表达蛋白质纯化实验参考手册
蛋 蛋白 白质 质纯 纯化 化实 实验
验室 实 实验 验手 手册
册 2007年 10月
第一章 外源基因在大肠杆菌中的表达
一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上 （一）PCR 引物设计的基本原则与 PCR 反应组分和条件
1. PCR 引物设计的基本原则
（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为 15-20。
（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G + C含量 宜在 45-55%左右。
（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在 3’末端不应有互补链存在。
（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。可用计算机进行辅助检索分析。
（5）引物 3’末端一般以单个 C或 G结尾。
2. PCR 反应组分和条件
PCR 反应体系一般选用 50 μl体积，其中含有：
10×Reaction buffer，5 μl
2 个引物，各 12.5-25 pmol (终浓度各 0.25-0.50 μmol/L)
4 种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L
模板 DNA，100 ng左右
Taq DNA 聚合酶，2.5-3 U
PCR 反应条件一般为：
（1）94℃，5分钟
（2）94℃变性 30-60 秒
（3）50-55℃退火 30-60秒
（4）70-72℃延伸 30-60秒
℃ -10分钟
（5）725
共进行 25-35次循环。循环是步骤（2）和（4）
(二) 质粒 DNA的小量制备
1、传统方法
（1）用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml LB 培养液中，37℃培养过夜。
（2）在每个 EP管中倒入 1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心 1分钟以收集 菌体。
（3）将菌体重悬于 100 μl 4℃预冷的溶液 I中，并加入 200 μl新配制的溶液 II, 盖 紧管口，快速颠倒离心管 6-7次，然后，冰浴 5 分钟。
（4）加 150 μl 4℃预冷的溶液 III, 倒置 5-6次以混合内容物，然后，冰浴 5 分钟。
（5）12,000 rpm 离心 10分钟后，小心吸取上清至另一 EP管中。
（6）加 2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置 5分钟。
（7）12,000 rpm离心 5分钟后，移去上清，并用 70%乙醇漂洗 DNA沉淀。DNA 沉淀自然干燥，并溶于 20 μl 双蒸水或 1×TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。
2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA纯化方法-离心方案（适用于产品 A1330， A1340，A1460及 A1470）
（1）12,000 rpm离心 1分钟，以沉淀 1-10 ml过夜培养物。
（2）用 250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。
（3）加 250μl Cell Lysis Solution，倒置 5-6 次混合。
（4）加 10μl Alkaline Protease Solution，倒置 5-6次混合，室温放置 5分钟。
（5）加 350μl Neutralization Solution，倒置 5-6 次混合。
（6）室温，最高转速离心 10分钟，回收上清。
（7）将离心柱插入收集管中。
（8）将上清倒入离心柱中。
（9）室温，最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。
（10）加 750μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将 离心柱重新插入收集管中。
（11）重复步骤（10）（用 250μl Wash Solution）。
（12）室温，最高转速离心 2分钟。
（13）将离心柱插入一个无菌的 1.5 ml微量离心管中。
（14）在离心柱中加 50-100μl Nuclease-Free Water，室温，最高转速离心 1分钟。
