吡罗红甲基绿染色剂染色的原理

吡罗红甲基绿染色剂染色的原理

1、原理与解析

(1)真核细胞的DNA主要分布在细胞核内，RNA主要分布在细胞质中。

(2)甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿对DNA亲和力强，使DNA显现出绿色，而吡罗红对RNA的亲和力强，使RNA呈现出红色。用甲基绿、吡罗红的混合染色剂将细胞染色，可同时显示DNA和RNA在细胞中的分布。

(3)盐酸的作用

①盐酸能改变细胞膜的通透性，加速染色剂的跨膜运输；

②盐酸使染色体中的DNA与蛋白质分离，便于DNA与染色剂的结合。

吡罗红（G）甲基绿染色剂（methyl green-pyronin）为碱性染料，它分别能与

细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色（但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色）。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成绿色。

注意事项

1.材料的选择

①选用的实验材料既要容易获得，又要便于观察；

②常用的观察材料由人的口腔上皮细胞、洋葱鳞片叶表皮细胞(为避免原有颜色的干扰，不可使用紫色表皮细胞)

2.取材要点

①取口腔上皮细胞之前，应先漱口，以避免装片中出现太多的杂质；

②取洋葱表皮细胞时，尽量避免材料上带有叶肉组织细胞。

3.冲洗载玻片时水的流速要尽量慢，切忌直接用水龙头冲洗。

4.安全要点

①用酒精灯烘烤载玻片时，不要只集中于材料处，而应将载玻片在火焰上来回移动，使载玻片均匀受热，以免破裂；

②烘烤后的载玻片不要马上放入盛有稀盐酸的烧杯中，最好先自然冷却1分钟。

5.换用高倍镜观察材料时，只能用细准焦螺旋进行调焦，切不可动粗准焦螺旋。

主要步骤(以观察口腔上皮细胞为例)

1.取材

①滴：在洁净的载玻片上滴一滴质量分数为0.9%的NaCl溶液；

②刮：用消毒牙签在口腔内侧壁上轻轻地刮几下；

③涂：将牙签上的碎屑涂抹在载玻片的生理盐水中；

④烘：将涂有口腔上皮细胞的载玻片在酒精灯的火焰上烘干。

2.水解

①解：将烘干的载玻片放入装有30ml质量分数为8%的盐酸的小烧杯中，进行材料的水解；

②保：将小烧杯放入装有30℃温水的大烧杯中保温5分钟。

3.冲洗涂片

①冲：用缓缓的蒸馏水冲洗载玻片10秒钟；

②吸：用吸水纸吸去载玻片上的水分。

4.染色

①染：用2滴吡罗红甲基绿混合染色剂滴在载玻片上，染色5分钟；

②吸：吸去多余染色剂；

③盖：盖上盖玻片。

5.观察

①低：在低倍物镜下，寻找染色均匀，色泽浅的区域，移至视野中央，将物像调节清晰；

②高：转到高倍物镜，调节细准焦螺旋，观察细胞核和细胞质的染色情况。

6.关于吡罗红甲基绿染色剂的问题

（1）试剂质量分数为0.9%的NaCl溶液，质量分数为8%的盐酸，乙酸钠，乙酸，蒸馏水，吡罗红甲基绿混装粉。如果化学试剂商店没有吡罗红甲基绿混装粉，可以分别购买甲基绿和吡罗红G（不能为吡罗红B），然后按A液的第二种方法配制（见下文）。

（2）染色剂的配制

①染色剂A液的两种配制方法

第一种方法：取吡罗红甲基绿粉1 g，加入到100 mL蒸馏水中溶解，然后用滤纸过滤，将滤液放入棕色瓶中备用。

第二种方法：取甲基绿2 g溶于98 mL蒸馏水中，取吡罗红G 5 g溶于95 mL蒸馏水中。取6 mL甲基绿溶液和2 mL吡罗红溶液加入到16 mL蒸馏水中，即为A液，放入棕色瓶中备用。

②染色剂B液的配制方法 B液是一种缓冲液，由乙酸钠和乙酸混合而成。先取乙酸钠16.4 g，用蒸馏水溶解至1 000 mL备用；再取乙酸12 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL备用。取配好的乙酸钠溶液30 mL和稀释的乙酸20 mL，加蒸馏水50 mL，配成pH为4.8的B液（缓冲液）。

③染色剂的配制染色剂是由A液、B液混合配制而成的。取A液20 mL和B液80 mL混合，就是实验中所用的吡罗红甲基绿染色剂。应该注意的是该试剂应现用现配。