原位杂交技术
原位杂交名词解释
原位杂交名词解释
原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用
于检测和定位特定的核酸序列在细胞或组织中的分布情况。
该技术利用一段含有探针的核酸序列与待检测样品中的相应核酸序列进行互补杂交，通过标记的探针的位置和数量来确定目标序列的位置。
原位杂交的操作一般分为以下几个步骤：
1.固定样本：首先需要将待检测的细胞或组织样本固定在载玻
片或载体上，使其不被破坏。
2.脱氧核酸的解性处理：将样本中的DNA或RNA进行解性处理，使其成为单链的状态，以利于与探针的杂交。
3.制备探针：设计和合成一段与目标核酸片段互补的核酸探针，并进行标记。
标记可以使用荧光标记剂、酶标记剂等。
4.杂交：将制备好的探针加到固定的样品上，在合适的温度和
离子平衡条件下，使探针与待检测的样品中的目标序列发生互补杂交。
5.洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除未与目标序列相互补的探针。
6.检测和成像：利用显微镜或其他成像设备观察和记录探针的
标记位置和数量，以确定目标序列在样品中的分布情况。
原位杂交技术可以用于很多领域，如遗传学、细胞生物学和病理学等。
它可以用来研究基因表达、染色体异常、病原体感染等问题，帮助科学家更好地了解细胞和组织的结构和功能。
此外，原位杂交还可以用来诊断疾病，如肿瘤、遗传病等，通过监测特定基因的表达情况，帮助医生做出正确的诊断和治疗方案。
总的来说，原位杂交是一种研究和定位目标核酸序列在细胞或组织中分布情况的技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，可以广泛应用于生命科学的各个领域。
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
分子生物学研究中的原位杂交技术
分子生物学研究中的原位杂交技术1. 引言原位杂交技术(In Situ Hybridization，ISH)是一种分子生物学研究中常用的重要技术方法，它在研究基因功能、表达、定位和疾病等方面具有广泛的应用。
通过掌握ISH技术的基础知识和基本操作，可以为分子生物学的深入研究提供强有力的工具。
2. 背景知识ISH技术是通过将DNA或RNA探针与待检测物品（如细胞、组织、染色体等）发生靶向杂交反应，从而探究DNA和RNA序列在待检测物品内的分布、表达及功能等。
利用双链DNA分子中序列互补的特性，ISH技术可以检测同源性的DNA或RNA序列，并确定它们在待检测物品内的位置。
ISH技术有多种类型，其中包括原位DNA杂交（In Situ DNA Hybridization，ISDH）、细胞核流式原位杂交（Fluorescence InSitu Hybridization of Interphase Nuclei，FISH）、原位RNA杂交（In Situ RNA Hybridization，ISR）等。
FISH是目前应用最广泛的一种ISH技术，它能够在细胞核级别上进行检测，解决了ISDH只能检测染色体水平的限制。
3. 原位DNA杂交 (ISDH)ISDH技术是通过从待检测物品中提取DNA标记探针，利用其与待检测物品DNA发生互补杂交来实现。
它能够检测到DNA分子的位置和数量，并确定待检测物品中特定DNA序列的分布。
ISDH的操作步骤主要包括：（1）待检测物品的准备和固定；（2）DNA探针的制备和标记；（3）探针与待检测物品DNA的杂交；（4）洗涤和显色。
4. 细胞核流式原位杂交 (FISH)FISH技术是通过使用荧光探针，将荧光标记的DNA探针与待检测物品的染色体DNA或RNA发生互补杂交反应，直接在细胞核水平上检测DNA序列的位置和数量。
FISH技术不仅能够在正常染色体结构和分布的情况下对基因进行检测，还能够检测基因突变、重排等变异情况。
原位杂交的原理
原位杂交的原理
原位杂交是一种核酸杂交技术，通过将标记有荧光物质的探针与待测样品中的靶标序列进行杂交反应来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
原位杂交的原理基于两种核酸之间的互补配对原则。
DNA或RNA的互补链能够在一定条件下进行杂交，即互相结合形成
双链。
探针是一段由核酸组成的序列，它与待测样品中的目标序列具有互补的碱基序列。
在原位杂交实验中，首先需要制备探针。
探针可以是由DNA
或RNA构成的，其中至少一部分标记有荧光物质。
荧光物质
的标记使得通过显微镜或其他荧光成像设备能够检测到杂交的信号。
探针与待测样品中的目标序列发生互补配对后，形成探针与目标序列的杂交复合物，即探针与靶标序列互相结合。
为了确保探针与目标序列的特异性结合，一般会在杂交反应中使用一些特异性的条件，如控制杂交温度、盐浓度和pH值等。
此外，还可以使用一些核酸结合蛋白的抑制剂来降低非特异性结合。
通过显微镜观察荧光信号的出现位置和强度，可以确定目标序列在细胞或组织中的位置和数量。
常用的观察方式包括荧光显微镜、原位杂交图像分析系统等。
总的来说，原位杂交利用探针与目标序列的互补配对原理，通
过荧光信号的观察来检测和定位特定的DNA或RNA序列。
这种方法在生物医学研究和分子诊断中具有广泛的应用价值。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
原位杂交技术
原位杂交技术的特点
光镜或电镜
在保持组织、细胞或染色体结构的条件 下在原位检测特异的核酸分子，这种定位能 够反应特异核酸分子与组织、细胞或细胞器 的关系
原位杂交技术的发展
1969年，Gall等人首次应用原位杂交方法检测 病毒DNA，核糖体DNA
标记分子：35S-UTP 35S-dATP 35S-dCTP 32P-UTP 32P-dATP 等等
非放射性标记物
（荧光素 生物素 地高辛 溴脱氧尿嘧啶等）
被导入某个单核苷酸而形成标记分子
如： 四甲基罗达明-UTP
生物素-UTP (Bio-UTP)
地高辛-dUTP (Dig-dUTP)
溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子
变 性 DNA
复
变性的两条互补DNA单链在适当条件
性
下重新缔合成双链的过程称为复性
退火
复性可以发生在导致变性的高温下降的时 候，因此又将复性称为退火
(活细胞内的DNA在进行复制和转录时也存
在着变性和复性的过程)
原位杂交
以经过标记的已知核酸分子为探针 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交
cDNA双链探针的优点：
⑴ 克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽 ⑵ 较稳定，不易被降解 ⑶ 标记方法可靠易行
2. RNA探针
RNA是单链分子 （探针长度50-300碱基对）
优点： ⑴ 杂交效率比DNA探针高
⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体 比DNA-mRNA杂交体稳定
⑶ 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链
原位杂交技术
原位杂交技术原位杂交技术是一种基因分析技术，可以用来研究细胞内基因的表达模式和基因组的结构。
本文将介绍原位杂交技术的基本原理、应用领域以及未来发展方向。
原位杂交技术最早是在20世纪70年代发展起来的，主要用于研究DNA在细胞中的位置和分布情况。
其基本原理是利用亲和性标记的探针与目标DNA序列特异性结合，通过显色或荧光等方法来检测标记物的位置。
原位杂交技术的具体步骤包括控制组织或细胞的形态、固定样本、渗透处理、杂交、洗脱、显色和观察等。
其中最关键的步骤是杂交反应，需要合理设计探针的序列和标记方法，并进行适当的条件优化。
原位杂交技术广泛应用于生物医学领域，可以用于寻找新的基因、研究基因的表达调控机制、探索基因组的结构与功能等。
例如，科学家可以用这种技术来研究染色体异常、肿瘤基因的异常表达、发育过程中的基因调控等。
此外，原位杂交技术在遗传学、生物学、植物学、动物学和微生物学等领域也有广泛的应用。
在遗传学中，可以用原位杂交技术检测并分离具有特定基因型的个体；在植物学中，可以研究植物的组织分化和发育过程；在动物学中，可以研究胚胎发育和器官再生等。
虽然原位杂交技术在基因研究中起到了重要作用，但仍存在一些局限性和挑战。
首先，该技术的灵敏度和特异性受到探针选择、探针标记和杂交条件等多个因素的影响。
其次，原位杂交技术在细胞外不易实施，因为固定和渗透处理可能会对细胞和组织结构产生破坏。
未来，随着生物技术的不断发展，原位杂交技术也将得到进一步改进和完善。
例如，可以利用新型的标记物和探针来提高技术的敏感度和特异性，同时也可以开发新的杂交方法来降低对样本的破坏。
此外，结合其他高通量分析技术，如转录组学和蛋白质组学，可以更全面地揭示基因表达和调控的网络。
总之，原位杂交技术是一种重要的基因分析技术，可以揭示细胞内基因的表达模式和基因组的结构。
在今后的研究中，我们有理由相信原位杂交技术将发挥更大的作用，并帮助科学家们更好地理解生命的奥秘。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交技术的具体步骤原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要方法。
它可以帮助我们了解基因在细胞中的定位和表达情况，进而揭示基因调控的机制。
本文将详细介绍原位杂交技术的具体步骤。
一、制备探针在进行原位杂交实验之前，首先需要制备合适的DNA或RNA探针。
探针是一段标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA序列，用于与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。
制备探针的方法有多种，常见的包括随机引物标记法、PCR标记法和转录标记法等。
二、取样和固定在进行原位杂交实验时，需要采集待检测样品，并将其固定在载玻片上。
固定的目的是保持样品的形态结构和细胞核的完整性，以便后续的杂交反应能够准确地进行。
常用的固定方法有冷冻固定、乙醛固定和细胞固定等。
三、脱水和处理在固定完样品后，需要对其进行脱水处理。
脱水的目的是去除样品中的水分，使探针能够更好地与靶标DNA或RNA结合。
脱水处理通常采用浓度递增的乙醇溶液进行，如70%、85%和95%乙醇溶液。
四、杂交反应杂交反应是原位杂交技术的核心步骤。
在杂交反应中，将制备好的探针与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。
杂交反应的条件包括温度、时间和缓冲液的选择等。
一般来说，杂交温度较高可以提高探针与靶标的互补配对效率，但也可能导致非特异性杂交的发生。
五、洗涤和检测在杂交反应完成后，需要对样品进行洗涤，以去除非特异性杂交的探针。
洗涤的条件通常是选择适当的盐溶液和洗涤时间，以确保只有与靶标DNA或RNA互补配对的探针能够保留在样品中。
洗涤完成后，可以使用适当的检测方法来检测样品中的探针信号，如荧光显微镜、放射自显影等。
六、结果分析根据样品中的探针信号，可以进行结果的分析和解读。
通过观察探针的分布和强度，可以确定靶标DNA或RNA在细胞中的定位和表达情况。
此外，还可以通过对多个样品的比较分析，揭示基因的差异表达和调控机制。
原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以帮助我们研究基因组的结构和功能。
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原位杂交技术
时间：2015年10月14日
一、定义
二、基本原理 三、分类
四、基本过程 五、技术的应用
一、原位杂交技术的定义
• 原位杂交技术（In situ hybridization，
ISH）是指将特定标记的已知顺序核酸为探
