ABO正反定型、RH血型鉴定及ABO血清效价滴定和亲和力试验
实验一ABO正反定型及Rh定型、唾液血型物质检测
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唾液中HAB血型物质测定
【目的】
了解唾液HAB血型物质测定的原理、方法。
【原理】
HAB血型物质也存在于某些人的分泌液中。唾液中 HAB血型物质为半抗原，能特异性地与相应抗体结 合，从而抑制抗体与相应红细胞发生凝集。所以利
用凝集抑制试验，可测定唾液中HAB血型物质，它 有助于ABO亚型的分类及其特殊情况下血型的鉴定
(3)室温轻转动玻片(或鉴定纸板) ，使血清与细胞充
分混匀连续约2min，肉眼观察凝集(溶血)反应。玻片
试验时可用低倍镜观察结果。
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表l ABO血型正反定型结果
试剂血清+受检红细胞 （正定型）
-A -B 受检血型
受检血清+试剂红细胞 （反定型）
Ac Bc Oc
＋－
A
－＋
B
－－
O
＋＋
AB
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【器材】 小试管、滴管、试管架、记号笔、离心机
【试剂】 1. ５％A、B和O型红细胞盐水悬液。 2. 最适稀释度抗血清的制备（标化血清）
【标本】受检者唾液
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1.被检者漱口后留取自然流出的唾液2ml，将留取 的唾液1000g离心，取上清液置于大试管中，煮 沸10min，再离心10min，留取上清液备用。
－＋ － ＋－ － ＋＋ － －－－
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注意事项 1.试剂 2.悬红 3.蛋白 4.溶血 5.冷抗体 6.老年、儿童 7.污染
作业 简述ABO血型鉴定正反不一致的原因
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红细胞凝集强度判断标准 4+ 红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。 3+ 红细胞凝集成大小块，血清清晰。 2+ 红细胞凝块分散成许多小块，血清清晰。 l+ 肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。 ± 镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离
ABO 血型鉴定操作规程
1.0 原理ABO 血型鉴定操作规程2.03.04.05.0 5.1 5.26.0 6.16.2 6.36.4 6.5 6.66.77.0 7.1 根据红细胞上和血清（或血浆）中有无 A 抗原和（或）B 抗原及其抗体，将血型分为A 型、B 型、AB 型及 O 型。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型鉴定 ABO 血型。
正定型正定是指用已知抗-A、抗-B 血清来检测受检红细胞上有无相应的 A 抗原和（或）B 抗原；反定型反定是指用已知 A1型、B 型红细胞来检测受检血清（或血浆）中有无相应的抗-A 和（或）抗-B。
原始样品要求5 mL 静脉全血。
样品容器和添加剂真空试管，EDTA.K2抗凝/普通试管，不抗凝。
检测环境要求温度：18℃～27℃，湿度：30%～70%。
所需材料和设备设备普通离心机、免疫血液学离心机、显微镜、恒温水箱、定时器。
材料抗-A、抗-B 血清、ABO 标准抗原红细胞试剂、移液器、加样吸头、生理盐水（NS）、干净空试管。
检测操作过程将受检标本以 1000g 离心 5min，使标本血浆/血清与红细胞分离，吸取红细胞，用 NS洗涤三次后，配成 3%～5%红细胞悬液。
取 6 支小试管，分别标记“-A”、“-B”、“自身”、“Ac”、“Bc”、“Oc”。
在“-A”、“-B”管中分别加入抗-A 和抗-B 血清各 50 L ，其余管加入受检血浆/血清各100 L 。
在“-A”、“-B”、“自身”管中加入受检者 3%～5%红细胞悬液各 50 L ，摇匀。
在“Ac”、“Bc”、“Oc”管中分别加入 A1、B、O 红细胞试剂各 50 L ，摇匀。
1000g 离心 15sec，轻轻悬浮红细胞，观察结果并记录。
根据实验需要，除室温下观察结果外，另可增加在 4℃、37℃下观察结果。
结果判断凝集强度判断标准见表 1。
