分子诊断在感染性疾病中应用
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耐多药结核病做出快速诊断。
➢ 通 量：两个一线抗结核药（MDR） ➢ 速 度：8周（药敏） 6 小时 ➢ 灵敏度：103 个菌/反应
15
病毒性疾病的分子检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）
世界其它地区
亚太地区 75%
• 全世界有3.5亿慢性携带者， 75%在亚太地区
• 每年有一百万人死于HBV感染 ，是全球范围内第9位死因
• 结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反 应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、 基因芯片、基因分型等。
现代分子生物学快速诊断
基因结构 分子诊断
基因组特点
共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌 基因组全长4.4kb,
包含4000个蛋白质编码基因 和50个RNA编码基因
分枝杆菌分子诊断系统
实时荧光PCR
• 检测样本HBV DNA<5×10²copies/ml时，拷贝数仅供参考， 报告为小于最低检出限
HBV分子诊断方法
HBV -DNA检测（PCR） PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩 增的特异性和敏感度。PCR引物常根据 其S、C、P和X基因中的高度保守序列 来设计。
部分常用的引物序列
扩增位置 P、X基因特 异片段
Ｃ基因特异 片段
Ｃ基因特异 片段
引物Байду номын сангаас列 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’ 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’ 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 5’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’
分子诊断在感染性疾病中的应用
感染的慨念
感染是病原体在宿主的个体内进行有害的复制、繁殖过程 . 病原体:细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫…… 条件致病菌
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
感染性疾病的分子诊断策略
• 一般性策略（检出病原体的DNA/RNA）：
• 中国：50%~70%的人受过感染
，8%~10%是HBV携带者
75%的长期慢性携带者 来自亚太地区
HBV的形态特征
最常见的血清型为adw、adr和ayw 亚型的地区分布不同，我国以adr为主， adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内 蒙古等地
DNA 病毒 双链（非环状）
DNA不等长 正链（2/3） 负链
• 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和 病情预后评价提供客观的依据
• 目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核 病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等
一、感染性疾病的诊断和治疗监测
（一）结核分枝杆菌 （二）肝炎病毒 （三）人类免疫缺陷病毒 （四）HPV病毒 （五）SARS冠状病毒
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、 土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。
➢ 高 效： 同时检测 17 种分枝杆菌（包括TB） ➢ 快 速：＞4周（菌种鉴定） 6 小时 ➢ 灵 敏： 103 个菌/反应
14
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒
基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对
HBV基因组结构
基因重叠
编码 pre-S1 S区 pre-S2 S
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg
pre-C
C区
C
HBeAg HBcAg
P区 P X区 X
DNAP HBxAg
HBsAg
pre-S2
pre-S1
急性感染时期HBV的标志物
HBV 检测窗口期 血清学（HBsAg）：56天 PCR：33天 缩短23天（平均6-15天）
感染方式
呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入 机体
所致疾病
疾病种类多样化
以肺结核为主
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
生物学主要特点： 1.结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质 2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性
实验室诊断现状
分子生物学检测方法
• 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发 展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验 提供了极大的方便，可将诊断时间从几周 降低到几天。
扩增片段大小(bp) 278
477
258
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
• 1．样本处理（样本处理区） • 2．核酸扩增
– 2. 1 试剂配置（PCR前准备区） – 2. 2 加样（样本处理区） – 2. 3 PCR扩增（检测区）
x x x 试剂制备
标本处理
扩增
检测
HBV DNA FQ-PCR（real-time PCR）
• 结果判断：
• FQ-PCR进行HBV DNA的定量检测，检测范围为 2.5×102~2.5×109 copies/ml
• 检测样本中5×102 copies/ml≤HBV DNA≤5×107 copies/ml， 测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数
• 检测样本中HBV DNA>5×107 copies/ml，既可直接报告为 >5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀 释，使其拷贝数落在1×105-5×107 copies/ml范围内，再重 新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正
基因芯片快速检测平台
筛查、鉴别诊断
菌种鉴定
MDR早期诊断
分枝杆菌核酸检测
功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断
➢ 高 效： 一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM ➢ 快 速： 4周（菌培） 3 小时 ➢ 灵 敏： 10 个菌/反应（TB）；102 个菌/反应（NTM）
13
分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）
– 判断有无感染 – 是何种病原体感染 – 常用方法：PCR ＋ 分子探针杂交
• 完整性策略
– 检出病原体 – 分型（分类）－亚型－耐药性 – 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
感染性疾病的分子诊断临床价值
• 分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要 包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治 疗过程中的疗效监测等
