果解读等方面提出了具体要求，以确保临床应用的准确性和可重复性。
4. 个人观点和理解- 就我个人来说，我认为荧光原位杂交技术在产前诊断中的应用具有重要的临床意义和发展前景。
通过该技术，我们可以更准确地了解胎儿遗传信息，及时发现和诊断潜在的遗传疾病，为家庭和社会减少遗传疾病的发病率和负担提供了可能。
专家共识的形成也为该技术在临床实践中的标准化和规范化提供了重要支持，有助于推动该领域的进一步发展和应用。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的应用 ppt课件
Blue单通道
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
二、常用探针种类
• 单色探针(single color probe, SC) • 双色探针(dual color probe, DC) • 三色探针(triple color probe, TC) • 双色分离探针(dual color, break apart probe. DC,BCR) • 双色单融合探针(dual color, single fusion. DC, SF
CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、 复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等 风险GIST中无扩增，其表达与GIST有预后相关性。
MDM2基因扩增宣GIST患者有预后相关性。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
前列腺癌
• 探针：PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG
套细胞淋巴瘤
• 探针：CCND1/IGH（双色双分离探针）
CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32。 CCND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达，可促进细胞 增生。
• CCND1/IGH融合基因检测意义
CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，FISH探 针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96%。
• 检测意义：
PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。 FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重 要过程。 没有ERG基因改变的前列腺癌患者8年生存期达90%。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
神经母细胞瘤、神经胶质瘤
• 探针：1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11
• MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应用
荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应⽤我接触“FISH”也是刚刚两年多的时间，作为⼀个“初学者”刚开始接触“FISH”可能跟⼤多数⼈⼀样满脑⼦的疑惑：“FISH”是做什么的?有什么临床作⽤呢?那些红红绿绿的点都是些什么意思?……今天让我们慢慢的去揭开FISH的不太神秘的⾯纱。
1.FISH的前世今⽣在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交⽅法，检测间期染⾊体和分裂期染⾊体上特定DNA和RNA序列的⽅法，该⽅法存在操做⽐较⿇烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较⾼等问题，故⽬前弃之不⽤。
20世纪80年代⽤⾮放射性半抗原如⽣物素进⾏核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使⽤这种⾮放射性标记⽅法。
随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应⽤于分析细胞分裂期染⾊体铺⽚的DNA序列。
相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、⼲扰信号少、⼀张玻⽚可以标记多种颜⾊探针等优点。
这些优点逐渐使FISH成为⼀种研究分⼦细胞遗传学很好的⽅法。
FISH即染⾊体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从⽽获得细胞核内染⾊体或基因状态的信息。
FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了⼀门新的学科——分⼦细胞遗传学。
