反胶束萃取及其应用
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• 反萃取技术对脂肪酶的高效纯化
Efficient lipase purification using reverse micellar extraction 目标函数：纯化度，回收率 变量：表面活性剂的类型和浓度，pH，离子强度，有机相/水相比例
原始脂肪酶培养基pH对回收率和纯化度的影响
盐浓度对回收率和纯化度的影响
产生背景
• 传统萃取方法（如溶剂萃取）难应用于蛋白质的 分离，原因： 1.大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，与有机溶 剂接触，也会引起蛋白质的变性 2.萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷， 普通的离子缔合型萃取剂很难起作用
• 反胶束萃取
反胶束
• 正常胶束：表面活性剂溶于水中, 当浓度超过临界 胶束浓度(CMC)时, 就会聚集在一起而形成正常胶 束，亲水基向外、疏水基向内。 • 反胶束: 当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶 束浓度(CMC)时, 其分子在非极性溶剂中自发形成 的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核的多 分子聚集体。
反胶束的制备
• 注入法：将含蛋白质的水溶液直接注入到含表面 活性剂的非极性有机溶剂中，然后进行搅拌直至 形成透明溶液为止（过程较快、可控制平均直径 和含水量）。 • 相转移法：将含蛋白质的水相和含表面活性剂的 有机相接触，在缓慢搅拌下，一部分蛋白质转移 至有机相中。（过程较慢，处于稳定的热力学平 衡状态和获得较高的蛋白质浓度）。 • 溶解法：对非水溶性的蛋白质可用此法。将含有 反胶束的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌时 蛋白质进入反胶束中（需较长的时间）。
食品科学 2011, 32(21): 214-217
反胶束萃取的应用实例
• 混合反胶团萃取α-淀粉酶
以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和脱水山梨醇单硬脂酸酯聚氧乙烯醚 (Tween-60)为混合表面活性剂溶于正丁醇 - 异辛烷中构成反胶团系统，萃 取纯化α- 淀粉酶
食品科学 2011, 32(21): 214-217
反胶束萃取的应用实例
• 混合反胶团萃取α-淀粉酶
以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和脱水山梨醇单硬脂酸酯聚氧乙烯醚 (Tween-60)为混合表面活性剂溶于正丁醇 - 异辛烷中构成反胶团系统，萃 取纯化α- 淀粉酶
Bioresource Technology, 2012, 108:224–230
反胶束萃取的应用实例
结论： 1.反胶束萃取技术可以实现 2.脂肪酶的高效纯化及回收 3.纯化倍数：15倍 回收率：80%
V水相/V有机相对回收率和纯化度的影响
参考文献
[1]刘俊果,邢建民,畅天狮,刘会洲.反胶团萃取分离纯化纳豆激酶[J]. 科学 通报，2006, 51(2): 133-137.
[2]高树刚,宋伟明,安红.混合反胶团萃取α- 淀粉酶[J]. 食品科学, 2011, 32(21): 214-217. [3] Wang W, Weber M E, Vera J H. Reverse Micellar Extraction of Amino Acids Using Dioctyldimethylammonium Chloride[J]. Ind. Eng. Chem. Res. 1995,34: 599-606. [4] Gaikaiwari R P, Wagha S A, Kulkarni B D. Efficient lipase purification using reverse micellar extraction[J]. Bioresource Technology, 2012,108: 224– 230.
