陈静研究生文献汇报PPT

187例乳腺癌非骨 转移患者里按照 nPAK4表达阳性或 阴性分为两组： 89例阳性，98例 阴性。两组的存 活时间差别不明 显。证明nPAK 4 在NMBC组中的表 达对预后的影响 不明显。
3.2 PAK4与ERα相关
用免疫荧光法 检测ERα阳性 乳腺癌组织中 PAK4的表达情 况。结果显示 PAK4和ERα在 ERα阳性乳腺 癌组织的细胞 核内有明显的 共定位。第二 排图是第一排 图的2.5倍放 大效果。
transactivation: 反式激活，激活因子(如转录、翻译激
活因子等)调控基因表达时，由于蛋白质直接结合或间接
作用，引起基因表达激活或增强的调控作用。本文中ERα
是一种反式激活因子。
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研究背景： 乳腺癌是全世界女性癌症死亡的第二大原因，
乳腺癌对45岁以下妇女的影响呈上升趋势。大约 75%的乳腺癌是雌激素受体α 阳性(ERα )和相关的骨 转移引起的发病率和死亡率的晚期乳腺癌患者。目 前，我们对骨转移的重要组成部分-转化和定向运动 -的理解尚不清楚，目前还没有有效的治疗方法来延 长骨转移患者的生存。
典型的Bli图像 显示肿瘤主要 发生在肺和骨 转移灶内，分 别来自CON组 和PAK4-Lv组。
3.6 核PAK4和LIFR的关系
与对照细胞相比，在对ZR-75-30细胞用E2处理后， PAK4过表达显著抑制了LIFR蛋白和mRNA的表达。 而PAK4的基因敲低导致MCF-7细胞在E2处理或不经E2 处理后，LIFR蛋白和mRNA的表达上调。
PAK4不影响 孕激素受体 A/B(PR A/B) 的活化
RT-qPCR分 析显示PAK4 使MCF-7细 胞中4个ERα 靶基因，包 括CCND 1、 AP-2γ、 Rara-1和 LIFR的表达 显著降低
ChIP实验显示PAK4和 ERα 确实被联合招募 到PS2基因染色质(位 于−3181至−3062)上。
综上所述，这些发现 提示PAK4可能是ERα 乳腺癌细胞中ERα 反 式激活的负调节因子， 这可能通过允许ERα 阴性表型的形成而促 进乳腺癌的进展，从 而增加ERα 乳腺癌细 胞的侵袭性。
3.4 核PAK4逆转哺乳动物细胞E2介导的基因表 达
RNA测序(RNA-Seq)分析用于检 从GEO数据库获得了四套先前公布的微阵
测差异表达基因(DEGs)。图a为分 列数据(GSE 46924、GSE 26834、GSE
别感染了shPAK4或shCtrl的MCF- 8597和GSE 11352)。使用了四个GEO数
7细胞经过E2处理后的RNA序列分 据库中的前250个DEGS，这些数据库都是
析对比。与对照细胞相比，PAK4 由E2调节的。为了进一步筛选nPAK4和E2
p21-活化激酶4(PAK4)癌基因在包括乳腺癌在内 的多种人类癌症中扩增和/或过度表达。在细胞水平 上，PAK4信号调节了许多细胞通路，包括转化、 细胞骨架组织、细胞运动和细胞周期调控。然而， 核PAK4信号在乳腺癌转移中的作用尚不清楚。
3.1 ERα阳性乳腺癌细胞中nPAK4表达增高 与骨转移及不良临床结果的关系
基因敲低的MCF-7细胞有75个 介导的靶基因，用Venn图对重叠的靶基因
DEGS。
进行了鉴定。
将稳定高表达 PAK4(C图)或稳 定敲除PAK4(D 图)的MCF-7细 胞经E2(10−9M) 处理24h后，用 实时定量聚合酶 链反应(RTqPCR)分析细胞 总RNA。分析 显示PAK4过表 达或低表达，逆 转了9种ERα 介 导的基因表达.