（如下图所⽰)2.FISH信号解读-红红绿绿是什么⽬前临床上⽤于FISH检测的探针的荧光素⼤都是绿⾊的和橙红⾊标记，可⼤致分为：染⾊体计数(着丝粒)探针(centromere-enumerationprobes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes，LSI)，染⾊体涂染(paint，WCP)探针。
其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在⾎液病诊断与预后分型中最为常⽤。
常见血液肿瘤FISH检测小册
常见血液肿瘤FISH检测小册一.FISH是什么FISH即荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization），是在细胞遗传学水平上检测染色体及基因数目和结构异常的一种分子病理检测技术.其基本原理是利用标记了荧光素的核酸作为探针，按照碱基互补原则，与待检样本中与之互补的核酸经过变性-退火而形成杂交双链核酸,然后通过荧光显微镜进行检测和分析。
FISH技术具有直观、快速、敏感性高和方便灵活等特点，目前已经广泛应用于临床的肿瘤遗传学及各种基因相关疾病的分型与个体化治疗等多个领域。
二。
血液肿瘤的诊断分型MICM：血液肿瘤诊断的精确分型是临床选择正确治疗方案的前提，目前国际上通用的是结合细胞形态学（Morphology）、免疫学(Immunology）、细胞遗传学(Cytogenetics）和分子生物学(Molecular）的MICM分型。
●形态学诊断(Morphology)细胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴结穿刺组织学：骨髓、淋巴结活检●免疫学检查(Immunology）免疫组化（IHC），流式细胞（FCM）●细胞遗传学检查(Cytogenetics)核型分析，荧光原位杂交（FISH）●分子生物学检查（Molecular)PCR,DNA测序三.FISH技术的作用及优势FISH作为一项很重要的分子遗传学检测技术，在血液肿瘤的诊断中有很大的作用，得到了NCCN等国内外各大血液肿瘤诊疗指南的认可和建议。
目前与血液肿瘤相关的FISH探针有接近100种，常用的就有60种左右,包括急慢性白血病、骨髓增生异常综合症(MDS）、多发性骨髓瘤（MM）、淋巴瘤等多种血液肿瘤.FISH技术的相对优势:●FISH技术更敏感，可检测出核型分析检测不出的细微缺失或易位，如MDS中的5q缺失综合征；●FISH技术不需要中期分裂相细胞，而核型分析需要培养时间较长且需要较高的操作要求；●FISH技术是在细胞形态的基础上进行结果判读，可有效地降低假阴性或假阳性的风险，而PCR技术经过倍增扩增，不能在形态的基础上判读，对实验要求高，易产生假阴性或假阳性。
荧光原位杂交技术在病理学中的应用
HER-2基因
• • • • 属于表皮生长因子(EGFR)家族 位点：17q11.2-q12 编码蛋白：跨膜蛋白（与表皮生长因子受体部分同源） 25-30％乳腺癌病人都有HER-2基因的扩增
EGF
Her-2结构
ATP
TK
HER-2基因检测意义
• • • • 分子靶向治疗：赫赛汀 指导化疗方案的选择 预后判断及风险预测 指导分子分型
PML/RAR
• PML基因：早幼粒细胞白血病基因。 • RAR基因：维甲酸受体基因。 • PML-RAR融合基因：抑制野生型RARa的正常功能，阻断 细胞分化，细胞发生持续增殖。 • PML/RAR融合基因主要见于M3型白血病中，可见于90％ 以上的APL（急性早幼粒细胞白血病）中，成为APL的一个 特异标志。 • 评估治疗方案：全反式维甲酸诱导缓解治疗的分子证据， 缓解率能达90%
Press et al. (1997) JCO: 2009 May;18(5):1386-13899.
指导分子分型
• Luminal型:分子表达ER+和/或PR+ • HER-2+型:分子表达为ER-/PR-/HER-2+ • Basal-like型:分子表达为ER-/PR-/HER-2-
乳腺癌的分子分型对于乳腺癌风险的预测和治疗方法的选择具有重要意义
指导化疗方案
• • • •
内分泌治疗 ：HER2阳性患者相对耐药 CMF方案： HER2阳性患者相对耐药 蒽环类：对大剂量蒽环类相对敏感 紫杉类药物：相对敏感
预后判断及风险预测
• HER-2基因扩增提示乳腺癌病人预后较差 • HER-2基因的预测乳腺导管原位癌（DCIS）
Slamon et al. (1987) Science:
淋巴结边缘区淋巴瘤的临床特点
淋巴结边缘区淋巴瘤的临床特点杨申淼;石红霞;刘艳荣;黄晓军;江倩;江滨;陈定宝;王婧;江浩;路瑾;卢锡京;鲍立【摘要】目的研究淋巴结边缘区淋巴瘤（NMZL）的临床特点。
方法回顾性分析了14例经淋巴结活检确诊为NMZL患者的临床资料。