（15）DNA溶液保存在-20℃备用。
(三) 质粒 DNA 的中量制备
1. 在100 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET-15b/Novablue 甘油菌，37℃培养过夜；
℃ 4,000 rpm离心 10分钟以收集菌体；在菌体用 3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡
2. 4 ,
萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入 6 ml 溶液 II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴 5-10分钟；
3. 加入
4.5 ml 溶液 III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和 28.5ml水），轻 摇混合，冰浴 10分钟；
4. 4℃，12,000 rpm 离心 20分钟，小心吸取上清至另一个 50 ml离心管中；加入 0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10分钟；
5. 室温，10,000 rpm离心 10分钟以沉淀 DNA；
6. 在沉淀用 70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于 0.3 ml 的 TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入 EP管中；
7. 加入等体积的 5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心 10 分钟以沉淀大分子 RNA 分子；
8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置 10 分钟，12,000 rpm 离心 5 分钟以 沉淀 DNA；
9. DNA沉淀用 70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；
10. DNA沉淀溶于 200 μl含 50-100 μg/ml 胰 RNA 酶的 TE缓冲液中， 在 37℃保温 30 分钟；
11. 加入等体积的 13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置 5 分钟； 12,000 rpm 离 心 10分钟以沉淀 DNA；
12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于 200 μl TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚-氯仿-异 戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的 EP管中，并加入 0.1体 积的 3mol/L NaAc (pH 5.2)和 2倍无水乙醇，混匀，-40℃放置 30分钟；
13. 12,000 rpm 离心 5分钟以沉淀 DNA； DNA沉淀用 70%的乙醇漂洗， 自然干燥， 并溶于 100 μl TE 缓冲液中。最后，用 1%的琼脂糖凝胶电泳对 DNA进行定量和纯度
鉴定。
（四）DNA（PCR 产物或质粒）的酶切
1. 一般在 15-20μl体积中酶切 0.2-1 μg的 DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切 反应的体积和 DNA的量。
2. 一般用 7-8 u 的限制性内切酶酶切 1 μg的 DNA，酶:DNA的比率应小于 25u/μg， 以防止 star activity。
3. 限制性内切酶一般保存在 50%的甘油中，而大于 5%的甘油可能会引起 star activity 或抑制酶切反应。因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般应小于 5%，也 就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的 1/10。
4. 对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切 酶的活性不低于其最大活性的 50%。