表1 凝集强度判断标准表凝集强度4+3+2+1+±-或θMFpHH判断标准红细胞凝集成一大块，液体背景透明，无游离红细胞数个大凝集块，液体背景透明，无游离红细胞有很多小凝集块，液体背景透明，无游离红细胞有许多很小的凝集块，肉眼可见，液体背景不透明，有游离红细胞微小的凝集块，肉眼很难看清，需要用显微镜观察无凝集，无溶血，全是游离红细胞混合凝集外观，镜下可见少数红细胞凝集，而大部分是游离红细胞部分溶血完全溶血7.2 ABO 血型结果判断见表2：正定型抗-A 血清血抗-B 血清血Ac表 2 2 血型结果判断表反定型定Bc Oc自身对照血型＋――＋―＋―＋―＋＋―＋―＋―――――――――ABOAB7.37.48.09.010.0注：“＋”表示凝集或溶血；“―”表示不凝集。
S007红细胞ABO血型(正反定型)、RhD鉴定标准化操作规程
红细胞ABO血型（正反定型）、RhD鉴定标准化操作规程一、目的为保证血液及血液成分的红细胞ABO血型与RhD血型在临床上同型输注，确保临床输血安全、有效，根据《临床输血技术规范》第十五条特制定本标准化操作规程。
二、方法采用微柱凝胶凝集试验检测红细胞ABO血型（正反定型）与RhD 血型。
三、原理将人红细胞血型抗原与相应的抗体发生的凝集反应在微柱检测系统中进行。
微柱检测系统的上端为反应室，将葡萄聚糖凝胶作为凝集反应的介质装入检测卡微柱凝集检测管中，卡片上从左向右顺序第一支至第三支微管凝胶中均分别充以抗A、抗B、抗D单克隆抗体IgM 试剂，检测人红细胞ABO、RhD抗原。
第四支至第六支微管中只有凝胶，第四支微管作阴性对照管，第五支和第六支微管作为ABO血型反定型管。
微柱凝集检测管中的凝胶的间隙起分子筛作用。
凝集反应阳性的红细胞凝决留在微柱凝集检测管的上面或中间，反应阴性未凝集的红细胞将通过凝胶的间隙，沉积在微柱凝集检测管的底部。
四、适用范围适用于输血前患者红细胞ABO血型（正反定型）确认与RhD血型复查。
五、仪器设备普通离心机；血型血清学多用离心机；37℃免疫微柱孵育器；六、试剂1、试剂名称：ABO、RhD血型试剂卡（单克隆抗体）；试剂生产厂家：长春博迅生物技术有限责任公司；批准文号：国药准字S2*******；包装规格：聚丙烯卡12检测人份/盒；贮藏条件；18-25℃避光保存；有效期：自检定合格之日起12个月；试剂单克隆抗体效价：抗A效价≥128；抗B效价≥128；抗D效价≥32；特异性试验合格。
2、试剂名称：人ABO血型反定型用红细胞试剂盒；试剂生产厂家：上海血液生物医药有限公司；批准文号：国药准字S2*******；包装规格：A1、B、O试剂各1支， 10ml /支；贮藏条件；2-8℃保存，不能冰冻；有效期：自检定合格之日起2个月；试剂性能：外观、溶血率%、特异性、抗原性均符合检定规程要求。
七、检测样本要求1、标本类型：静脉血(EDTA抗凝剂:血液=1:10)。
ABO血型鉴定操作规程
ABO血型定型编号：□□□□/J 04-2016操作规程版号；2016-A版第0次修改1.目的；为确保实验结果的准确，特别订本规程。
2.范围；适合进行ABO血型鉴定相关科室的全体工作人员。
3.职责；3.1科主任负责本规程的培训，考核及督促实施。
3.2科室工作人员按文件进行操作并建立相关记录，为实验结果的准确性负责。
3.3全科人员熟练掌握原理及操作。
4.原理根据红细胞表面有无A抗原和B抗原，将血分为A型、B型、O 型和AB型四种。
可利用红细胞凝集试验、通过正、反定型准确鉴定ABO血型。
正定型是用已知抗A和B分型血清来测定红细胞表面有无相应的A抗原或B抗原；反定型是用已知的A型红细胞和B型红细胞来测定血清中有无相应的抗A或抗B。
反定型中使用O细胞是为了检测抗A、抗B以外的不规则抗体。
5,试剂5.1抗-A、抗B分型血清。
5.2～5%、B、O、试剂红细胞。
6试剂的质量控制；6.1每个工作日在实验开始前，对试剂进行外观检查，包括；有效期、有无渗漏等，试剂红细胞无明显溶血。
6.2每个工作日在实验开始前，对所有的抗-A、抗-B、试剂红细胞按《血型试剂确认操作规程》进行特异性验证。
6.3将试剂的厂家、批号及检测结果记录到《血型试剂质量控制记录»中。
7.工作程序：7.1正定型：取洁净小试管2支，分别标记“抗A”、“抗B”，分别滴加抗A、抗B试剂1滴于试管底部，再分别加入受检者2%~5%红细胞1滴，混合。
7.2反定型：另取洁净小试管3支，分别标记“A C”、“B C”、“O C”，各加入受检者血清2滴于试管底部，再分别加入A、B和O型2%~5%试剂红细胞1滴，混合。
7.3以3400转/15秒（或1000转/1分钟）离心将试管轻轻摇动，仔细观察细胞扣有无凝集或溶血现象。
观察结果时既要看有无凝集，也要注意凝集强度，这将有助于亚型等的发现。
8.结果判定:凝集强度的判断依据《红细胞凝集强度判读标准》进行。
血型正定型反定型抗A 抗B A C B C O CA + - - + -B - + + - - O - - + + - AB + + - - -9正反定型不一致的原因；有技术问题或红细胞和血清本身问题，常见者有以下情况；分型血清效价太低，亲和力不强。