结果14例患者中13例（92.9%）就诊时外周血细胞计数异常：6例（42.9%）白细胞（ WBC）＞10.0×109/L ；4例白细胞（28.6%）＜4.0×109/L；7例（50%）淋巴细胞比例＞50%，绝对值＞5.0×109/L；10例（71.4%）血红蛋白＜120g/L；6例（42.9%）血小板＜100×109/L。
2系血细胞减少4例（28.6%），全血细胞减少2例（14.3%）。
10例（71.4%）患者骨髓受累，其中5例（50%）存在单克隆轻链限制型B细胞。
外周血淋巴细胞百分比与骨髓NMZL细胞百分比正相关（r＝0.811，P＝0.008）。
免疫球蛋白升高的检出率为100%（12/12），其中单克隆免疫球蛋白升高者10例（10/12，83.3%）。
≥1种自身抗体阳性8例（8/11，72.7%）。
14例患者Ann Arbor分期均在Ⅲ或Ⅳ期。
免疫化疗作为初始治疗10例；利妥昔单抗单药治疗1例；单纯化疗治疗2例；干扰素治疗1例。
完全缓解8例（57.1%），部分缓解3例（21.4%）。
中位随访23个月，2年总体生存（OS）率为84.6%，2年无疾病进展生存（PFS）率为71.4%，预期的中位总体生存时间90个月，预期的中位无疾病进展生存时间为39个月。
结论Ⅲ/Ⅳ期NMZL患者血细胞计数异常、骨髓侵犯、免疫异常多见，外周血淋巴细胞增多可能提示NMZL骨髓浸润。
%Objective To investigate the clinical characteristics of nodal marginal zone lymphoma (NMZL). Methods Data of 14 NMZL patients diagnosed by lymph nodes histological examination were retrospectively analyzed. Results Among the 14 patients, 13(92.9%) had abnormal complete blood counts(CBC). Leukocytosis [white bloodcells(WBC)≥10.0×109/L] was observed in 6 patients (42.9%); leukocytopenia (WBC<4.0×109/L) in 4 patients(28.6%); absolute lymphocyte counts>5.0×109/L in 7 patients (50%);hemoglobin concentration<120g/L in 10 patients(71.4%),thrombocytopenia(platelet<100×109/L) in 6 patients(42.9%); cytopenia in more than 2 lineages in 4 patients (28.6%);pancytopenia in 2 cases(14.3%). Ten patients(71.4%) had bone marrow involvement. Among them, monoclonal B cells with a light chain restriction was found in 5 patients (50%). Percentage of lymphocytes in peripheral blood correlated positively with percentage of NMZL cells in bone marrow(r=0.811,P=0.008). Hyperimmunoglobulinemia was found in all patients (12/12, 100%). Among them, serum monoclonal paraprotein was found in 10patients(10/12, 83.3%). At least one auto-antibody positivity was found in8 out of 11 patients (72.7%). All of 14 patients had Ann Arbor stage Ⅲ or Ⅳ. Immunochemotherapy was admini stered in 10 patients. Rituximab was given as a single agent to 1 patient. Chemotherapy was given to 2 patients, and interferon alpha was given to 1 patient. Complete response was achieved in 8 patients (57.1%), and partial response in 3 patients (21.4%). Median duration of follow-up was 23 months. Accumulated 2-year overall survival (OS) rate and 2-year progression-free survival (PFS) rate were 84.6% and 71.4%, respectively. Estimated median OS and PFS were 90 and 39 months, respectively. Conclusion NMZL p atients at stage Ⅲ/Ⅳ have high a incidence of CBC abnormality, bone marrow involvement andautoimmunologic abnormality. Peripheral blood lymphocytosis might indicate NMZL bone marrow involvement.