5. 酶切反应的时间一般为 2-3 小时。如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。 （五） 从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA（用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System—适用于产品 A9280、A9281 及 A9282）
1. 从琼脂糖凝胶中切下含 DNA的胶条，并放入一洁净的 EP管中。按每 10 mg 胶 条加 10 μl的 Membrane Binding Solution，漩涡震荡，并在 50-60℃保温直到胶条完全 溶解；对于 PCR反应物，可直接加等体积的 Membrane Binding Solution混合。
2. 将 SV 微柱插入收集管中，并将上述溶液加入 SV微柱，室温放置 1分钟。
3. 10,000 g离心 1 分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。
4. 加 700 μl Membrane Wash Soluton，10,000 g离心 1 分钟，丢弃流穿液，重新将 微柱插入收集管中。
5. 用 500 μl Membrane Wash Solution 重复步骤 4，10,000 g 离心 5分钟。
6. 小心将微柱插入一洁净的 EP管中。
7. 在微柱中加 50 μl Nuclease-Free Water，室温放置 1分钟，10,000 g离心 1 分钟。
8. 丢弃微柱，将 DNA储存在 4℃或-20℃。
（六）PCR 产物或 DNA 酶切片断与质粒载体的连接
1. 常规方法
加酶切并回收的质粒载体50-100 μg左右及1 μl的T4 DNA 一般在10μl反应体系中，
连接酶（3-5 u/μl），按 PCR产物或 DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为 3:1 的比 例进行连接。连接反应在 13-16℃保温过夜。
2. 快速连接方法
可以通过连接 Kit进行。例如，对于 Takara 公司的连接 Kit，可在载体与插入片段 的混合液（5 μl）中加入 5 μl Kit溶液，16℃保温 2 小时即可。
（七）大肠杆菌感受态细胞的制备
1. 单菌落接种于 3 ml LB 培养液中，37℃过夜培养。
2. 取 2 ml 过夜培养物接种于 200 ml LB 培养液中，并且，当 37℃培养至 OD600 为 0.4左右时，转移至 250 ml离心管中，立即冰浴 30 分钟。
3. 在 4℃，3,600 rpm离心 10分钟，弃上清，加 4℃预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液 10 ml, 轻摇以充分悬浮细胞。
4. 转移至 50 ml 离心管中，在 4℃，3,500rpm离心 7分钟，小心弃上清。
5. 加 5 ml 预冷的 0.1 mol/L CaCl2 ，轻摇离心管以充分悬浮细胞；冰浴 2小时后， 加 4℃预冷的 80%甘油至终浓度为 15%，混匀分装，并保存于-70℃。
（八）用质粒或连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
1. 常规方法
一般用 2-3 μl连接反应物与 200 μl 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴 30分钟； 42℃热激 90 秒，冰浴 2 分钟；加 0.5-0.8 ml 的 LB 培养液，37℃，150-200 rpm振荡培 养 60分钟； 低速离心以沉淀细胞， 并移去大部分上清； 用移液器吹吸混匀细胞， 在 9 cm 直径的平板涂布 100-200 μl 细胞悬液，并在 37℃保温过夜。
2. 快速转化方法
用 2-3 μl连接反应物与 200 μl 大肠杆菌菌株感受态细胞混合，冰浴 10 分钟，42℃热激 90 秒，冰浴 2分钟，然后涂布在含有适宜抗生素的平板上。
（九）转化子的筛选和鉴定
1. 通过 Promega 公司 pGEM-T Vector System 的蓝/白斑筛选
（1）在含有适当抗生素 90 mm LB 琼脂平板中央滴加 40 μl 2% X-gal （用二甲基甲 酰胺配制）和 7 μl 20% IPTG.。如用 150 mm平板，则加 100 μl 2% X-gal 和 20 μl 20% IPTG。
（2）用涂布棒使溶液均匀地分散在整个平板的表面。然后，在 37℃保温 1小时， 使全部液体消失。
（3）将 pGEM-T Vector--插入片断连接反应物转化的大肠杆菌细胞涂布在上述平 板的表面，37℃保温过夜。其中，白色菌落表明：细胞中的质粒含有插入片断；蓝色菌 落表明：细胞中的质粒不含有插入片断。