PAK4的过表达以剂量依赖性的方式导致上皮标记物E-钙粘蛋白的 减少，并诱导MCF-7细胞在E2刺激下产生间质标记物--Slug。
将一系列递增数量的Flag-PAK4表达质粒分别瞬时 转染McF-7细胞，用E2(10−9M)处理24 h。用实时定量 聚合酶链反应(RT-qPCR)方法对细胞进行PAK4、Slug 和Cdh1的 mRNA的检测和分析。
3.5 核PAK4促进ERα乳腺癌细胞上皮间充质转化
慢病毒 Con或 PAK4感染 MCF-7细 胞的
Transwell 侵袭试验
PAK4过表达明显 增强了非侵袭性 MCF-7细胞通过 基质胶的侵袭能 力。
与功能正常的 PAK 4细胞相比， PAK4缺失的乳腺 癌细胞在跨膜迁 移方面效率较低。
PAK4调节乳腺癌细胞中E-钙粘蛋白和Slug蛋白的表达。
谷胱甘肽S-转移酶 (GST)下拉分析，观 察到PAK4的N端(1201AA)和ERα的DNA 结合区(181-263AA) 是PAK4-ERα相互作 用不可缺少的部分。 结果表明PAK4与ERα 是相关的。
用PAK4抗体或IgG免疫沉 淀MCF-7细胞和ZR-75-30 细胞的裂解液。用免疫 印迹法检测内源性ERα 和PAK4。免疫共沉研究 结果表明，内源性PAK4 与MCF-7和ZR-75-30细胞 内源性ERα相关。
c：果蝇野生型mbt或突 变体mbtP1的异位表达， 再加上gfp报告基因，可
以证明在果蝇组织中表 达的ERα具有反式激活 功能。我们发现，mbt
确实显著降低了配体 （E2）诱导的ERα反式 激活功能(mbtP1驱动不 稳定gfp荧光的表达)， 与此同时mbtP1主要通过 ERα(mbtP1驱动增强gfp 荧光的表达)来增加对 gfp的反式激活(图2C)。 总之，mbt在果蝇眼模 型中以E2依赖的方式抑 制ERα反式激活.
3.3 PAK4是一种新型的配体依赖性ERα反式激
活的核心阻遏物
a：果蝇MBT和它在人类 中的同源物---PAK4。在 MBT和PAK4蛋白中的 PBD（P21结合结构域） 和激酶结构域定位对比。 数字表示氨基酸位置。
b：表达式结构包括由 UAS启动子驱动的人 ERα。报告基因结构包 含了由ERE三个拷贝控 制的GFP报告基因和由 相应的内源性启动子驱 动的白色报告基因。
骨转移性乳腺癌（BMBC 组）的nPAK4表达量明显 高于非骨转移性乳腺癌 （NMBC组）的。
按照ERα 表达阳性或阴 性，把95例骨转移性乳 腺癌患者分为两组，数 据显示在ERα 阳性患者 体内nPAK4表达量高于 ERα 表达阴性者。
两张具有代表性的染 色组织切片图，分别 显示了乳腺癌骨转移 患者体内nPAK4阳 性和阴性情况。
总结
1、首次通过PAK4-ERα-LIFR轴鉴定了核PAK 4在促进ERα乳腺癌的乳 腺骨转移中的作用。nPAK 的高表达可能与ERα乳腺癌患者的侵袭表 型有关，一般来说，PAK4的定位主要在胞浆和核周，PAK4在广泛的 细胞过程[26]中起着关键的作用，包括促进癌细胞的侵袭和迁移。
2、 通过共聚焦成像发现在E2刺激下，PAK4和ERα进入乳腺癌细胞 的细胞核。发现PAK 4降低了ER诱导的果蝇细胞和哺乳动物细胞的反 式激活，PAK4磷酸化的ERα -Ser305和PAK4可能通过干扰ERα 信号 而调节他莫昔芬在乳腺癌患者中的耐药。nPAK4抑制ERα 与DNA结 合，并以E2依赖的方式降低ERα 介导的转录反应。
核PAK4-LIFR轴在ERα 阳性 乳腺癌细胞骨转移中的作用
文献出处
陈静
1
Contents
1
简介
2
方法
32
结果
1
4
讨论
2
摘要： 雌激素受体α (ERα )阳性乳腺癌相关骨转移的机制
尚不清楚.本文报道核p21活化激酶4(nPAK4)是依赖于 17β-雌二醇(E2)的雌激素受体(ERα )介导的反式激活的 新的强烈抑制剂，通过靶向白血病抑制因子受体(LIFR)， 促进α阳性乳腺癌中PAK 4-ERα轴介导的骨转移。
95例乳腺癌骨转移患 者按照nPAK4表达阳 性或阴性分为两组， 54例nPAK4表达阳性 存活时间较短，值为 47.5±4.7个月；41 例nPAK4表达阴性存 活时间较长，值为 73.5±7.1个月。
