结核杆菌耐利福平分子机制的研究和rpoB基因突变快速检测方法的探讨
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结果
一、菌种生化鉴定结果
所有５８株细菌经生化初步鉴定为结核分支杆菌，未见牛分支杆菌等其他非结核分支杆菌。
二、药敏测定结果
５８株结核分支杆菌中，利福平耐药株３６株，敏感株２２株。耐药株中对利福平高度耐药的有２０株，低度耐药的有１６株。３６株利福平耐药株均至少对另一种其他的一线药物也耐药，其中有３２株对利福平耐药的结核分支杆菌同时对异烟肼耐药，其比例高达８８．９％。结核分支杆菌的耐药类型以及耐多药株的耐药谱见表１—４，利福平耐药与耐多药之间的关系见图１．１。
表１－４结核分支杆菌的耐药类型
注：Ｘ：ＩＮＨ、ＳＭ或ＥＭＢ中的任何～种：Ｙ为ＳＭ或ＥＭＢ。
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ｒｐｏＢ基因片段的扩增与序列分析
目』ｊ１『可以通过Ｉｎｔｅｍｅｔ在ＧｅｎｅＢａｎｋ（Ｌ２７９８９）罩查到ｒｐｏＢ基因的全序列（１０６５。４５９８），共３５３４ｂｐ。下面列出了包含核心突变区的部分基因序列。
ＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｐｏＢ［ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８（４），８０５—８１１（１９９４）】０６５
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ｒｐｏＢ全基因序列共３５３４ｂｐ（１０６５—４５９８），其中２３７０～２４３８共６９ｂｐ的片段为核心突变区（有底纹部分），本部分研究的引物分别为其上游的２３１６—２３３５区和下游的２５２８．２５０９区的序列（带边框部分）。
２．１引物的设计与合成
根据上述ｒｐｏＢ基因序列设计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成
ｄｄＨ２０溶解，终浓度为２５ｐｍｏｌ／ｕＬ。
Ｉ二游引物Ｆ（２０ｂｐ）：５＇－ＡＴＣＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＴＧＧＴ一３
Ｆ游引物Ｒ（２０ｂｐ）：５＇－ＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＣＣ一３
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结果
一、ＤＮＡ的抽提与鉴定
逊过ＩＳ６１１０片段的扩增，对５８橡煞垓分支＃Ｆ菠的挞因组ＤＮＡ避；ｊ：ＰＣＲ攥定，扩增产甥缀２％琼脂糖凝胶电泳（４Ｖ／ｃｍ），结果均可见单一渍蜒∞目的条她（１２３ｂｐ，见图２－４）。
篷２－４。结援分支辑蘧基蓬缀ＤＮＡ鉴定
Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（ＬａｎｄｅｒｌＯＯｂｐ）；１、２为扩增的ＩＳ６１１０片段（１２３ｂｐ），
１和２的丰萸扳分别为Ｈ３７Ｒｖ和临床分离橼提取的基因缎ＤＮＡ：３为阴性对照
二、ＰＣＲ扩增与序列分析
ｉ、ＰＣＲ扩增：５Ｂ株结核分支杆菌ＤＮＡ的ｒｐｏＢ扩增产物经２％琼脂糖凝胶电泳（４Ｖ／ｃｍ）均可见单一清晰的目的条带（２１３ｂｐ。见圉２－５）。
燃２－５．ｒｐｏＢ壤吣扩璎，｝段ｌ毡溶
Ｍ·ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ·Ｉ～４均儿女“增的ｒｐｏＢｌｆ∞＂投ｆ２Ｉ３的ｊ，
ｎ攫械为１１３７ＲＶＩ）ＮＡ．２～ｊ的懊扳为恤抹分高曲椿Ｊ。ｃ训ｍｆ
Ｉ）ＮＡ，４／ｓｆ，＇／ｔ雌对照，