卡式ABO正反定型和RhD操作规程
1.方法原理：根据红细胞上有或无A抗原或／和B抗原，将血型分为A型、B型、AB 型及O 型4种。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。
所谓正定型，是用已知抗—A和抗—B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或／和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗-A或／和抗-B。
DiaMed系统采用微柱凝集技术，在微柱中加入凝胶，凝胶的间隙起到了分子筛的作用，通过离心来分离凝集和非凝集的红细胞，从而达到检测目的。
2.仪器：达亚美离心机3.试剂及配套品： ABO正反定/Rh定型卡，达亚美2号稀释液（ID-Diluent2），标准红细胞A1和B。
4.样本要求：4.1血样最好用枸橼酸、EDTA或CPD-A抗凝。
若需要用血清替代血浆进行检测时，应在用前离心，1500g×10min，以免纤维蛋白残余干扰反应结果。
4.2 样本准备：5%样本红细胞制备：压积红细胞25 μl或全血50 μl悬浮于0.5 ml达亚美2号稀释液中。
5.操作程序 :5.1 取50μl A1,B 标准细胞（0.8%）分别加入A1,B管中。
5.2 取50μl 血清或血浆加入A1,B管中。
5.3 取10μl 5% 样本红细胞加入A, B, D, Ctl管中。
5.4离心10 分钟。
判读结果。
记录。
5.5 阳性（＋）：细胞在凝胶表面凝集成一条红线或散布在凝胶中。
阴性（－）：细胞沉积在管底。
双相（d.p.）：既有阳性结果，同时也有阴性结果。
溶血（Hemo）：红细胞溶解，作为阳性结果对待。
5.6 ABO血型判断6.临床意义6．1临床输血：当循环血量不足或大失血或贫血需进行输血治疗，医学教.育网搜集整理在输血前必须先选择血型相同的供血者，再进行交叉配血，完全相同后才能输血。
6.2在皮肤、肾移植等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体。
6.3不孕症和新生儿溶血症病因的分析。
6.4亲子鉴定等。
7.支持性文件：7.1中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程.第二版，东南大学出版社，19977.2 邱艳主编.全血成分血质量要求与血液标准化.中国标准出版社，2003 7.3 刘达庄主编．免疫血液学.上海科学技术出版社，2002.7：128-1377.4王培华主编.输血技术学.人民卫生出版社，第二版，20037.5李勇杨贵贞主编.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.第一版,中国科学技术出版社，1999。
ABO系统血型鉴定(正定型)
ABO系统血型鉴定（正定型）
试验原理：用已知抗体血型试剂，检查红细胞上的未知抗原。
1、20%—30%悬浮红细胞的配制：
取压积红细胞4滴，加1ml生理盐水。
2、正定型—玻片法：
①在正定型玻片两端分别加入待测者的20%—30%悬浮红
细胞各1滴，再加入已知相应抗体血型试剂各2滴。
②摇动玻片数次，5分钟后观察结果。
③如有怀疑者，须做试管法对照和显微镜观察。
3、正定型——试管法：
①取2支小试管分别注明:抗A、抗B。
②分别加入相应血型试剂一滴，再加待检者2~4%红细胞悬
液一滴。
③离心3000rpm/15秒或1000rpm/分钟。
④取出轻轻摇动，肉眼观察有无凝集。
⑤报告方式：待检者XXX红细胞鉴定血型为X型。
ABO、Rh-血型鉴定
2021/4/27
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盐水法操作程序： 1、取小试管2支，标明主、次侧。主侧：受血者血清2滴
加供血者3～5%生理盐水红细胞悬液1滴；次侧：供血 者血清2滴加受血者3～5%生理盐水红细胞悬液1滴。 2、混匀，以1000r/min，离心1min，取出，先目测上层液 体是否溶血，再轻轻摇动试管，检查红细胞是否凝集。
2021/4/27
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Rh(D)血型定型
目的：鉴定红细胞表面是否含有D抗原。 适用范围：受血者、献血者Rh(D)血型鉴定 使用器材和材料：Rh抗(-D)标准血清、吸管、玻片等
2021/4/27
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方法：玻片法
原理：根据抗D抗体与对应红细胞抗原的凝集 反应，区分Rh(D)阳性和Rh(D)阴性。