95例乳腺癌骨转移患者例 里有57例ERα表达阳性患 者，把他们按照nPAK4表达 阳性或阴性再分为两组： 38例nPAK4表达阳性存活时 间较短，值为48.6±6.0个 月；41例nPAK4表达阴性存 活时间较长，值为 71.7±9.7个月。
分别注射对照组和PAK4过表达的MCF-7-Luc-F5细胞的8只 模型裸鼠，尾静脉定时测量乳腺癌细胞骨转移情况的生物发 光成像的代表性图。这证实PAK4的过度表达明显导致在这些 小鼠中，癌细胞较大程度的转移扩散到骨组织。
在PAK4-LV组中， 八个中的六个小 鼠表现出骨致瘤 性，而在对照组 中，对骨没有转 移亲和力。通过 BLI和X线检查证 实乳腺癌向上颌 骨和肱骨的转移。 对PAK4高表达小 鼠的骨切片进行 免疫组化染色。
免疫荧光染色法处理用含有或不含 E2处理后的MCF-7细胞，PAK 4(绿 色)、ERα(红色)、细胞核用 DAPI(蓝色)染色。
用E2处理人MCF-7细胞45分钟后，细 胞核和细胞质里相应的PAK4和ERα的 免疫共沉反应结果，证明了在E2刺激 下，ERα经历了重要的构象变化， PAK4与ERα之间相互作用，形成三聚 体，PAK4/ERα/E2复合物会立即从细 胞质进入细胞核。提示PAK4可能在激 素介导的信号转导中起重要作用。
ef图：Re-Chip分析表明，在 E2存在的情况下，PAK4和 ERα 的复合物被招募到LIFR启 动子的ERE1−4099/−4096 bp和ERE2−4087/−4084 bp 的两个半位点。
g图：在E2存在下，LIFR过表达 (LIFR-lv)可抑制PAK4介导的细 胞侵袭。 h图：LIFR CRYSPR/Cas 9KO增加了敲低表达PAK4的 MCF-7细胞侵袭几率。
3、在裸鼠移植模型中，具有高骨转移潜能的非侵袭性MCF-7乳腺
癌细胞在E2刺激下表达更高水平的PAK4，这可能使这些细胞改变下
荧光素酶检测实验发现：PAK4在很大程 度上抑制了E2刺激ERα 介导的反式激活 功能。
在MCF-7细胞中 PAK4表达的沉默 也导致E2驱动的 ERα 的反式激活功 能增强---提示 PAK4抑制了ERα 的反式激活
雌激素受体 拮抗剂---他 莫昔芬能有 效阻断PAK4 诱导的ERα 转录激活抑 制作用。
对临床乳腺癌标本的评价表明，nPAK4与ERα 表达 有关，与骨转移性乳腺癌预后不良有关。在E2刺激下， PAK4与ERα 结合，从细胞质共转运到细胞核。nPAK4 增强ERα 阳性乳腺癌细胞的体外侵袭能力，促进乳腺癌 的体内转移。
很明显，nPAK4通过靶向骨转移抑制因子LIFR促进 ERα 阳性乳腺癌细胞的转移。引人注意的是，PAK4的 核聚集可能促进侵袭性表型的产生，提示nPAK4是ERα 阳性乳腺癌骨转移的一种新的预测生物标志物。
用对照质粒或增加数量的Flag-PAK4表达质 粒分别瞬时转染பைடு நூலகம்CF-7细胞。 用或者不用 E2(10-9 M)持续处理48小时。用蛋白印记 法检测E-钙粘蛋白、Slug和PAK4的表达。
用shPAK4慢病毒和shCtrl对照组感染 MCF-7细胞3天,用或不用E2处理24h,蛋 白印记法检测PAK4、E-钙粘蛋白和 Slug蛋白的表达。
PKA4： P21活化激酶4，经典的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 在细胞信号转导中起重要作用，并参与多种细胞过程。已证 实在大多数人类癌细胞以及在临床样品中PAK4过表达。
LIFR： 白血病抑制因子受体，是ERα下游靶基因之一。已 被证明具有抑制乳腺癌骨转移的作用
ERα： 雌激素受体α，它与β-雌二醇（E2）形成复合体， 进入细胞核，从而促进新的蛋白质合成，具有引起细胞增殖 的作用。
结果显示PAK4过表达可抑制Cdh1的表达，促进 Slug基因的表达。
3.6 核PAK4对ERα乳腺癌细胞乳腺癌骨转移的影响
采用MCF-7-Luc-F5细胞建立BALB/c裸鼠模型。 用携带PAK4(PAK4-Lv)或对照组(CON)的慢病毒感染MCF-7Luc-F5细胞，每日口服戊酸雌二醇(E2V)。侧尾静脉注入肿瘤 细胞后,注射PAK4-Lv的生物发光成像(Bli)测量显示癌细胞向骨 骼转移。以光子通量定量显示。 相比之下，PAK4的基因敲低并不影响癌细胞在体内的骨转移。