2. 转化子质粒 DNA的酶切鉴定
用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml含有适宜抗生素的 LB 培养液中，37℃振荡过夜培养。 吸取 1 ml过夜培养物进行质粒 DNA的小量抽提，用限制性内切酶酶切检验质粒 DNA 中是否有插入片断。
3. 以菌落为模板的 PCR鉴定
用灭菌吸头挑取少许单菌落细胞， 点在 PCR管的底部。 然后， 加入其他 PCR组分， 进行正常的 PCR反应（其中，PCR 循环前的反应参数为：95℃保温 10分钟），以检测 菌落细胞质粒 DNA中是否有插入片断。
二、Stratagene公司的 QuikChange TM 定点突变方法
为了保证高的突变效率，DNA 模板的用量要小，DNA 聚合酶的保真度要高，PCR 的循环数要少。
（一） 突变引物的设计
1. 对于每一个突变，需合成两条互补的引物，并且引物应通过 PAGE 纯化。
2. 引物的长度为 25-45个碱基，其 T m 值应大于或等于 78℃。
T m = 81.5 + 0.41 (%GC) – 675/N– % mismatch, N为引物的长度。
3. 突变碱基应当位于引物的中间。
4. 引物的 GC含量应大于或等于 40%，并且应当以一个或多个 C或 G 结尾。
（二） PCR 相关参数
1. 小抽或中抽的质粒 DNA均可用作 DNA模板。 对于 50μl反应体系，DNA 模板 的用量为 10-100 ng，最适用量应通过实验来确定。
2. 引物应过量，一般可配成 100ng/μl，用量为 3-5 μl。
3. PCR 反应条件为：95℃，1 分钟；50-55, 1
℃
℃ -2 分钟； 68, 2 minutes/kb of plasmid length。
4. 对于单个碱基的改变，退火温度为 55℃，循环数为 12 次；对于两个或三个碱 基的改变，或者单个氨基酸的缺失或插入，退火温度为 50 或 55℃，循环数为 16 次； 对于多个氨基酸的缺失或插入，退火温度为 50或 55℃，循环数为 18次。
（三）DNA 模板的去除
PCR 反应后，取 10 μl反应物走 1%琼脂糖凝胶电泳，以检测目标产物的量和纯度。
则在剩余反应物中加1 μl限制性内切酶DpnI (10-20 如果目标产物的量和纯度符合要求，
u/μl), 37℃保温 2-3小时以酶解模板 DNA。
（四）转化
取 3 μl DpnI 酶切反应物转化 200 μl大肠杆菌感受态细胞。
（五）突变基因的鉴定
突变基因通过 DNA测序鉴定。
三、检测外源蛋白质在大肠杆菌中的表达
如果靶基因亚克隆在含有 T7 启动子的表达载体（如质粒载体 pET-22b和 pET-15b 等）上，那么重组质粒应转化入 λDE3 溶源菌菌株 [如 BL21(DE3)、JM109(DE3)及 Qrigami B(DE3)等] 中，以进行靶基因的表达。
（一） 溶菌酶-DNase I-反复冻融裂解菌体法
1. 单菌落接入 4ml LB 培养液中，过夜培养。再以 1:20转接至 2管 4 ml LB 培养 液中，当 OD600 为 0.6-0.8时，一管加 IPTG 诱导，另一管不加 IPTG 作对照。
2. 离心收集菌体，每管加 Binding buffer 100 μl，DNase I (2,000 u/ml) 10 μl，溶菌 酶 (2 mg/ml) 5 μl。菌体充分悬浮后，在-20℃放置 20 分钟，室温融化，如此反复冻融 8-10次。
3. 吸取 20 μl加入一洁净的 EP管中，12,000 rpm离心 10分钟，上清和沉淀分别 进行 SDS-PAGE 电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。
（二） 超声波裂解菌体法
1. 单菌落接入 4 ml LB 培养液中，过夜培养。其中 2 ml过夜培养物用于菌种保存 和 DNA 测序，另外 2 ml过夜培养物接入 100 ml LB 培养液中扩大培养。当 OD600 为 0.6-0.8时，加 IPTG诱导表达 3-4小时。
2. 4℃，5,000 rpm离心 10分钟收集菌体，用 5 ml Binding buffer充分悬浮细胞， 超声波破碎细胞（功率：120 W左右，间歇时间：10 秒，工作时间：3秒，破碎次数： 40-50次）。
3. 吸取 20 μl加入一洁净的 EP管中，12,000 rpm离心 10分钟，上清和沉淀分别 进行 SDS-PAGE 电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。