2021/4/27
结果判断：与盐水法相同。
2021/4/27
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注意事项：
1、用EDTA抗凝血浆代替血清配血，但不能用肝 素抗凝血配血，因为肝素对聚凝胺有中和作用。
2、病人使用肝素后要加双倍量聚凝胺。 3、聚凝胺试剂使用前应恢复至室温。 4、和试剂比例要恰当，增加血清（浆）和红细胞
量时，LISS及聚凝胺、重悬液的量也要增加，否 则，灵敏度会降低4～8倍。
2021/4/27
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血型凝集示意图
抗-
抗-A
抗（-D）
B
抗-
抗-A
抗（-D）
B
抗-
抗-A
抗（-D）
B
2021/4/27抗-
抗-A
抗（-D）
血型：AB型 Rh(D)：阳性
血型：B型 Rh(D)：阴性
血型：A型 Rh(D)：阳性
血型：O型 Rh(D)：阳性
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反定法（试管法）
实验十五 ABO血型鉴定
实验十五 ABO血型鉴定一、正定型法【目的】掌握用盐水介质法进行ABO血型系统(ABO group)正定型(direct typing)的原理、操作方法和结果判断。
【原理】用已知的IgM类特异抗体（标准血清）与被检红细胞在室温条件下、盐水介质中反应，根据红细胞是否出现凝集现象来测定被检红细胞膜上有无与血型抗体相对应的抗原，从而判断和鉴定被检者的血型。
【器材】1. 1.小试管、记号笔、蜡笔、试管架。
2. 2.尖滴管、胶吸头。
3. 3.吸管、吸耳球。
4. 4.载玻片或有凹槽的玻璃板或白瓷板。
5. 5.离心机。
6. 6.显微镜。
【试剂】1．标准抗A、抗B血清（商品）分为人血清ABO血型抗体和人ABO血型单克隆抗体，要求如下：（1）人血清ABO血型抗体：①特异性高。
②凝集效价：抗A不低于1∶128 ，抗B不低于1∶64。
③亲和力：反应开始15s内即出现凝集，3min时明显凝集，血凝块大于1mm2。
④稳定性高。
⑤已灭活补体。
（2）人ABO血型单克隆抗体：①特异性：抗A抗体特异凝集具有A型红细胞抗原的A1、A2、A1B、A2B；抗B抗体只凝集含B抗原的B和AB型红细胞。
②亲和力：以开始反应到出现凝集的时间表示抗血清的亲和力，国家标准是抗A对A1、A2、A2B分别为15s、30s、45s；抗B对B型红细胞为15s。
③凝集效价：国家标准是抗A1、抗B均大于1∶128。
④稳定性：较人血清抗体的稳定性低。
2．生理盐水。
【标本】抗凝静脉血或末梢血。
【操作】制备被检者5％红细胞生理盐水悬液：抗凝血离心或红细胞自然沉降后取试管下层的红细胞2滴于小试管中，加入生理盐水2ml，用尖滴管将红细胞与生理盐水充分混匀。
2 500r/min离心3 min 后弃去上清液，重复洗涤3次。
自管底吸取1滴压积红细胞加入19滴生理盐水中混匀，此即为5％的红细胞生理盐水悬液。
操作示意见图4-1。
图4-15％红细胞生理盐水悬液制备操作示意图1．玻片法（1）标记玻片或白瓷板：取洁净的载玻片或白瓷板1块，用蜡笔画出小格，标明抗A、抗B。
ABO疑难定型
ABO疑难定型一、 ABO疑难血型判断的方法（一）正反定型：正定型： -A, -B ， -AB, -H, -A1反定型： Ac, Bc, Oc,自己比较1.ABO正定型中各种试剂用途疑难定型中正定型用抗血清抗-A 及抗 -B抗-AB: 确认弱 A 和弱 B 抗原 , 与弱 A 及弱 B 抗原亲和力强 , 会产生强反应抗-H: 用于检查亚型及孟买型 , A 亚型红细胞上的 H 抗原多于正常 A 型抗-A1: 用于 A 亚型 ( 如 A2, A3) 检测2.H抗原在红细胞上的分布3.ABO反定型中各种试剂的用途反定型中试剂红细胞的意义A及 B细胞 : 确认抗 -A 或抗 -B 抗体O型红细胞 : 检查可否存在ABO系统以外抗体搅乱ABO反定型自己比较 :用于确认正反定型结果的有效性, 消除自己抗体对定型的搅乱( 如冷凝集等 )A2细胞 :用于亚型的判断,特别是在思疑是 A 亚型且又存在抗 -A1 抗体的情况下（二）型物质测定型物质准备： 1~2ml 唾液，开水煮10 分钟，离心后获得的上清。
标清的调制：标清用盐水稀释至其效价为1：16中和：将 0.5ml 型物质与调制后的标清0.5ml 等体积混杂 , 室温放置 30 分钟检测：用 Ac 检测中和后的抗-A, Bc检测中和后的抗-B.结果判断：若是抗-A 被中和，则被检者为 A 型，若是抗 -B 被中和，则被检者为B 型。
每隔（三）吸取放散吸取用 RBC：盐水冲洗 5 次的被检者压积RBC 1ml。
