标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4倍，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8（3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I（4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml（7）容量瓶10ml（8）离心机（9）721型分光光度计2．试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量
实验7 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg（20mg）溶于50ml （20ml）95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：称取25mg牛血清白蛋白，加蒸馏水溶解并定容至100ml，将此溶液稀释2.5倍，即为100μg/mL标准液。
4摄氏度保存备用。
3提取液：50mmol/L磷酸盐缓冲液（KPP）pH7.8：称取7.6gK2HPO4和0.89gKH2PO4蒸馏水溶解，定容至1L，调pH至7.8。
50mmol/LKPP（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）四、操作步骤（一）标准曲线的制作3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
(注意应在一小时内完成比色)4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定1、样品的提取：称取植物材料0.2g左右于预冷的研钵中，加入2mL预冷的提取液，研成匀浆，转至10mL离心管中，用提取液冲洗研钵2次（每次1mL），转至离心管中，总体系4mL，此即为蛋白质提取液。
实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
对实验条件进行优化，如调整PH值、反应时间、温度等，以提高实验
结果的稳定性。
03
应用拓展
进一步研究考马斯亮蓝法在特殊蛋白质或不同来源蛋白质测定中的应用，
拓展其应用范围。同时，可以探索与其他蛋白质测定方法的比较研究，
为蛋白质定量分析提供更多选择。
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标准曲线的绘制
加样
将标准蛋白溶液分 别加入相应的试管 中。
测定光密度值
在特定波长下测定 各试管的光密度值， 记录数据。
准备标准蛋白溶液
制备一系列不同浓 度的标准蛋白溶液。
显色反应
向每个试管中加入 适量的考马斯亮蓝 溶液，混合均匀。
绘制标准曲线
根据测得的光密度 值与标准蛋白浓度 绘制标准曲线。
加样
样品稀释
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当稀释，以便 后续测量。
样品标记
对每个样品进行标记，以 便后续结果分析时能够准 确对应。
考马斯亮蓝溶液的配制
准备试剂
储存与使用
按照实验要求准备考马斯亮蓝溶液所 需的试剂。
将配制好的考马斯亮蓝溶液储存于棕 色瓶中，避免光照，使用前摇匀。
配制溶液
将各试剂按比例混合，制备出考马斯 亮蓝溶液。
影响因素
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，PH值、反应时间、温度等因素 可能影响实验结果。
适用范围
考马斯亮蓝法适用于大多数蛋白质的定量测定，但对于某些特殊蛋 白质或不同来源的蛋白质可能存在一定误差。
对实验的改进建议与展望
01
标准化操作
为提高实验准确性，建议对实验操作进行标准化，减少人为误差。
02
优化条件
考马斯亮蓝与蛋白质结合的机制
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究
考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究一、本文概述蛋白质是生命活动的重要承担者，其含量的准确测定对于理解生物过程、疾病诊断、药物研发等领域具有重要意义。
在众多蛋白质测定方法中，考马斯亮蓝法（Coomassie Brilliant Blue，CBB）因其操作简便、灵敏度高、适用范围广等特点而备受关注。
本文旨在深入研究考马斯亮蓝法测定蛋白含量的原理、操作步骤、影响因素及优化策略，以期为实验室研究及实际应用提供有益的参考。
本文将首先介绍考马斯亮蓝法的基本原理，包括其与蛋白质的相互作用及颜色变化的机制。
随后，详细阐述实验操作步骤，包括样品处理、标准曲线的绘制、蛋白质与考马斯亮蓝的结合等关键步骤。
在此基础上，分析影响测定结果的各种因素，如pH值、温度、时间等，并探讨相应的优化策略。
本文还将通过实际案例，展示考马斯亮蓝法在蛋白质含量测定中的应用，并评估其准确性和可靠性。
通过本文的研究，旨在提高考马斯亮蓝法在蛋白质含量测定中的准确性和稳定性，为相关领域的研究和应用提供有力支持。
也希望本文的研究能为其他蛋白质测定方法的发展和完善提供有益的借鉴和启示。
二、材料与方法考马斯亮蓝G-250，蛋白质标准品（如牛血清白蛋白），样品溶液（待测蛋白溶液），95%乙醇，85%磷酸等。
将100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，然后用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀后过滤，4℃保存备用。
将蛋白质标准品配制成不同浓度的溶液，分别取适量体积与考马斯亮蓝G-250染色液混合，室温静置10分钟后，用分光光度计测定各管在595nm波长处的吸光度值。
以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
取适量待测蛋白溶液，加入考马斯亮蓝G-250染色液，混合均匀后室温静置10分钟。
用分光光度计测定吸光度值，根据标准曲线计算待测蛋白溶液中的蛋白质浓度。
如需进一步计算蛋白含量，可根据稀释倍数和取样体积进行调整。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验步骤
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验步骤下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
实验三-考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
思考题
（1）试比较该法与其他几种常用蛋白质定量测定 方法的有缺点。
水产示范中心
实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
一.目的:掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋 理和操作.
