原位杂交技术

3、探针标记 、
切口移位法，亦称缺口平移法，是常用的标记 DNA的方法。常为同位素标记，也可用地高辛和 生物素进行标记。 引物延伸法(primer extension)此法产量低，可标 记纯度不太高的DNA。 末端标记法(end - labeling) 分为5’末端和3’末端 标记。此法适用于合成的寡核苷酸探针。 体外转录法，此法应用于制备RNA探针。
染色体制片 相差显微镜 白片，不能染色
2、探针的制备 、
用生物工程技术获取特异的cDNA片段 从mRNA逆转录生成cDNA→构建cDNA 文库→ 筛选和克隆特异cDNA 分子 特异cDNA 分子与载体（质粒）DNA在体外重组 cDNA DNA 质粒转化 质粒扩增 质粒抽提、酶切、纯化→得到特异的cDNA探针
缺 点
实验条件要求严谨 信号淬灭快 对环境有一定污染
四、探针(probe) 探针
是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片 段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或 RNA顺序定位的特殊试剂 探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分 子结合上。 用于原位杂交的探针有不同种类，可用于不同靶 核酸的探测。
探针种类
重复DNA序列 序列 重复 单拷贝或低拷贝的DNA序列 序列 单拷贝或低拷贝的 基因组DNA 基因组
重复DNA序列探针 序列探针 重复
重复DNA序列、多基因家族作为探针与染色体原 序列、 重复 序列 位杂交。容易产生较高的分辨率。因为这些 位杂交。容易产生较高的分辨率。因为这些DNA 多拷则序列在染色体上可达几十个kb或几个 。 多拷则序列在染色体上可达几十个 或几个Mb。 或几个 日前所使用的这类探针有45S rDNA,5S rDNA、 日前所使用的这类探针有 、 着丝点序列、 序列、亚端粒序列、转座子等。 着丝点序列、端粒 序列、亚端粒序列、转座子等。
荧光原位杂交技术 FISH
一、 概念
原位杂交( 原位杂交 in situ hybridization, ISH )是应用生物 化学中核酸分子杂交的原理,在组织切片、细胞涂 片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项 DNA RNA 技术。 1969年美国耶鲁大学Gall等首先通过基因探针将 核糖体基因在爪蟾卵母细胞上进行定位。
基因组DNHale Waihona Puke Baidu探针 探针 基因组
利用不同基因组DNA同源性程度的差异。在原位 同源性程度的差异。 利用不同基因组 同源性程度的差异 杂交中只标记某一基因组或某个物种的基因组 DNA。 。 在杂交中标记的基因组DNA首先与其完全同源的 首先与其完全同源的 在杂交中标记的基因组 DNA杂交。 杂交。 杂交 可以检测出导入异源多倍体的外源染色体或染色 体片段， 体片段，同时可以清楚地显示出易位与交换的位 置。
荧光原位杂交类型
荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)是20世纪80年代末在己有的放 射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射 性DNA分子原位杂交技术。 基因组原位杂交（GISH） 荧光原位杂交（FISH） 多色荧光原位杂交（M-FISH ）
优 点
1、安全、可靠； 2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用； 3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定 位准确； 4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度 接近放射性探针； 5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可 同时检测多种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的 变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
五、FISH技术的应用 技术的应用
重复序列或多拷贝的基因家族的染色体定 位 杂种亲本染色体的鉴定 染色体的结构分析 异源染色质的鉴定 染色体物理图谱的构建
六、实验步骤
FISH样本的制备 探针的制备 探针标记 样本的预处理 杂交 染色体显带 荧光显微镜检测 结果分析。
七、实验流程
1、FISH样本的制备 、 样本的制备
二、原位杂交的基本原理
核酸分子杂交的基本原理是利用核酸分子 (DNA, RNA)的碱基对形成氢键的互补性 (A=T, A=U, C=G)，用一标记的核酸探针去 检测与之碱基互补的靶核酸 免疫学中抗原－抗体的反应。
三、原位杂交的分类
按杂交对象： 组织 细胞 染色体
按探针标记物
同位素（ 同位素（放射性）标记探针 标记探针 非同位素标记探针 荧光标记：最常用的为生物素、地高辛 (Digxigenin , DIG)、罗丹明（Rhodamine）、 荧光素（Fluorescence）、PI 、DAPI 酶标：如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶 (ALP)等。
单拷贝或低拷贝DNA探针 探针 单拷贝或低拷贝
这类探针包括某个基因的DNA克隆 RFLP 克隆. 这类探针包括某个基因的 克隆 标记。 或RAPD标记。这些探针 标记 这些探针DNA序列一般只 序列一般只 有1-2kb.因而这类标记的原位杂交存在几个 因而这类标记的原位杂交存在几个 方面的困难: 方面的困难 1)需要用多层抗体结合来放大杂交信号 需要用多层抗体结合来放大杂交信号 2)杂交信号很弱时 难以与背景信号区分 杂交信号很弱时.难以与背景信号区分 杂交信号很弱时 3)能够显示杂交信号的细胞比例很低 能够显示杂交信号的细胞比例很低
4、样本的预处理
固定 洗涤 酶解：RNA酶，蛋白酶K 变性
5、杂交
恒温：37摄氏度 恒湿 避光 杂交信号的放大：二级放大
6、染色体显带 、
根据探针标记的荧光素颜色选PI （红）或 DAPI（蓝）显色 封片
7、荧光显微镜检测 、
避光 快速 注意淬灭时间
The end