Bioresource Technology, 2012, 108:224–230
反胶束萃取的应用实例
• Baidu Nhomakorabea萃取技术对脂肪酶的高效纯化
Efficient lipase purification using reverse micellar extraction 目标函数：纯化度，回收率 变量：表面活性剂的类型和浓度，pH，离子强度，有机相/水相比例
与目标蛋白质有关的因素
蛋白质的等电点 蛋白质的大小 蛋白质的浓度 蛋白质表面的电荷分布
与水相有关的因素
pH值 离子种类 离子强度
与环境有关的因素
系统温度 系统压力
反胶束萃取的优点
• • • • 成本低，溶剂可反复使用 萃取率和反萃取率高 解决蛋白质变性、降解的问题. 从完整细胞中提取蛋白质和酶
具有工业开发前景的蛋白质分离技术
反胶团溶解蛋白质模型
• • • • 1.水壳模型（普遍接受） 2.蛋白质疏水部分直接与有机相接触 3.蛋白质吸附在反胶团内壁 4.蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏 水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”
反胶团溶解蛋白质机理
• 反胶团的极性内核在溶解了水后, 在内核中形成“微水池”, 可以进 一步溶解蛋白质等生物活性物质。 • 屏蔽作用使蛋白质不与有机溶剂 直接接触, 而水池的微环境又保护 了其活性, 从而达到了溶解和分离 目的
反胶团溶解蛋白质过程
蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程
蛋白质 表面活性剂
静电作用 变形 含有蛋白质的反胶束
改变水相条件（pH、离子种 类和强度）使蛋白质由有机相 返回水相，实现反萃取过程.
扩散进入有机相 蛋白质萃取
反胶束萃取的影响因素
与反胶束团有关的因素
表面活性剂的种类 表面活性剂的浓度 表面溶剂的种类 助表面活性剂及其浓度
反胶束萃取体系
• 单一反胶束体系： 阴离子型：AOT(丁二酸- 2 - 乙基已基酯磺酸钠)/ 异 辛烷 阳离子型：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 、二辛基 二甲基氯化铵等季铵盐 非离子型：能使反胶团变大, 从而可萃取相对分子质 量更大的蛋白质
• 混合反胶束体系：两种或两种以上表面活性剂构成 的体系，蛋白质的分离效率更高
加入15%异丙醇后，不同浓度NaCl对回收率和 纯化度的影响
反萃取过程中，pH对回收率和纯化度 的影响
Bioresource Technology, 2012, 108:224–230
反胶束萃取的应用实例
• 反萃取技术对脂肪酶的高效纯化
Efficient lipase purification using reverse micellar extraction 目标函数：纯化度，回收率 变量：表面活性剂的类型和浓度，pH，离子强度，有机相/水相比例
Efficient lipase purification using reverse micellar extraction 目标函数：纯化度，回收率 变量：表面活性剂的类型和浓度，pH，离子强度，有机相/水相比例
原始脂肪酶培养基pH对回收率和纯化度的影响
盐浓度对回收率和纯化度的影响
产生背景
• 传统萃取方法（如溶剂萃取）难应用于蛋白质的 分离，原因： 1.大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，与有机溶 剂接触，也会引起蛋白质的变性 2.萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷， 普通的离子缔合型萃取剂很难起作用
• 反胶束萃取
反胶束
• 正常胶束：表面活性剂溶于水中, 当浓度超过临界 胶束浓度(CMC)时, 就会聚集在一起而形成正常胶 束，亲水基向外、疏水基向内。 • 反胶束: 当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶 束浓度(CMC)时, 其分子在非极性溶剂中自发形成 的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核的多 分子聚集体。
反胶束的制备
• 注入法：将含蛋白质的水溶液直接注入到含表面 活性剂的非极性有机溶剂中，然后进行搅拌直至 形成透明溶液为止（过程较快、可控制平均直径 和含水量）。 • 相转移法：将含蛋白质的水相和含表面活性剂的 有机相接触，在缓慢搅拌下，一部分蛋白质转移 至有机相中。（过程较慢，处于稳定的热力学平 衡状态和获得较高的蛋白质浓度）。 • 溶解法：对非水溶性的蛋白质可用此法。将含有 反胶束的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌时 蛋白质进入反胶束中（需较长的时间）。
食品科学 2011, 32(21): 214-217
反胶束萃取的应用实例
• 混合反胶团萃取α-淀粉酶
以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和脱水山梨醇单硬脂酸酯聚氧乙烯醚 (Tween-60)为混合表面活性剂溶于正丁醇 - 异辛烷中构成反胶团系统，萃 取纯化α- 淀粉酶
食品科学 2011, 32(21): 214-217
反胶束萃取的应用实例
• 混合反胶团萃取α-淀粉酶
以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和脱水山梨醇单硬脂酸酯聚氧乙烯醚 (Tween-60)为混合表面活性剂溶于正丁醇 - 异辛烷中构成反胶团系统，萃 取纯化α- 淀粉酶
Bioresource Technology, 2012, 108:224–230
反胶束萃取的应用实例
结论： 1.反胶束萃取技术可以实现 2.脂肪酶的高效纯化及回收 3.纯化倍数：15倍 回收率：80%
V水相/V有机相对回收率和纯化度的影响
参考文献
[1]刘俊果,邢建民,畅天狮,刘会洲.反胶团萃取分离纯化纳豆激酶[J]. 科学 通报，2006, 51(2): 133-137.