二.原理 三.仪器与用具 四.实验试剂 五.实验操作 六 实验报告
白质的原
水产示范中心
二.原理:
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含 量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色， 最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色 素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量 成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
水产示范中心
五.实验操作
1
(蛋白质含量为0～100μg／ mL)的绘制
牛血清蛋白溶液:浓度为100 μ g／ mL,按照表格配制
混合数次，放置5Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋
白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
水产示范中心
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
吸取样品提取液1.0 ml( why?) ，放入 试管中 ，加入
水产示范中心
三.仪器与用具
721分光光度计；10 mL量筒1个；研钵；烧杯；量 瓶；移液管：1 mL 3支，0 1 mL 3支；10 mL具塞 刻度试管14支。
水产示范中心
四.实验试剂
标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质 50溶液：称取100μg考马斯亮蓝G250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸 100 mL ，最后用蒸馏水定容到1000 mL ，贮放在 棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
考马斯亮蓝蛋白质标准曲线
考马斯亮蓝蛋白质标准曲线蛋白质分析是生物化学和分子生物学研究中的重要组成部分，而考马斯亮蓝蛋白质标准曲线是蛋白质浓度测定中常用的方法之一。
本文将介绍考马斯亮蓝蛋白质标准曲线的制备和应用，希望能对相关领域的研究人员提供一定的帮助。
一、制备考马斯亮蓝蛋白质标准曲线。
1. 准备试剂和仪器，首先需要准备好考马斯亮蓝试剂、蛋白质标准品、比色皿、移液器等实验所需的试剂和仪器。
2. 配制标准品溶液，将蛋白质标准品按照一定的浓度稀释，制备出一系列不同浓度的标准品溶液，通常是一个浓度梯度，比如0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml等。
3. 加入试剂并混匀，将标准品溶液加入比色皿中，然后加入适量的考马斯亮蓝试剂，并轻轻摇匀，使其充分混合。
4. 测定吸光度，使用分光光度计或酶标仪测定各个标准品溶液的吸光度，通常在595nm处进行测定。
5. 绘制标准曲线，将各个标准品溶液的浓度和吸光度数据绘制成曲线，通常是一条直线或者二次曲线。
这条曲线就是考马斯亮蓝蛋白质标准曲线。
二、应用考马斯亮蓝蛋白质标准曲线。
1. 测定未知样品的蛋白质浓度，将未知样品的吸光度值代入标准曲线中，根据吸光度和浓度的关系，可以计算出未知样品的蛋白质浓度。
2. 比较不同样品的蛋白质含量，通过测定不同样品的蛋白质浓度，可以比较它们之间的蛋白质含量差异，为后续的实验和分析提供参考。
3. 蛋白质定量，通过考马斯亮蓝蛋白质标准曲线，可以对蛋白质进行定量分析，为蛋白质相关研究提供必要的数据支持。
三、注意事项。
1. 标准曲线的制备要求，在制备标准曲线时，要注意标准品的浓度梯度要合理，吸光度值要在仪器检测范围内，以保证曲线的准确性和可靠性。
2. 实验操作的准确性，在进行实验操作时，要注意各个步骤的准确性和精确性，避免实验误差对结果的影响。
3. 曲线的验证和更新，定期验证标准曲线的准确性，并根据需要进行曲线的更新，以确保其适用性和可靠性。
四、总结。
考马斯亮蓝蛋白质标准曲线是蛋白质浓度测定中常用的方法，其制备和应用对于蛋白质分析具有重要意义。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。
因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm 波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色 的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，，因
此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含
量。
考马斯亮蓝染色法的优点：
（1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测 其最低蛋白质测量可达1mg。 (2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂， 完成一个样品的测定，只需5min左右。 (3)此方法干扰物少 如干扰Lowry法的K+、 Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、
思考题
1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理 是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？ 4.为什么最后要用95%的乙醇来润洗比 色皿？
尽管相对于其他方法来说尽管相对于其他方法来说??尽管相对于其他方法来说此法的干扰物较少尽管相对于其他方法来说此法的干扰物较少此法的干扰物较少此法的干扰物较少但但由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同故故标准品的选择非常重要选择标准品的选择非常重要选择尽可能与待测蛋白尽可能与待测蛋白一致的样品一致的样品做标准能最大限度的提高该方法的做标准能最大限度的提高该方法的准确性
七.补充
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最
常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双 缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法，即 考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中 Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确， 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法 的标准蛋白质。