吸取用的标准血清将压积 RBC和标清按等体积比率混杂，在相应的温度条件下（15 分钟混匀一次4℃）孵育 1 小时，用盐水冲洗孵育后的细胞 6 次，获得压积RBC，加入等量盐水。
56℃水浴震荡10 分钟，离心获得上清即为放散液。
用标准试剂红细胞检测放散液。
（四） O型精选红细胞的应用抗原组成 : 三组合细胞 , 要求必定具备全部的Rh因子I: O型R1R1(CDe/CDe); II:O型R2R2(cDE/cDE); III: O型rr(cde/cde)用途 :用于受血者、献血员及孕产妇等的ABO系统以外不规则抗体的精选目的 :在配血从前,有针对性、按比率的去搜寻与带有抗体的病人相当合的血（五）自家冷凝集血样的ABO定型正定型用红细胞的准备:血样采集后 , 马上离心 , 获得压积红细胞用 37℃温盐水冲洗红细胞45℃热放散 3 分钟巯基试剂办理 :破坏IgM抗体自家冷凝集血样的ABO定型反定型用血浆或血清的准备血样采集后放置4℃冰箱静置24 小时 , 使红细胞充分吸取自己冷凝集抗体用自己红细胞吸取去除自己冷抗体用 O型红细胞吸取去除ABO系统以外的非特异性及特异性抗体（六）获得性B1.获得性 B 及多凝集现象获得性 B:肠凌乱及感生病人 , 细菌酶影响 A 抗原的受体肠内壁通透性增加 , 此后细菌多糖吸附在红细胞表面多凝集现象 : 异常或变形的 RBC被全部正常人的血清凝集( 微生物酶作用裸露或激活膜隐蔽受体多凝集血样中的血清不与自己反应)2.获得性 B 产生的主要机理二、 ABO正反定型不符的问题解析（一） ABO定型问题经常发生的情况为：1.明显缺失应该出现的抗 -A 或抗 -B ：(1)再生儿血样(2)免疫弊端、免疫凌乱(3)前带现象(4)血型型物质过多(5)抗原太弱，老例方法检查不出来，相应血清中无抗体(6)亚型，反应是混杂视野2.由于试剂被污染，或试剂中有额外抗体3.明显多出抗原 ( 或多出抗体 )(1)亚型，如 A2型可能血清中有抗 -A1(2)自家凝集(3)获得性 B（二）引起ABO正反定型不一致的原因解析1.技术因素：(1)试剂储藏不当(2)使用技术错误(3)使用错误的试剂(4)使用污染或无效的试剂(5)离心速度不当2.存在 IgM 性质的自家冷抗体由于自家冷抗体 ( 冷凝集病 ,CHD)而以致自家溶血的病人，在低于 37℃时血细胞自觉凝集，影响正反定型。
输血科ABO血型鉴定操作规程
ABO血型鉴定标准操作规程【目的】正确鉴定血型，保障患者的输血安全。
【范围】所有送检需要鉴定ABO血型的标本。
【职责】配发血室负责临床患者的血型鉴定。
【原理】根据ABO血型分类原则，即红细胞上带有什么抗原就称什么血型、同一个体内抗原与抗体互补。
根据含某抗原的红细胞与含相应抗体的血清混合可使红细胞发生凝集，反之不发生凝集的原理，利用分型血清或分型红细胞鉴别血型，前者称为正定型（又称红细胞定型），后者称为反定型（又称血清定型）。
通过正反定型可准确鉴别ABO血型。
【标本采集和处理】1、标本采集：EDTA-K2或EDTA-K3抗凝静脉血2mL。
标本保存：室温放置不超过6小时，4℃保存不超过72小时，无溶血,无凝块及明显乳糜。
【设备与试剂】1、人ABO血型反定型用红细胞试剂盒①包装规格：每盒内装有Al,B,0试剂各1支，IOml/支②主要组成成分：Al型、B型、。
型红细胞。
③储存条件及有效期：2-8°C储存，不能冰冻；有效期2个月。
2、ABO>RhD血型检测卡（微柱凝胶）①包装规格：2人份/卡，12卡/盒。
②储存条件及有效期：18-25℃避光保存，自检定合格之日起12个月。
3、抗A抗B血型定型试剂（单克隆抗体）①包装规格：10ml。
②储存条件及有效期：2-8℃避光保存；储存条件下有效期为24个月。
4、红细胞悬液：取标本离心后压积红细胞与生理盐水配制（试管法为3%-5%；微柱凝胶法为0∙5%-0∙8%）.5、BaSo2005-2>BaSo2002-2型医用低速离心机：珠海贝索生物技术有限公司。
6、TD-3A型血型血清学用离心机：长春博研科学仪器有限责任公司。
【操作步骤】1、试管法①正定型：a）取洁净小试管（内径IOnIm义60mm）3支，分别标明抗-A,抗-B。
b）抗-A,抗-B管中分别按标记加入相应抗体血清1滴，并加入受检者3%~5%红细胞悬液1滴，混匀。
c）放入BaSo2002-2型离心机以3400r∕min离心15秒。
20ABO血型鉴定标准化操作规程
ABO血型鉴定标准化操作规程1.检测原理：根据红细胞上有或无A抗原或/和B抗原，将血型分为A型、B 型、AB型及O型4种。
可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。
所谓正定型，是用已知抗-A和抗-B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或/和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗-A或/和抗-B。