【期刊名称】《中华老年多器官疾病杂志》【年(卷),期】2013(000)008【总页数】6页(P575-580)【关键词】淋巴瘤;骨髓检查;自身免疫【作者】杨申淼;石红霞;刘艳荣;黄晓军;江倩;江滨;陈定宝;王婧;江浩;路瑾;卢锡京;鲍立【作者单位】北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院病理科，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044;北京大学人民医院血液病研究所，北京 100044【正文语种】中文【中图分类】R733.41淋巴结边缘区淋巴瘤（nodal marginal zone lymphoma，NMZL）是起源于记忆性B细胞的淋巴瘤。
igh重排检测方法
IGH重排是指免疫球蛋白重链基因（immunoglobulin heavy chain gene）发生基因重组的过程。
为了检测IGH重排，可以采用以下方法：
PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种常用的方法，可以对DNA进行扩增。
使用特定的引物，可以扩增IGH重排区域的DNA序列。
通过PCR扩增的结果可以观察到重排后的DNA片段。
环境极性PCR（inverse PCR）：环境极性PCR是一种特殊的PCR方法，用于检测未知重排位点。
它首先对DNA进行酶切，然后反应体系中加入特定的引物，扩增重排区域的DNA序列。
最后，通过测序分析扩增产物，可以确定重排位点。
双链断裂检测（double-strand breaks assay）：IGH重排过程中，DNA链会发生断裂，然后再通过基因重组形成新的DNA序列。
双链断裂检测可以通过检测重排过程中的DNA断裂来间接地确定IGH重排。
免疫组织化学染色（immunohistochemistry）：免疫组织化学染色可以检测免疫球蛋白重链蛋白的表达情况。
通过染色的结果可以观察到是否发生了IGH重排。
以上是常用的IGH重排检测方法，不同的方法有其优劣性，并且也可以根据具体实验目的进行选择。
荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用
荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用目的了解多发性骨髓瘤常见染色体异常情况，探讨其与临床分期及免疫学分型的关系。
方法对39例多发性骨髓瘤初诊患者进行1q21、RBl、D13S319、p53及IGH 5种基因探针荧光原位杂交检测1q21扩增、13q14缺失、p53缺失以及IGH基因重排的发生率，统计分析染色体异常情况与临床分期及免疫学分型的关系。
结果1q21、RBl、D13S319、p53及IGH探针的阳性阈值分别为：7.2%、8.7%、7.9%、7.2%和9.8%。
39例患者中，1q21扩增24例（61.5%）；13q14缺失18例（46.2%），其中同时检出D13S319和RBl缺失15例；p53缺失8例（20.5%）；IGH基因重排13例（33.3%）。
除IGH重排与D-S分期之间（r=0.434，P=0.007）、p53缺失与IIS分期之间（r=-0.448，P=0.006）和D13S319缺失与免疫学分型之间（r=-0.335，P=0.040）呈显著相关性外，其余染色体异常与临床分期和免疫学分型均无相关性。
结论1q21扩增、13q14缺失、p53基因缺失及IGH 重排是多发性骨髓瘤常见的核型异常，FISH 检测技术有助于探索染色体异常与多发性骨髓瘤发展及预后的关系。
[Abstract] Objective To investigate the familiar genetic abnormality in MM patients and its relationship with clinical features and immunological types. Methods In 39 cases of MM,the incidence of lq21 amplification,13q14 deletion,p53 gene deletion and 14q32 rearrangement were detected with the five sequence-specific DNA