考马斯亮蓝测定蛋白质
植物总蛋白含量测定
植物总蛋白的测定采用Bradford于1976年建立的考马斯亮兰（Coomassie Brilliant
Blue）染色法。
试剂配制：
1考马氏亮蓝G－250染色液：
称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100毫升85％的磷
酸，用蒸馏水稀释到1升。
2蛋白标准（0.1mg/ml）：
准确称取100.0mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装于
1ml带盖eppendorf管中，-20℃冰箱保存。
3标准曲线绘制（1mg/ml）
按下表操作，在试管中分别加入0、10、20、40、60μl蛋白标准溶液，用水补足到1ml，
加入5ml考马斯亮兰染色液，混匀后在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准
蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
编号 1 2 3 4 5 蛋白标准(ml) 0 0.01 0.02 0.04 0.06
蒸馏水(ml) 1.0 0.99 0.98 0.96 0.94
染色液(ml) 5 5 5 5 5 4 称取一定质量的植物组织，研磨后，加入水冲洗至小试管中，后定容至1mL。
加入5ml
考马斯亮兰染色液，混匀后在595nm波长比色，根据吸光度和标准曲线测定蛋白质
浓度，然后根据所称质量计算出单位质量植物组织的蛋白质总量。
注：（1）考马斯亮蓝为G-250，不是R-250。
（2）植物组织质量具体称取多少，要通过预实验测定。
一般比色时的吸光度值在
0.2-0.8为宜。
蛋白质标准曲线的制作
是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 关键词：马斯亮蓝测定考马斯亮蓝 G-250CoomassiebrilliantblueG-250
蛋白质含量
一、目的 学习和掌握考马斯亮蓝 G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 二、原理 考马斯亮蓝 G- 250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质 含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红 色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含 量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结 合物在室温下 1h 内保持稳定。该法是 1976 年 Bradford 建立，试 剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法还 高 4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为 0～1 0
（2）0~1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取 6 支 10mL 具塞试管， 按表 2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为 0~1 000μ g／mL 的标准曲线。 表 2 高浓度标准曲线制作
2．样品提取液中蛋白质浓度的测定 （1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴 2g 放入研钵中，加 2 mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用 6mL 蒸馏水分次洗 涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置 0.5~1h 以充分提取，然 后在 4 000r/min 离心 20min，弃去沉淀，上清液转入 10mL 容量瓶， 并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。 （2）测定：另取 2 支 10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液 0. 1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入 5mL 考马斯亮蓝 G -250 蛋白试剂，充分混合，放置 2min 后用 1cm 光径比色杯在 59 5nm 下比色，记录光密度 OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品 提取液中蛋白质的含量 X（μg）。以标准曲线 1 号试管做空白。
实验六 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
实验六蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G －250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。
蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8（3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I（4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml（7）容量瓶10ml（8）离心机（9）721型分光光度计2．试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3．材料绿豆芽四、操作步骤1盖上塞子，摇匀。
放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在l h内完成）。
以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。
蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法
Folin—酚试剂法（Lowry法） Folin—酚试剂 中的磷钼酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残 基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）， 在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 该法的灵敏度是双缩脲法的100倍.