[2]高树刚,宋伟明,安红.混合反胶团萃取α- 淀粉酶[J]. 食品科学, 2011, 32(21): 214-217. [3] Wang W, Weber M E, Vera J H. Reverse Micellar Extraction of Amino Acids Using Dioctyldimethylammonium Chloride[J]. Ind. Eng. Chem. Res. 1995,34: 599-606. [4] Gaikaiwari R P, Wagha S A, Kulkarni B D. Efficient lipase purification using reverse micellar extraction[J]. Bioresource Technology, 2012,108: 224– 230.
Bioresource Technology, 2012, 108:224–230
反胶束萃取的应用实例
• Baidu Nhomakorabea萃取技术对脂肪酶的高效纯化
Efficient lipase purification using reverse micellar extraction 目标函数：纯化度，回收率 变量：表面活性剂的类型和浓度，pH，离子强度，有机相/水相比例
与目标蛋白质有关的因素
蛋白质的等电点 蛋白质的大小 蛋白质的浓度 蛋白质表面的电荷分布
与水相有关的因素
pH值 离子种类 离子强度
与环境有关的因素
系统温度 系统压力
反胶束萃取的优点
• • • • 成本低，溶剂可反复使用 萃取率和反萃取率高 解决蛋白质变性、降解的问题. 从完整细胞中提取蛋白质和酶
具有工业开发前景的蛋白质分离技术
反胶团溶解蛋白质模型
• • • • 1.水壳模型（普遍接受） 2.蛋白质疏水部分直接与有机相接触 3.蛋白质吸附在反胶团内壁 4.蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏 水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”
反胶团溶解蛋白质机理
• 反胶团的极性内核在溶解了水后, 在内核中形成“微水池”, 可以进 一步溶解蛋白质等生物活性物质。 • 屏蔽作用使蛋白质不与有机溶剂 直接接触, 而水池的微环境又保护 了其活性, 从而达到了溶解和分离 目的
反胶团溶解蛋白质过程
蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程
蛋白质 表面活性剂
静电作用 变形 含有蛋白质的反胶束
改变水相条件（pH、离子种 类和强度）使蛋白质由有机相 返回水相，实现反萃取过程.
扩散进入有机相 蛋白质萃取
反胶束萃取的影响因素
与反胶束团有关的因素
表面活性剂的种类 表面活性剂的浓度 表面溶剂的种类 助表面活性剂及其浓度
反胶束萃取体系
• 单一反胶束体系： 阴离子型：AOT(丁二酸- 2 - 乙基已基酯磺酸钠)/ 异 辛烷 阳离子型：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 、二辛基 二甲基氯化铵等季铵盐 非离子型：能使反胶团变大, 从而可萃取相对分子质 量更大的蛋白质
• 混合反胶束体系：两种或两种以上表面活性剂构成 的体系，蛋白质的分离效率更高
加入15%异丙醇后，不同浓度NaCl对回收率和 纯化度的影响
反萃取过程中，pH对回收率和纯化度 的影响
Bioresource Technology, 2012, 108:224–230
反胶束萃取的应用实例
• 反萃取技术对脂肪酶的高效纯化
Efficient lipase purification using reverse micellar extraction 目标函数：纯化度，回收率 变量：表面活性剂的类型和浓度，pH，离子强度，有机相/水相比例