2.标本采集与处理2.1受检者的准备病人不需空腹，根据病情随时可抽血检测。
2.2静脉采血除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。
一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。
2.3 标本的处理血标本室温放置30min～45min（或在37℃水温箱放置20分钟）后离心分离血清，置洁净试管加盖低温（4-8℃）保存。
3. 试剂和材料3.1抗A、抗B血型定型试剂。
（单克隆抗体）3.2 献血员5%红细胞盐水悬液；3.3 受检者血清；3.4 受检者5%红细胞盐水悬液。
4.方法4.1玻片法：4.1.1取清洁玻片1张（或用白瓷板1块），用蜡笔标明抗-A、抗-B，分别用滴管滴加抗-A、抗-B分型血清1滴，再各加受检者5%红细胞悬液1滴，混和。
4.1.2取洁净玻片一张（或白瓷板1块）用蜡笔标明A细胞、B细胞，然后分别滴加受检者血清1滴，再分别用滴管滴加A、B红细胞悬液1滴。
将玻片不断轻轻转动，使分型血清与红细胞充分混匀。
连续15min，以肉眼观察有无凝集（或溶血）反应。
4.2试管法4.2.1 取洁净小试管2支，分别标明抗-A 和抗-B，分别滴加抗-A和抗-B分型血清各1滴于试管底部，再用滴管分别加入受检者5%红细胞悬液1滴，混和。
4.2.2 另取洁净小试管2支，分别表明A、B细胞。
用滴管分别加入受检者血清1滴于试管底部，再分别滴加入A、B型5%试剂红细胞悬液1滴，混和。
4.2.3 立即以1000r/min离心5min。
4.2.4 将试管轻轻摇动，使沉于底部的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集（或溶血）现象。
血型鉴定
ABO血型试验(正反定型)一原理利用红细胞凝集试验，通过正反定型准确鉴定ABO血型。
二试剂和材料1．抗-A（B型血），抗-B（A型血）及抗-A+B（O型血）分型血清。
2．5%A、B及O型试剂红细胞盐水悬液。
3．受检者血清。
4．受检者5%红细胞盐水悬液。
三操作（玻片法）1．取清洁玻片一张，用蜡笔划成方格，标明抗-A、抗-B和抗-A+B，分别用滴管滴加抗-A、抗-B和抗-A+B分型血清1滴于方格内，再加受检者2%红细胞悬液1滴，混合。
2．另取清洁玻片一张，用蜡笔划成方格，标明A细胞、B细胞和O细胞，用滴管各加受检者血清1滴，再分别用滴管加A、B和O型试剂红细胞悬液1滴。
3．将玻片轻轻转动，使血清与细胞充分混匀，连续约15min，以肉眼观察有无凝集反应。
也可用低倍镜观察结果。
四结果判定：见表1表1 ABO血型正反定型结果五注意事项1．试管、滴管和玻片必需清洁干燥，防止溶血。
2．操作中应先加血清后加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。
3．为防止冷凝集现象的干扰，一般在室温内进行试验。
4．标准抗血清必须符合标准，不要长期放在室温，以免污染和孳长细菌，等渗生理盐水必须等渗、新鲜、无微生物孳生。
5．观察结果要仔细，微弱凝集、或肉眼观察未凝集的标本，要用显微镜观察。
注意特异性凝集与继发性血液凝固、串钱状形成和异物的区别。
六血型鉴定中常见的假阳性反应1．红细胞串钱形成：红细胞相互重叠，连接成串，象一串重叠的钱币，称为串钱形成，又称假凝集。
可见于血浆蛋白紊乱、血沉加快的各种病例或实验中温度过高，作用时间过长，致水分蒸发，血清浓缩。
可在观察结果前，再加等渗盐水1滴，彻底混匀，串钱状红细胞因血液稀释而散开。
也可用高倍镜仔细观察凝集块的形态和用洗涤后和红细胞配制悬液。
2．寒冷凝集：在较低温度出现的凝集称为寒冷凝集。
多数正常人的血清在0~2ºC 时能凝集本人的红细胞，又称自家凝集。
这种凝集是可逆的，在0-2ºC时作用最强，20ºC时可消失。
血型血清学试验带教步骤
血型血清学试验带教步骤重庆市血型血清学规范化培训班试验内容一组带教教员杨民主管技师陈瑛技师陈敏技师一. ABO血型正反定型二. Rh(D)抗原鉴定三. 交叉配血；一、ABO血型鉴定ABO血型系统正反定型，要求做玻板法与试管法。
1.玻板法：(1)取洁净玻板，用记号笔在正定型一侧注明抗-A、抗-B、抗-A（B）,反定型一侧孔中注明A细胞、B细胞、O细胞，标记待检者姓名。
(2)在正定型一侧孔中先加入相应试剂血清1滴，再加入待检者20%～30%红细胞悬液1滴；在反定型一侧先加入待检者血清2滴，再加入相应20%-30%标准红细胞1滴(取3-5人份的混合红细胞洗涤一次配成20%-30%红细胞混悬液) (3)摇动玻板数次5min后观察结果，如有怀疑须做试管法对照。
报告方式: 待检者某某红细胞鉴定血型为×型。