probes(lq21,RBl,D13S319,p53 and IGH）by FISH,and the correlations between these chromosome abnormality to clinical states and immunological types were analyzed. Results The threshold value of lq21,RBl,D13S319,p53 and IGH were 7.2%,8.7%,7.9%,7.2% and 9.8% respectively. In 39 cases of MM,24 cases(61.5%)showed lq21 amplification;18 cases(46.2%)showed 13q14 deletion,while 15 cases were deletion of both RB1 and D13S319;8 cases(20.5%)showed p53 gene deletion;13 cases(33.3%)showed IGH gene rearrangement. There was no correlation except between the IGH rearrangement with D-S states(r=0.434,P=0.007),or between the deletion of p53 with IIS states(r=-0.448,P=0.006),or between the D13S319 deletion with immunological types(r=-0.335,P=0.040). Conclusion The familiar genetic abnormality of MM include lq21 amplification,13q14 deletion,p53 gene deletion and IGH gene rearrangement,and FISH is a helpful technique to explore the relationship between chromosome aberrations with development and prognosis.[Key words] Multiple myeloma;Fluorescence in situ hybridization;Chromosome aberration多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以骨髓中克隆性浆细胞恶性增殖和异常积累为特征的肿瘤，约占血液肿瘤的10%。
100例多发性骨髓瘤患者荧光原位杂交结果汇总分析
100例多发性骨髓瘤患者荧光原位杂交结果汇总分析胡斌;刘林湘;陈丹丹【摘要】目的探讨荧光原位杂交(FISH)技术检测在多发性骨髓(MM)诊断和治疗中的作用及临床意义.方法应用FISH技术,采用特异性探针(RB1、P53、D13S319、IGH及Iq21),对100例初诊MM患者进行检测,分析其染色体异常情况,与患者的临床指标进行相关性分析.结果FISH技术检测100例初诊MM患者中60例(60％)基因异常,其中IGH重排42例(42％),Iq21扩增32例(32％),RB1缺失23例(23％),D13S319缺失21例(21％),P53缺失5例(5％).各基因异常结果与临床指标相关性分析如下:IGH基因重排与骨髓内浆细胞水平(＞30％)、ISS分期存在相关性;del(13q)与ISS分期、骨髓浆细胞水平(＞30％)及β2-微球蛋白水平(β2-MG)水平存在相关性;Iq21扩增与β2-MG、ISS分期存在相关性;P53缺失检出率最低,预后可能较差.MM患者存在染色体异常的主要以IgG型和Ⅲ期为主.结论 MM最常见的基因异常是IGH基因重排以及Iq21扩增,其次是RB1和D13S319缺失,P53缺失最少.Ⅲ期和IgG型患者出现染色体异常的可能性更高.FISH的检出率要优于染色体常规核型分析(CC)技术,FISH联合CC可作为MM患者的常规检查,指导临床治疗.【期刊名称】《河南医学研究》【年(卷),期】2017(026)017【总页数】3页(P3075-3077)【关键词】多发性骨髓瘤;染色体;荧光原位杂交;基因异常【作者】胡斌;刘林湘;陈丹丹【作者单位】郑州大学第一附属医院血液科河南郑州450000;郑州大学第一附属医院血液科河南郑州450000;郑州大学第一附属医院血液科河南郑州450000【正文语种】中文【中图分类】R733.3多发性骨髓(multiple myeloma，MM)是一种中老年常见的骨髓浆细胞克隆增生性恶性肿瘤，其生存期变化很大，短者不足1 a，长者可存活10 a以上，这些显著差异表明影响MM的预后因素较为复杂。
荧光原位杂交FISH技术---经典全面
FITC/594 Avdin TSA-Biotin 放大系统
过氧化物酶（POD）/ 磷酸酶（AP）
连接臂
地高辛标记探针
探针制备流程
RNA抽提
反转cDNA
质粒合成
带有T7、SP6序列及 目的基因的质粒
