结核杆菌耐利福平分子机制的研究和rpoB基因突变快速检测方法的探讨

结果
一、菌种生化鉴定结果
所有５８株细菌经生化初步鉴定为结核分支杆菌，未见牛分支杆菌等其他非结核分支杆菌。

二、药敏测定结果
５８株结核分支杆菌中，利福平耐药株３６株，敏感株２２株。

耐药株中对利福平高度耐药的有２０株，低度耐药的有１６株。

３６株利福平耐药株均至少对另一种其他的一线药物也耐药，其中有３２株对利福平耐药的结核分支杆菌同时对异烟肼耐药，其比例高达８８．９％。

结核分支杆菌的耐药类型以及耐多药株的耐药谱见表１—４，利福平耐药与耐多药之间的关系见图１．１。

表１－４结核分支杆菌的耐药类型
注：Ｘ：ＩＮＨ、ＳＭ或ＥＭＢ中的任何～种：Ｙ为ＳＭ或ＥＭＢ。

Ｈ１．Ｉ利丰ｆ１１’ｒ耐药’ｏ时多鲋之川的天系
Ｒ：ＲＦＩ’：Ｉ：［ＮＩＩ：Ｓ：ＳＭ：Ｅ：ＥＭＢ：Ｘ：Ｉ！此ｓ戏Ｅ：Ｙ：Ｓ！止Ｅ．，
ｒｐｏＢ基因片段的扩增与序列分析
目』ｊ１『可以通过Ｉｎｔｅｍｅｔ在ＧｅｎｅＢａｎｋ（Ｌ２７９８９）罩查到ｒｐｏＢ基因的全序列（１０６５。

４５９８），共３５３４ｂｐ。

下面列出了包含核心突变区的部分基因序列。

ＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｐｏＢ［ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８（４），８０５—８１１（１９９４）】０６５
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ｒｐｏＢ全基因序列共３５３４ｂｐ（１０６５—４５９８），其中２３７０～２４３８共６９ｂｐ的片段为核心突变区（有底纹部分），本部分研究的引物分别为其上游的２３１６—２３３５区和下游的２５２８．２５０９区的序列（带边框部分）。

２．１引物的设计与合成
根据上述ｒｐｏＢ基因序列设计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成
ｄｄＨ２０溶解，终浓度为２５ｐｍｏｌ／ｕＬ。

Ｉ二游引物Ｆ（２０ｂｐ）：５＇－ＡＴＣＡＡＣＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＴＧＧＴ一３
Ｆ游引物Ｒ（２０ｂｐ）：５＇－ＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＣＣ一３
Ｊ，ｋ）ｌＪ卜述０『物埘ｒｐｏＢ地ｌ大Ｉ进ｉＪ：扩增的ＪｌＩ段Ｋ／一Ｆ为２１３ｂｐ。

．
结果
一、ＤＮＡ的抽提与鉴定
逊过ＩＳ６１１０片段的扩增，对５８橡煞垓分支＃Ｆ菠的挞因组ＤＮＡ避；ｊ：ＰＣＲ攥定，扩增产甥缀２％琼脂糖凝胶电泳（４Ｖ／ｃｍ），结果均可见单一渍蜒∞目的条她（１２３ｂｐ，见图２－４）。

篷２－４。

结援分支辑蘧基蓬缀ＤＮＡ鉴定
Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（ＬａｎｄｅｒｌＯＯｂｐ）；１、２为扩增的ＩＳ６１１０片段（１２３ｂｐ），
１和２的丰萸扳分别为Ｈ３７Ｒｖ和临床分离橼提取的基因缎ＤＮＡ：３为阴性对照
二、ＰＣＲ扩增与序列分析
ｉ、ＰＣＲ扩增：５Ｂ株结核分支杆菌ＤＮＡ的ｒｐｏＢ扩增产物经２％琼脂糖凝胶电泳（４Ｖ／ｃｍ）均可见单一清晰的目的条带（２１３ｂｐ。

见圉２－５）。

燃２－５．ｒｐｏＢ壤吣扩璎，｝段ｌ毡溶
Ｍ·ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ·Ｉ～４均儿女“增的ｒｐｏＢｌｆ∞＂投ｆ２Ｉ３的ｊ，
ｎ攫械为１１３７ＲＶＩ）ＮＡ．２～ｊ的懊扳为恤抹分高曲椿Ｊ。