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法:染料
主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）
用标准蛋白质为横坐标，用吸光值A595为纵 坐标，作图 ，即得一标准曲线。由此标准曲 线，根据测出的未知样品吸收值，即可查出样 品蛋白质含量。
精选课件
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标准曲线的制作
坐标纸法
电脑软件法
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标准曲线的制作-坐标纸
(1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓 度选择一般应能包括待测样品的可能的最低与最高值， 可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加， 并应与被测液同样条件下显色测定。
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A238
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
-0.2
y = 0.0018x - 0.0125 R 2 = 0.9954
100
200
300
400
500
600
蛋白质浓度/(μg/ml)
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四.注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后 的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间 内颜色最稳定。
Amax = 595nm
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Bradford 法的突出特点:
(1)灵敏度高。其最低检测蛋白质含量可达1mg， 这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色 变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的吸
光系数。
(2)测定快速，简洁，完成一个样品的测定， 只要5分钟左右 。染料与蛋白质结合的过程， 大约只要2分钟,其颜色在1小时内保持稳定 （在5-20分钟之间，稳定性最好）
标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作〔一〕、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%〔W/V〕考马斯亮蓝G—250,4.7%〔W/V〕乙醇，8.5%〔W/V〕H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
〔二〕、器材：1、722S型分光光度计使用与原理〔〕。
2、移液管使用〔〕。
〔三〕、标准曲线制作：1、2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标〔六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug〕，在坐标轴上绘制标准曲线。
1〕、利用标准曲线查出回归方程。
2〕、用公式计算回归方程。
3〕、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4〕、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
〔四〕、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品〔含量应处理在所测范围内〕，依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
〔五〕、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
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标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法
1、凯氏定氮法
2、双缩脲法
3、Folin-酚试剂法
4、紫外吸收法
5、考马斯亮蓝法
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：
1、
2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、
40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6
一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
药品的配制（磷酸缓冲液的配制）
一、药品的配制步骤
（一）、实验准备：
1、准备所需的药品和玻璃仪器。
2、洗涤。
（怎样洗涤算干净？）
（二）、计算：
1、百分比浓度计算：
1)、G/V比
例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。
2）、V/V比：
例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。
取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。
乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。
3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。
2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。
1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。
M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100ml
mM=毫摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g
毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量
3）、0.1uNaCl配100ml
mM=微摩尔数/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg
微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug
3、混合溶液配制的计算：
如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。
注意：1、分别标定体积计算
2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml
（三）、标量：
1、根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液
管。
2、电子分析天平的使用。
（四）、溶解：
1、根据药品配置要求选择溶剂。
蒸馏水，双蒸水，无离子水等。
2、只能用烧杯溶解。
注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤
烧杯三次左右，直到洗涤干净。
小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。
如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。
3、加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。
如:
配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90。
C），过量会糊化。
（五）、定容：
1、用容量瓶定容；
2、用玻璃棒引流或用小漏斗；
3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。
要求刻度与液体凹面相切
为止（眼睛可视）；
4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。
(注意不再定容了，防止溶液漏掉。
) （六）、装入试剂瓶，贴上标签。
标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。
（七）、清理实验场所。
二、磷酸缓冲液的配制。
（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液。
用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液。
选用药品：Na2HPO4·12H2O（碱）和NaH2PO4·12H2O（酸）配缓冲液100ml。
书中说明。
（二）、计算：
1、注：书中有注明配置的量。
2、计算：Na2HPO4·12H2O称取71.64×0.1=7.164g
NaH2PO4·12H2O称取31.21×0.1=3.121g
3、含有不同结晶水的换算。
书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na2HPO4·2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？
11.87=（178/358）×X，X=23.87g。
（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）。
即：0.2M Na2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml。
（四）、按书中的量配制取量再混合。
如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。
（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。
（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可。
计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；
取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。