扩增目的基因
设计带有T7/SP6/T3 序列的引物
线性化 体外转录 地高辛标记探针合成反应
荧光原位杂交技术新进展
M-FISH，armFISH(42-color M-FISH), SKY BAC-FISH, YAC-FISH Fiber-FISH PRINS ( Primed in situ DNA synthesis)引物原位DNA 合成
技术 IS-PCR (in situ polymerase chain reaction) 原位PCR GISH(Genome in situ Hybridization)基因组原位杂交 Immuno-FISH 3D-FISH Q-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISH T-FISH（Tissue-FISH）or (Telomere-FISH) RNA-FISH
基因组原位杂交（GISH）
RNA-FISH
T-FISH
蚕豆
红小豆
黄豆
豇豆
绿豆
水 稻
小 麦
玉 米
欢迎大家批评指正!!
荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术
一、技术原理 二、操作步骤 三、技术应用 四、技术进展
技术原理
原位杂交技术in situ hybridization(ISH)：通过 已知的碱基序列并带有标记物的探针与组织、细胞 中待测的mRNA进行特异性结合，形成杂交体，然 后再运用与标记物相应的检测系统，在核酸的原有 位置对其进行定位的方法。
IGH基因断裂检测试剂盒(荧光原位杂交法)
器中，在-20℃±5可以保存12个月。剩余的细胞悬液可以在2～8℃保存一个月， 以后必要时，可重新制片。 三、 玻片预处理（以下两种处理方法均可） 方法一：快速处理 1、将滴好的玻片放置于室温的2×SSC溶液中浸泡2分钟； 2、然后依次在室温70%、90%、100%的乙醇中浸泡2分钟脱水； 3、最后取出玻片，室温晾干。 方法二：胃蛋白酶消化处理法 1、胃蛋白酶溶液配置：500μl 1M HCl，加入到50ml纯水中，置于37±1℃水浴
【包装规格】
10 人份/盒、20 人份/盒
【预期用途】 本产品用于定性检测血液肿瘤患者中IGH基因断裂情况。 免疫球蛋白重链（IGH）基因（14q32）发生断裂及易位常见于ALL/MM/
淋巴瘤，发生于50% B细胞NHL中和多种其他淋巴瘤类型中，易位类型复杂。 IGH与特定基因的相互易位有助于临床进行鉴别诊断及预后判断。如MYC/IGH 融合基因可用于辅助诊断伯基特淋巴瘤（BL）（75%发生率），且可用于指导高 分级B细胞淋巴瘤的治疗；BCL1/IGH融合基因发生于75%套细胞淋巴瘤中，可 用于辅助诊断此种肿瘤；BCL2/IGH融合基因发生于85%滤泡性淋巴瘤（FL） 及1/3的弥漫性淋巴瘤（DL）。
荧光原位杂交FISH试剂盒
荧光原位杂交（FISH）试剂盒说明书荧光原位杂交（FISH）试剂盒说明书一、 检测原理荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization)，简称为FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。
它的基本原理是：用已知的荧光素标记单链核酸为探针，按照碱基互补配对原则，与待检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA特异结合，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
随后在荧光显微镜下对待测DNA 进行定性、定量或相对定位分析。
二、 组分和保存条件成分容量（50 tests）储存二甲苯10ml 室温20×SSC 10ml 室温蛋白酶K 20ul -20℃杂交缓冲液8ml 室温去离子甲酰胺14ml 室温DEPC水5ml -20℃DAPI 25ul -20℃目的基因探针2OD -20℃阳性对照探针2OD -20℃阴性对照探针2OD -20℃注意：1.20×SSC用一级纯水稀释成2×SSC使用。
2.二甲苯、去离子甲酰胺在通风橱使用。
3.蛋白酶K用2×SSC按照1:1000稀释。
4.探针应避光稀释并保存，且实验过程中加入探针后的操作应在避光条件下进行。
5.DAPI用PBS 按照1:1000稀释，需避光保存和使用。
三、 实验方法1. 脱蜡：1）石蜡切片在60ºC烤箱中预热30 min；2）每张切片滴加二甲苯100ul中60ºC放置20min；3）在梯度酒精中（100%、95%、90%、80%）室温孵育各10min。
2. 蛋白酶处理：1）蛋白酶K溶液预热至37ºC；2）每张切片滴加蛋白酶K溶液100ul，37ºC孵育20min；3）每张切片滴加2×SSC溶液100ul在室温下洗切片3次，每次1min；4）梯度酒精70%、80%、90%、100%（-20 ºC预冷）脱水，每次2min，空气中干燥。
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体延伸区域，在所有 8 个中期分裂相，而且不会与其他位置杂交。