ｃ训ｍｆ
Ｉ）ＮＡ，４／ｓｆ，＇／ｔ雌对照，
挺２－２．不同突变化点ｎ勺数ｆｉＩ＝及盯分比
氩Ｊ。

Ｉ峻似饩样术｛“（株）¨Ｉ总突，燕株Ｉ’内比例（％）Ｉ☆Ｊ度｝时曲株（株）
图２－６．ｒｐｏＢ基因不同突变位点的百分比
５２６位氨基酸是突变类型最多的一个突变位点，其中第一个碱基胞嘧啶（ｃ）的突变最为常见，不同突变类型的基因型及百分比见表２－３和图２—７。

表２－３．５２６何氨基酸突变的详细资料
密码子突变氮墓酸转换样本数域卣分比（％１
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ｌＩｓ＿÷ＡＩａ３
２
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２２．２（２／９）
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１１．１（１／９）
ｌｌｌ（１／９）
１｜ｌ（Ｉ／９）
图２—７５２６位密码于突变后的氮基酸类型及比例
三、ｒｐｏＢ基因片段的克隆
１、ＰＣＲ产物浓度的鉴定
分别１ｐｌ、２ｐ．１、４ｐｌ的ＰＣＲ产物与标准浓度ＤＮＡ同步电泳，初步判断ＰＣＲ产物的浓度，电泳结果见图２—８。

幽２－８．ＰＣＲ产物浓度的初步测定
１～３为ＰＣＲ扩增产物，４－８为标准浓度ＤＮＡＭａｒＫｅｒ。

卜３上样姑分如
为１ｇｌ／２ｐｌ／４ｐ．１，４～８分ＮＪ，Ｊ１５ｎｇ／２５ｎｇ／４０ｎｇ／６０ｎｇ平¨８０
ｎｇ。

通过ｌ：Ｊ制不川条一黔与枷；准浓度ＤＮＡ的对比，·ｔ】．以初步削定ＰＣＲ扩增』“：物的浓度约为７０ｎｇ／Ｉ＿ｄ，Ｉ叮以１ｉ质粒钱体进行仃放ｆ内连接反Ｊ、ｔ，
２、重组质粒的酶切鉴定
为逃行内切脯的选择，应川不同的内切酶眦对后进行双怖切，结果褂…１ｉ１Ｋ度的酶切片段（图２－９）。

图２－９．重组质粒ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ＩｒＲｏＢ的初步酶切结果
１、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（１００ｂｐ－６ｋｂ）：２、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ＋ＥｃｏＲＩ：
３、Ｈ／ｒｉｄＩＩｌ＋ＢａｍＨＩ：４、ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＥｃｏＲＩ：５、ＳａｌＩ＋＆ｏＲＩ：６、ＸｋｏＩ十ＥｃｏＲＩ：７、ＸｋｏＩ＋ＰｓｔＩ：８、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（１００ｂｐ－１０００ｂｐ）
根据初步酶切结果，选用ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＥｃｏＲＩ（ＢｕｆｆｅｒＭ）对所有克隆进行酶切。

将酶切产物经２％琼脂糖凝胶电泳（４Ｗｃｍ），结果见图２一ｌＯ。

幽２，１０．重组质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）／ｒｐｏＢ的酶切结粜
１－４均为应ＪＬ｝ｊＨｉｎｄＩＩＩ＋ＥｃｏＲＩｆＢｕｆｆｅｒＭ）的酶切绵粜
３、克隆测序
我们肿不删突变删纠型突变株的ｒｐｏＢＪｔＥⅢ外段作了兜Ｉ谨和ＤＮＡＪ卜列验¨５３Ｉｆ口惭刷ｒ垌Ｉ５２６化密码ｒ叔碱墉突变的测序结果址㈥２．Ｉ１，
｜：付ＤＮＡ洲序结果（Ｈ２一１２）：ｊ瞥州Ｊ，５３ｌ化欠，坚ｒ７ｒＣ（ｊ－＋Ｔ７１’（ｊ，ｓｃｒ－＋Ｌｃｕｊ。