➢ 通 量：两个一线抗结核药（MDR） ➢ 速 度：8周（药敏） 6 小时 ➢ 灵敏度：103 个菌/反应
15
病毒性疾病的分子检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）
世界其它地区
亚太地区 75%
• 全世界有3.5亿慢性携带者， 75%在亚太地区
• 每年有一百万人死于HBV感染 ，是全球范围内第9位死因
• 结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反 应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、 基因芯片、基因分型等。
现代分子生物学快速诊断
基因结构 分子诊断
基因组特点
共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌 基因组全长4.4kb,
包含4000个蛋白质编码基因 和50个RNA编码基因
分枝杆菌分子诊断系统
实时荧光PCR
• 检测样本HBV DNA<5×10²copies/ml时，拷贝数仅供参考， 报告为小于最低检出限
HBV分子诊断方法
HBV -DNA检测（PCR） PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩 增的特异性和敏感度。PCR引物常根据 其S、C、P和X基因中的高度保守序列 来设计。
部分常用的引物序列
扩增位置 P、X基因特 异片段
Ｃ基因特异 片段
Ｃ基因特异 片段
引物Байду номын сангаас列 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’ 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’ 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 5’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’
分子诊断在感染性疾病中的应用
感染的慨念
感染是病原体在宿主的个体内进行有害的复制、繁殖过程 . 病原体:细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫…… 条件致病菌
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
感染性疾病的分子诊断策略
• 一般性策略（检出病原体的DNA/RNA）：
• 中国：50%~70%的人受过感染
，8%~10%是HBV携带者
75%的长期慢性携带者 来自亚太地区
HBV的形态特征
最常见的血清型为adw、adr和ayw 亚型的地区分布不同，我国以adr为主， adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内 蒙古等地
DNA 病毒 双链（非环状）
DNA不等长 正链（2/3） 负链
• 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和 病情预后评价提供客观的依据
• 目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核 病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等
一、感染性疾病的诊断和治疗监测
（一）结核分枝杆菌 （二）肝炎病毒 （三）人类免疫缺陷病毒 （四）HPV病毒 （五）SARS冠状病毒
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、 土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。
➢ 高 效： 同时检测 17 种分枝杆菌（包括TB） ➢ 快 速：＞4周（菌种鉴定） 6 小时 ➢ 灵 敏： 103 个菌/反应
14
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒
基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对
HBV基因组结构
基因重叠
编码 pre-S1 S区 pre-S2 S
pre-S1蛋白 pre-S2蛋白 HBsAg
pre-C
C区
C
HBeAg HBcAg
P区 P X区 X
DNAP HBxAg
HBsAg
pre-S2
pre-S1
急性感染时期HBV的标志物
HBV 检测窗口期 血清学（HBsAg）：56天 PCR：33天 缩短23天（平均6-15天）
感染方式
呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入 机体
所致疾病
疾病种类多样化
以肺结核为主
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
生物学主要特点： 1.结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质 2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性
实验室诊断现状
分子生物学检测方法
• 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发 展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验 提供了极大的方便，可将诊断时间从几周 降低到几天。
扩增片段大小(bp) 278
477
258
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
• 1．样本处理（样本处理区） • 2．核酸扩增
– 2. 1 试剂配置（PCR前准备区） – 2. 2 加样（样本处理区） – 2. 3 PCR扩增（检测区）
x x x 试剂制备
标本处理
扩增
检测
HBV DNA FQ-PCR（real-time PCR）
• 结果判断：
• FQ-PCR进行HBV DNA的定量检测，检测范围为 2.5×102~2.5×109 copies/ml
• 检测样本中5×102 copies/ml≤HBV DNA≤5×107 copies/ml， 测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数
• 检测样本中HBV DNA>5×107 copies/ml，既可直接报告为 >5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀 释，使其拷贝数落在1×105-5×107 copies/ml范围内，再重 新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正
基因芯片快速检测平台
筛查、鉴别诊断
菌种鉴定
MDR早期诊断
分枝杆菌核酸检测
功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断
➢ 高 效： 一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM ➢ 快 速： 4周（菌培） 3 小时 ➢ 灵 敏： 10 个菌/反应（TB）；102 个菌/反应（NTM）
13
分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）
– 判断有无感染 – 是何种病原体感染 – 常用方法：PCR ＋ 分子探针杂交
• 完整性策略
– 检出病原体 – 分型（分类）－亚型－耐药性 – 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
感染性疾病的分子诊断临床价值
• 分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要 包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治 疗过程中的疗效监测等