2 灵敏度和特异性
分析灵敏度定义为具有预期正常信号模式的染色体目标百分比。分析特异
性定义为结合到正确位置的信号百分比。
分析 IGH 橙色和 IGH 绿色荧光探针的特异性和分析灵敏度通过间期染色
体进行评价，从 5 个正常捐献者的外周血细胞培养物，共 6 分标本（6 个载玻
件不正确
玻片浸入洗脱液前移去盖玻片。
探针或标本玻片 储存不正确
确保探针-20℃避光保存； 将未杂交玻片干燥后置于-20℃长期保存或者室温短期保存； 将杂交后玻片置于-20℃避光保存。
观察时所选用的 滤片组不合适
使用正确滤片组观察探针荧光情况。 详情请咨询河南赛诺特生物技术有限公司技术支持部门。
显微镜构造及物 镜不适宜观察 FISH标本，或者 滤片组损伤
无
并且在移除下一张之前立即将玻片浸入洗脱液中。
信
号
杂交时盖玻片下 放盖玻片时要覆盖探针表面，轻轻挤压以便挤出气泡。
或
有气泡形成
信
确保遵守杂交所规定的时间和温度；
号
杂交条件不合适 橡皮胶封片时勿留缝隙；
微
根据情况，调整杂交时间和湿度。
弱
确保按照产品说明书要求配制洗脱液； 洗脱液或洗脱条
确保洗脱液的温度达到洗脱步骤所规定温度；
备注：当样本难处理时，如杂质过多、信号较弱等，可选择方法二进行玻 片预处理。 四、样品与探针探针变性、杂交（注意避光） 1、将探针取出后混匀离心，加10ul探针加到杂交区域，盖上盖玻片同时避免产 生气泡。 2、用橡皮胶沿盖玻片边缘封片，注意封片完全以免杂交液挥发。 3、将玻片置于杂交仪上按照设定程序进行变性杂交。 五、杂交后洗涤（注意避光） 1、洗涤前30分钟，将配制好的洗液I置于水浴锅中，预热到72±1℃。 2、取出载玻片，去除橡皮胶，将载玻片置于室温的洗涤液II中孵育5min移去盖 玻片。 3、玻片放入72±1℃洗涤液I中处理2min； 4、取出玻片置于室温的洗涤液II中处理1min； 5、取出玻片后依次于在70%、85%的乙醇溶液中依次孵育切片2min。 6、DAPI染色、封片：滴加10μl DAPI复染液到切片组织上，避免气泡，盖上盖
玻片，用指甲油涂抹盖玻片边缘，暗处-20℃孵育10-20 min。 7、镜检：于暗处保存切片。长期保存应放于-20℃，荧光显微镜下计数。 【结果阳性判断及参考区间】 结果分析注意事项： 1、样本需随机计数细胞。 2、计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。 3、杂交不均匀的区域不要分析。 4、细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。 5、背景深影响信号判断的区域不要分析。 6、计数结果需有两个参与人员独立完成，结果一致方可认定。 7、如果超过 25％的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析。 8、如果超过 10％的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。 9、首先判定玻片杂交的充分性
核形态：细胞核的边界通常是清晰的，并且细胞核呈完整的形态； 背景状态：背景不应该含有影响计数的颗粒物质存在； 荧光信号强度：信号应该是亮的、明显的和易计算的。信号应该存在于亮 光、椭圆形的。避免过分分散的信号。 10、目标区域的荧光信号观察 使用 40×或 100×的物镜和适合的滤光片观察 IGH 信号。调节聚焦观察目标 信号和噪音（非目标杂交信号）的大小和形状。确保背景不具有强烈的荧光干 扰信号。 扫描整张片子，观察细胞的整体荧光信号分布状态，选择较具代表性的区 域进行计数。 12、在目标区域内选择细胞并计数 选择细胞核分布较好的区域（如能区分单个细胞核的区域），并保证所选的 区域能够代表观察到的信号分布特征；开始分析细胞并记录每个细胞的荧光信 号特征；重复上述操作，直到技计数满 100 个细胞为止； 13、信号计数规则 13.1 调节聚焦数深度，找到细胞核中的信号所在部位。对所选择的具有明显界 限的细胞进行分析。 13.2 以下情况细胞为阴性（IGH 基因非重排）： 细胞核存在两个融合信号，即红绿信号连在一起。 13.3 以下情况细胞为阳性（IGH 基因重排）：
未添加探针
探针充分解冻，短暂离心，确保移液器吸取到探针试剂。
探针添加数量不 足
确保移液器吸取准确，探针加入量到达10ul， 请不要稀释探针； 使用前确保探针解冻充分并达到室温。
玻片干燥不充分 探针滴加至玻片前，确保玻片上的乙醇溶液已经完全挥发。
探针滴加后应立即将盖玻片覆盖目标区域；
探针干燥太快
进行洗脱时，一次只能移除一张玻片上的盖玻片；
锅中，使用前10分钟将0.1g胃蛋白酶用上述配制的胃蛋白酶溶液溶解后全部 加入50ml胃蛋白溶液中，混匀，使用一天后更换； 2、玻片放入37±1℃的1×PBS溶液中孵育5分钟； 3、取出玻片，再将其放入37±1℃胃蛋白酶溶液中消化1～5分钟（可通过预实 验确定酶效力）； 4、取出玻片，将其放入1×PBS室温洗涤2～3分钟 5、取出玻片，再将其放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟。 6、取出玻片，将其放入1×PBS室温洗涤2~3分钟 7、取出玻片，再将其放入70%、90%、100%梯度乙醇中各2分钟，取出玻片， 室温晾干
