原位杂交技术

针。
3、杂交 杂交是在一定温度和离子强度条件下让标记 探针与组织中靶分子结合的过程。将杂交 液体滴于切片的组织上，加盖硅化的盖玻 片用以防止杂交夜的挥发 探针的浓度：非放射性标记探针浓度为 0.5-5.0ng/ul，放射性标记的探针浓度在 2-5ng/ul 必须强调的是加杂交液的量要适度，以1020ul每张切片为宜
4.杂交体探测
根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免 疫细胞化学方法显示杂交结果。
放射自显影可以利用人工或者计算机辅助的图像 分析检测仪进行检测 非放射性核酸探针杂交的细胞或者组织可以利用 酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或者 图像分析仪对不同类型和数量的核算显色强度进 行检测
五、原位杂交技术的应用
技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸
序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使
其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检
测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量 分析 优点：大大提高了原位杂交技术的灵敏度和专 一性，可用于低拷贝甚至单拷贝的基因定位
三、原位杂交技术的一般过程
杂交前准备 以经过标记的已知核酸分子为探针
使探针与靶核酸分子在原位发生杂交
进行探测
四、原位杂交技术的基本步骤
• 1、杂交前的准备 • 包括固定、取材、玻片和组织的处理，如 何增强核算探针的穿透性、减低背景染色 等 • （1）固定：最大限度的保持细胞内DNA和 RNA的水平，常用的固定剂是多聚甲醛 • （2）取材：组织在取材后可以用液氮冷冻 • （3）组织处理：ISHH实验周期较长需要 用粘附剂处理，常用的是铬矾明胶液和多 聚赖氨酸
一物种的基因组DNA以适当的浓度做封阻，
在靶染色体上进行原位杂交
• 2、荧光原位杂交技术
在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来 的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用 荧光标记的核酸片段为探针，与染色体进行杂交， 通过荧光显微镜检测信号DNA序列在染色体或者 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。 优点：检测时间短，灵敏度高，无污染
• （4）增强穿透性：用某些消化酶例如：胃 蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶等使得组织广 泛的去蛋白可以增强组织的通透性和核算 探针的穿透性 • （5）减低背景染色：杂交后的酶处理和杂 交后的洗涤有助于减低背景染色
2.标记探针的准备 对cDNA、RNA和寡核苷酸三种探针的选择， 要考虑所要检测的靶核酸分子的性质，如 cDNA 和RNA 适宜于检测mRNA分子，寡核苷 酸对mRNA的杂交效率和特异性都不如RNA探
二、原位杂交技术的基本原理
• 利用核酸分子单链之间有互补来自百度文库碱基序列，
将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)
与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA
互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，
经一定的检测手段将待测核酸在组织、细
胞或染色体上的位置显示出来
三、原位杂交技术的分类
• 1、基因组原位杂交技术
利用物种之间的DNA同源性的差异，用另
• ①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图 谱，基因表达和基因组进化的研究 • ②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位 • ③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平 的表达及其变化的检测 • ④基因在染色体上的定位 • ⑤检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色 体易位等 • ⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如某些肿瘤的诊 断和生物学剂量测定等
• 3、多彩色荧光原位杂交技术 是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来 的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光 素单独或混合标记的探针进行原位杂交，
能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微
镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩，
优点：能同时检测多个基因
• 4、原位PCR
原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR
原位杂交技术
时间：2015年10月14日
一、定义
二、基本原理 三、分类
四、基本过程 五、技术的应用
一、原位杂交技术的定义
• 原位杂交技术（In situ hybridization，
ISH）是指将特定标记的已知顺序核酸为探
针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从
而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过
程