2.试管法：（1）检查前整理检验台、试管架上只放待检者标本，查对标本与化验单是否相符。
（2）取6支试管（10×75mm），写上待检者姓名，3支用于正定型，分别注明抗-A、抗-B、抗-A(B)；3支用于反定型，要求标准悬浮红细胞用生理盐水配成2-4%，（洗涤1次的压集红细胞1滴加盐水1ml）。
分别注明A细胞、B细胞和O细胞。
（3）正定型试管中分别加入相应血型试剂1滴，再加待检者2-4%红细胞悬液1滴。
（4）反定型试管中分别加待检者血清2滴，再加相应的2-4%红细胞悬液1滴。
（5）将6支试管以3000rpm离心15s或1000rpm离心1min。
（6）取出轻轻摇动，肉眼观察红细胞有无凝二、Rh(D)抗原鉴定要求做玻板法与试管法1．玻板法：取洁净玻板一块，用记号笔在左侧注明待检姓名，另两孔注明阴性、阳性对照；将室温盐水反应的抗-D血清各加一滴于上述相应的孔内，1孔加入待检者20-30%红细胞悬液一滴，另两孔分别加Rh(D)阴性、Rh(D)阳性20-30%红细胞悬液1滴；用干净玻棒搅拌红细胞悬液和血型试剂充分混合；连续轻轻倾斜转动玻板，一般在5min内观察结果，或按试剂说明书规定的时间观察结果。
ABO血型的鉴定方法
软组织（皮肤、浅筋膜、皮神经、浅血管）
检测方法：吸收试验 解离试验 混合凝集 免疫组化（ ELISA ）
• 吸收试验：当被检材料分别于已知的抗A、抗B标准血清充分作用后，血清中 凝集素就与备件材料中相应抗原相结合，使血清中凝集素减少乃至消失，该 血清再遇已知的响应红细胞则不再出现凝集，或凝集大为减弱。从而可以推 断检材中所含的抗原，以确定血型。 注意：做吸收实验用的抗A和抗B两种抗血清，其效价（估计）必须与检材中 所含凝集原的量相适应。
• 根据操作方法的不同,主要分为3种方法： • ①玻片法
• ②试管法:
• ③全自动微板法:
玻片法
• 根据标准抗体血清与待测红细胞(或标准红细胞与待测血清)在干燥玻 片上是否发生凝集反应来确定待测红细胞(待测血清)血型。
• 它仍然是目前临床常用的血型鉴定的初筛试验方法,具有操作简便,节 省材料的优点。
软化---生理盐水中2小时，晾干 脱脂---丙酮或乙醇脱脂 压碎---加大抗血清接触的面积 检测方法：解离试验
混合凝集试验
骨及牙检验 预处理：用手术刀刮净骨表面和牙齿表面的污垢物，用蒸馏水冲洗2次，
紫外线照射1小时后，用锤子将牙齿砸碎成粉末，或用电钻取出骨粉。
检测方法：骨粉经乙醇脱脂后，分别粘在透明胶布上-----解离试验。
• 但弱凝集反应需要借助显微镜观察确定. • 步骤：①清洁玻片一张（或白瓷版一块）。标明抗Ａ、抗Ｂ和抗Ａ、
Ｂ,分别用滴管滴加抗Ａ、抗Ｂ和抗Ａ、Ｂ分型血清1滴，再加受检者 3％～5％红细胞悬液1滴，混合。②另取洁净玻片一张（或白瓷板一 块）。标明Ａ细胞、Ｂ细胞和Ｏ型试剂，分别加红细胞悬液1滴。③ 将玻片（或白瓷板）不断轻轻转动（在室温18～22℃），使血清与细 胞充分混匀连续约15分钟，以肉眼观察有无凝集（溶血）反应。如以 玻片试验时，也可用低倍镜观察结果。
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性仅次于ABO血型系统。
D抗原是Rh抗原中免疫性最强的抗原，通过输血和妊娠，50%～ 75%的Rh阴性的个体，可因D抗原阳性红细胞免疫而产生抗D，并 可导致严重的溶血反应。 受血者或孕妇血浆中如含有Rh抗体，在输入含相应抗原的血液后， 将引起严重的溶血性输血反应或新生儿溶血病，以抗D与D红细胞尤 为显著。IgG类的Rh抗体，由于能通过胎盘，从而破坏胎儿有相应 抗原的红细胞，引起新生儿溶血病。
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注意事项
1.严格标记 摇动玻片动作要轻 2.所有器材干燥清洁、防止溶血，避免交叉污染 3.血型试剂平衡至室温再使用，用后尽快放回冰箱
4.玻片法注意防止干涸，以免误判为凝集
5.试管法 若溶血表明有补体激活（应区别标本采样等其它
因素引起的溶血），视为凝集
6.防止冷凝集素干扰，室温（20-24℃）下试验
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血型输血实验一
ABO正反定型 ABO血清效价滴定和亲和力试验 Rh血型鉴定
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实验目的
重点掌握ABO血型正反定型的原理、方法、 临床意义 熟悉效价滴定和亲和力实验 熟悉Rh血型鉴定的原理、方法、临床意义
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ABO血型正反定型 原理