滤光片：建议客户处客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的 详细情况，以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组。
绿色荧光：激发波长为 496nm，发散波长为 520nm 橘红色荧光：激发波长为 551nm，发散波长为 572nm 【样本要求】 骨髓（2-3ml）或外周血（3-5ml），肝素钠抗凝，标本量依病人具体情况而 定，如再障的病人白细胞较少应加大采集。 标本保存及运输： 收集后 2 小时内处理，标本运送及保存建议 2-8℃，不超过 72h。 【检验方法】 一、样本收集： 1、取外周血或骨髓2～3ml（肝素钠抗凝）2000rpm离心5分钟，弃上清； 2、取1ml细胞加入10ml的0.075mol/L KCl 吹打混匀，静置2分钟； 3、恒温水浴锅37±1℃低渗20分钟； 4、加入固定液1ml，吹打混匀，室温欲固定10分钟； 5、吹打混匀，2000rpm离心5分钟； 6、弃上清，沉淀加入10ml固定液，吹打混匀，-20℃沉淀30分钟； 7、2000rpm离心5分钟，弃上清； 8、可重复以上洗涤步骤，直至细胞沉淀洗白洗干净为止（重复洗涤则无需静 置30分钟）。 二、 制片： 1、取一张干净的载玻片； 2、重悬细胞后取3μl，悬液滴加到载玻片上，室温下晾干； 3、用10×物镜在相差显微镜下观察细胞密度，要求细胞无重叠，且单视野细胞 数量在100～200个为宜； 3.1如果细胞密度及数目合适，继续步骤3 3.2如果细胞有重叠，则加入适当新鲜固定液稀释细胞悬浮 3.3如果细胞密度低，则2000rpm离心5分钟，小心吸去适量上清液，混匀后另 取3μl悬液制片，晾片，观察 4、在相差显微镜下观察，如果细胞碎片太多，则需要预处理并且选择合适的 杂交区域。 注意：每个病例至少要多制一张片子，细胞滴片刻放置于有无水乙醇的密闭容
至少有一组红色和绿色荧光信号分离。 【检测方法的局限性】
本试剂盒采用荧光原位杂交技术用于血液肿瘤中IGH基因重排检测，不 能用于其他基因突变方式的检测。
1/2
【产品性能指标】
1 细胞中期染色体探针定位
IGH 探针杂交的位置经过培养的淋巴细胞滴片与 DAPI 复染技术。
IGH 橙色和 IGH 绿色荧光探针，IGH 双色分离探针显示为与 14q32 染色
在自然状态下可以观察到 IGH 基因区域会成为融合的红色和绿色信号。 反之，若 14q32 IGH 基因区域发生断裂：红色和绿色信号分开。
本试剂盒包含两组 IGH 探针 (红色/绿色）及 DAPI 复染液。
【储存条件及有效期】 IGH 基因扩增检测试剂盒于-20℃±3℃密封避光储存； 自生产之日起有效期为一年。
慎接触，立即用大量水冲洗。 3、实验过程中的废弃样本及实验废弃物，需作为医疗废物统一回收处理 4、为得到理想的结果，需确保试剂按照说明书正确配制，正确储存。 5、实验过程中的常见问题及处理方法(见下表)：
问 可能的原因
题
推荐的解决方案
标本及探针变性 不充分
确保玻片进行变性时温度在75±2℃； 将玻片变性时间延长2-4分钟。
本试剂盒仅供科研使用。 【检验原理】
荧光原位杂交法（Fluorescent In Situ Hybridization，FISH）能 够使细胞中特定的核苷酸片段通过荧光而清楚的呈现，FISH 试验过 程中包含了双链 DNA 的解链，荧光标记的 DNA 探针能够与目标序 列结合 [2-3]。杂交完成之后，多余的探针被清洗掉，同时，细胞核被 复染剂 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色会发出蓝色的荧光。
淋巴瘤，发生于50% B细胞NHL中和多种其他淋巴瘤类型中，易位类型复杂。 IGH与特定基因的相互易位有助于临床进行鉴别诊断及预后判断。如MYC/IGH 融合基因可用于辅助诊断伯基特淋巴瘤（BL）（75%发生率），且可用于指导高 分级B细胞淋巴瘤的治疗；BCL1/IGH融合基因发生于75%套细胞淋巴瘤中，可 用于辅助诊断此种肿瘤；BCL2/IGH融合基因发生于85%滤泡性淋巴瘤（FL） 及1/3的弥漫性淋巴瘤（DL）。
【适用仪器】 本试剂盒探针杂交需在杂交仪上进行杂交，如 ThermoBrite。 本试剂盒探针需在荧光显微镜下观察并分析结果。所需荧光显微镜的配置
包括：物镜：在 FISH 分析上，使用 100×消色差浸油类型物镜可取得满意效 果。
镜油：在浸油式物镜上使用的镜油应为低水平自发荧光配方，并专门在 荧光显微镜上使用。
请联系显微镜制造商。
玻 片
标本制作前玻片 清洗不够干净
将玻片浸入无水乙醇中，滴片前用无绒纸巾擦干。
背
确保洗脱液按说明书配制；
景
杂交后洗脱不充 确保按说明书操作；
过
分
确保洗脱液温度正确；
强
移去盖玻片，重复洗脱步骤。
问 可能的原因
题