（三） SDS-煮沸裂解菌体法
1. 单菌落接入 4ml LB 培养液中，37℃培养。当 OD600 为 0.6-0.8 时（约需 3-4 小 时），吸取 2 ml加入另一空的培养管中。其中，一管加 IPTG诱导，另一管不加 IPTG 作为对照。
2. 吸取 1 ml培养物加入洁净的 EP管中，10,000 rpm离心 1分钟收集菌体。在菌 体管中加 20 μl水和 20 μl 2×loading buffer，沸水浴中维持 3-5分钟。
3. 用 SDS-PAGE 电泳分析上述样品，以判断靶蛋白质在大肠杆菌中的表达量。
四、用大肠杆菌生产 13 C- 15 N标记的蛋白质
1. 用于生产 13 C- 15 N 标记蛋白质的组合培养基（每升）
K2HPO4?3H2O：10.375克
KH2PO4：4.375克
15 NH
Cl：0.5克
4
MgSO4?7H2O：50 毫克
NH4FeSO4?6H2O：7 毫克
盐酸硫胺：10 毫克（母液浓度为 10毫克/毫升）
13 C-葡萄糖：2.5克
氨苄青霉素：100毫克（母液浓度为 100毫克/毫升）
除 15 NH4Cl、 13 C-葡萄糖及氨苄青霉素外，其余试剂均为国产分析纯试剂；2.5克葡 萄糖溶于 25 毫升蒸馏水中，并单独灭菌；对盐酸硫胺和氨苄青霉素采用过滤除菌；葡 萄糖、盐酸硫胺及氨苄青霉素在培养前加入。
2. 在大肠杆菌细胞中合成 13 C- 15 N 标记的蛋白质
将来自 LB 平板上的单菌落（含有重组质粒）接入 2-3毫升组合培养基中，37℃振 荡培养 12小时（例如，从 9:00-21:00），然后接入 100毫升组合培养基中；过夜培养后， 分别接入三个 330毫升（在 1升三角瓶中）组合培养基中；当 37℃培养至 OD600=0.6-0.7 时，加 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，并继续培养 4小时，以诱导 13 C- 15 N标记蛋白质的 合成。
第二章 蛋白质的纯化和鉴定
一、 用 Ni 2+ 亲和层析柱纯化可溶性蛋白质
1. 30 ml的过夜培养物加入 300 ml（在 1升三角瓶中） 含有 100 μg/ml氨苄青霉 素的 LB 培养液中，在 37℃振荡培养。
2. 当 OD600 达到 0.6-1.0时，加 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L 进行诱导表达，培养 物继续保温 4小时以进行目标蛋白质的累积。
3. 4℃，5,000 rpm离心 10分钟收集菌体。对于 500 ml菌液中的菌体，用 20-30ml 的 start buffer充分悬浮。
4. 在冰浴条件下，用超声波破碎细胞（条件为：工作时间 3秒，间歇时间 10秒， 总次数 120-200）。
5. 4℃，12,000 rpm离心 20分钟以去除细胞碎片，上清与 Ni 2+ 亲和层析柱混合。
6. 上样后，分别用 start buffer (20 mmol/L Tris, pH
7.8, 0.5 mol/L NaCl) 和 wash buffer （20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 50-100 mmol/L 咪唑）洗脱杂蛋白质， 用 elution buffer（20 mmol/L Tris, pH 7.8, 0.5 mol/L NaCl, 0.5 mol/L 咪唑）洗脱目标蛋 白质。
二、 通过 Ni 2+ 亲和层析柱纯化包涵体蛋白质
1. 5,000 rpm离心 15 min。弃培养基，按每 500 ml菌体加入 20 ml缓冲液 A。
。超声破碎 200次（功率为 200 W，
2. 震荡混匀，加入 200l 100 mmol/L PMSF
工作时间为 3 s，间隙时间为 10 s）。12,000rpm离心 20 min。
3. 弃上清，沉淀再加入 5 ml缓冲液 A洗涤 1次。12000rpm离心 20min。加入 6ml
盐酸胍溶液，4℃静置过夜。12000rpm离心 20min。按以下步骤处理：
（1） 用缓冲液 B 平衡 Ni agarose 柱。
（2） 将盐酸胍处理的蛋白质溶液上 Ni agarose 柱。
（3） 用约 10 倍床体积的含 25 mmol/L 咪唑的缓冲液 C 洗脱。
（4） 用约 10 倍床体积的含 40 mmol/L 咪唑的缓冲液 C 洗脱。
（5） 用约 5倍床体积的含 400 mmol/L 咪唑的缓冲液 C 解析下目标蛋白质。
缓冲液 A： Tris?Cl (pH8.0) 50 mmol/ L
EDTA 0.5 mmol/ L
NaCl 0.4 mmol/ L