针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从
而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过
程
Байду номын сангаас
4.杂交体探测
根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免 疫细胞化学方法显示杂交结果。
放射自显影可以利用人工或者计算机辅助的图像 分析检测仪进行检测 非放射性核酸探针杂交的细胞或者组织可以利用 酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或者 图像分析仪对不同类型和数量的核算显色强度进 行检测
五、原位杂交技术的应用
二、原位杂交技术的基本原理
• 利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，
将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)
与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA
互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，
经一定的检测手段将待测核酸在组织、细
胞或染色体上的位置显示出来
三、原位杂交技术的分类
• 1、基因组原位杂交技术
利用物种之间的DNA同源性的差异，用另
• （4）增强穿透性：用某些消化酶例如：胃 蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶等使得组织广 泛的去蛋白可以增强组织的通透性和核算 探针的穿透性 • （5）减低背景染色：杂交后的酶处理和杂 交后的洗涤有助于减低背景染色
2.标记探针的准备 对cDNA、RNA和寡核苷酸三种探针的选择， 要考虑所要检测的靶核酸分子的性质，如 cDNA 和RNA 适宜于检测mRNA分子，寡核苷 酸对mRNA的杂交效率和特异性都不如RNA探
• 3、多彩色荧光原位杂交技术 是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来 的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光 素单独或混合标记的探针进行原位杂交，
能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微
镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩，
优点：能同时检测多个基因
• 4、原位PCR
原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR
技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸
序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使
其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检
测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量 分析 优点：大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专 一性，可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位
三、原位杂交技术的一般过程
杂交前准备 以经过标记的已知核酸分子为探针
一物种的基因组DNA以适当的浓度做封阻，
在靶染色体上进行原位杂交
• 2、荧光原位杂交技术
在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来 的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用 荧光标记的核酸片段为探针，与染色体进行杂交， 通过荧光显微镜检测信号DNA序列在染色体或者 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。 优点：检测时间短，灵敏度高，无污染
针。
3、杂交 杂交是在一定温度和离子强度条件下让标记 探针与组织中靶分子结合的过程。将杂交 液体滴于切片的组织上，加盖硅化的盖玻 片用以防止杂交夜的挥发 探针的浓度：非放射性标记探针浓度为 0.5-5.0ng/ul，放射性标记的探针浓度在 2-5ng/ul 必须强调的是加杂交液的量要适度，以1020ul每张切片为宜
• ①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图 谱，基因表达和基因组进化的研究 • ②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位 • ③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平 的表达及其变化的检测 • ④基因在染色体上的定位 • ⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色 体易位等 • ⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如某些肿瘤的诊 断和生物学剂量测定等
使探针与靶核酸分子在原位发生杂交
进行探测
四、原位杂交技术的基本步骤
• 1、杂交前的准备 • 包括固定、取材、玻片和组织的处理，如 何增强核算探针的穿透性、减低背景染色 等 • （1）固定：最大限度的保持细胞内DNA和 RNA的水平，常用的固定剂是多聚甲醛 • （2）取材：组织在取材后可以用液氮冷冻 • （3）组织处理：ISHH实验周期较长需要 用粘附剂处理，常用的是铬矾明胶液和多 聚赖氨酸