用已知特异性的抗体检测试剂检查红细胞的抗原 （forward typing，正向定型或红细胞定型） 用已知血型的试剂红细胞检查血清中的抗体 （reverse typing， 反向定型或血清定型）， 结合正反定型来判断红细胞的ABO血型
5.观察结果 观察上层有无溶血 管底有无凝集 再用低倍镜观察
reverse typing（serum typing） AC BC + — + — + + — —
Testing result
O A B AB
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ABO blood group
blood group A B O AB antigen in red blood cell A B — A、B antibody in serum anti-B anti-A anti-A,anti-B —
—
+ — +
—
— + +
O
A B AB
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反向定型
试管法
1.制备2％标准红细胞生理盐水悬液 1d已知血型RBC+49d生理盐水 混匀 2.分离血浆 2500r/min 3min 3.取两支试管分别标记A1、B，加入待检血浆各2d
4.将A1、B型标准红细胞生理盐水悬液1d加入相应标记的试管 混 匀 1000r/min 30sec
的效价，也就是血清中所含抗体的浓度
亲和力试验是指该血清中抗体与相应红细胞发生
凝集的强度与速度
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效价滴定
试管号 生理盐水（ml） 抗A血清（ml）
1
2
3
4
5
6
7
8
9(空白)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃去
2％A红细胞（ml） 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 最后稀释度 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512
混匀 1000r/min 2min 观察结果 ++++ 凝集成大块，几乎无游离红细胞 +++ 凝集块稍小，有少量游离红细胞 ++ 凝块更小，游离红细胞占1/2 + 细小凝块，游离更多
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注意事项 1. Rh血型系统的抗体多由后天免疫刺激（主要 是输血或妊娠）而产生，故不需做反定型 2.若为阴性反应，应进一步做Rh阴性确认试验。 用抗D、E、C、c、e（IgG+IgM）混合型血 清定型试剂鉴定待测红细胞上的全部Rh抗原
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临床意义
Rh血型系统是当前发现的红细胞血型系统中最复杂的一个，其重要
凝集程度++时对应稀释度的倒数为该抗体的效价
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亲和力试验 已知抗体待测血清1d于玻片上，10％相应红细 胞生理盐水悬液2d加于血清液滴旁（不相接触） 玻棒混合两者，同时开动秒表，轻转玻片，混匀 记录出现凝集时间和3min时凝块大小 （要求15s内开始凝集，3min时凝块>1mm2）
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Rh血型鉴定
原理
单克隆混合试剂检测法 用Rh各抗血清（IgM+IgG型）试剂通过凝集 反应对红细胞上Rh抗原进行鉴定。
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试管法
1.试管内加1dRh抗血清试剂 2.加1d待测血 3.轻轻混合，离心。
4.观察试管底并轻摇重悬，观察有无凝集
Com片法 1.标记玻片 将玻片分为两区分别标记抗A、抗B 2.在相应区域滴加抗A/抗B试剂1d 3.滴加血液各1d，不断轻摇玻片，充分混匀，2min内判 断结果
forward typing（cell typing） anti-A anti-B Testing result
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临床意义 ABO血型系统，是迄今为止发现的最具临床价值 的一个血型系统，它将人的红细胞分成A、B、O 和AB四种血型，是输血医学和器官移植中最重要 的血型系统之一。
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ABO血清效价滴定和亲和力试验 原理
将标准血清用生理盐水经最大倍数稀释与相应的
红细胞抗原发生一定强度以上的凝集即为该血清