MgCl 5 mmol/ L
甘油 5%
盐酸胍溶液：
盐酸胍 6 mol/ L
Tris?Cl (pH8.0) 50 mmol/ L
甘油 5%
缓冲液 B：
Tris?Cl (pH 7.9) 10 mmol/ L
甘油 10%
NaCl 0.5 mmol/ L
缓冲液 C：
Tris?Cl (pH 7.9) 20 mmol/ L
甘油 20%
KCl 100 mmol/ L
三、 透析袋与超滤膜的使用注意事项
可用脱盐层析柱、透析袋或超滤膜对蛋白质溶液进行脱盐、缓冲液置换或浓缩。对 于透析脱盐，宜采用逐渐降低盐浓度的方式进行。
（一） 透析袋使用注意事项
1. 应带上一次性薄膜手套操作透析袋。
2. 透析袋一般剪成 10-20 cm的小段。
3. 新透析袋应在 2%（w/v）碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA 中煮沸 10分钟， 然后用蒸馏水清洗干净，再用 1 mmol/L (pH8.0) EDTA 中煮沸 10分钟。冷却后，4℃保 存于 20%的乙醇中。
4. 用过的透析袋需用蒸馏水彻底清洗干净，然后浸于 20%的乙醇中，在 4℃保存 备用。
（二） 超滤膜使用注意事项
1. 不要用手直接拿超滤膜，应用平头镊子小心夹取超滤膜的边缘。
2. 在 4℃，10%-20%的乙醇中保存，不要冰冻。
3. 使用过的超滤膜应进行再生处理（放在培养皿中，在脱色摇床上进行），具体方
案如下:
(1) 蒸馏水漂洗 2分钟。
(2) 用 0.1 mol/L NaOH 漂洗 10分钟。
(3) 用蒸馏水漂洗以除去 NaOH。
(4) 70%乙醇浸泡 5分钟。
(5) 用蒸馏水漂洗 2分钟，再保存于 10%-20%的乙醇中。
4. 光面向上。
5. 应避免超滤 pH小于 3.0或 pH大于 13的溶液。
6. 不能与下列溶液混用：
（1） 胺
（2） 大于 10%的磷酸溶液。
（3） 大于 0.5%的酚溶液。
（4） 大于 0.01 mol/L 的盐酸。
四、蛋白质浓度的测定
蛋白质的浓度用 BCA Protein Assay Kit (pierce 公司) 测定，以牛血清白蛋白 为标准。具体方案如下：
1. 用 Kit 中的牛血清白蛋白标样配制成下列不同浓度的标准溶液：2,000 g/ml, 1,500 g/ml、1,000 g/ml、750 g/ml、500 g/ml、250 g/ml、125 g/ml及 25 g/ml（0 g/ml=空白溶 液）。在这里，配标准溶液所用的稀释剂应与待测样品的相同。
2. 将 50体积的 BCA试剂 A与 1体积的试剂B 充分混合，从而配成工作溶液。工作溶 液最好在测定的当天配制。
3. 分别将 0.15 ml标准溶液、待测样品及空白溶液与 3 ml工作溶液在 5 ml离心管中混 合，37℃保温 30分钟。然后，迅速用冰浴冷却所有的管。
4. 用蒸馏水调零，在 562 nm处测定样品的光密度值（最好在 10 分钟内完成）。
5. 从标准溶液和所测样品的 562 nm光密度值中减去空白溶液的相应吸收值，即得到净 吸收值。然后，以牛血清白蛋白浓度为横坐标，以相应的 562 nm净吸收值为纵坐标作 标准曲线。用标准曲线判定每个未知样品的浓度。
第三章 DNA-蛋白质相互作用研究方法
一、 凝胶迁移率变动实验 (gel shift or electrophoretic mobility shift
assay)
凝胶迁移率变动实验又称凝胶滞留法（gel retardation assay）或迁移率改变法 （mobility shift assay），是检测 DNA 结合蛋白的一种简单迅速而又灵敏可靠的实验方 法。
凝胶迁移率变动实验的基本原理是：当 DNA 结合蛋白与相应的 DNA 片断或寡核 苷酸结合而形成 DNA-蛋白质复合物后，使 DNA 片段的分子量及电荷发生改变，因而 在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中其电泳迁移率发生改变，通常较游离的 DNA片段的泳动 速率慢得多，在放射自显影 X 光胶片上形成一较游离 DNA片断滞后的带型。
（一） DNA 片段的制备
DNA 片段的长度一般要求在 300 bp 一下。DNA 片断过大，在聚丙烯酰胺凝胶中 不易分离，DNA片断泳动速度的轻微改变不易监测到。
1. 对于 DNA 酶切片段， 需用牛小肠碱性磷酸酶 （CIAP） 去除 DNA片段中的 5? 磷 酸，具体方案如下：
在 40 μl体系中， 加 1 μl CIAP (0.1 U/μl), 37℃保温 15 分钟，56℃保温 15分钟； 再用 CIAP处理一次；用苯酚/氯仿抽提一次，向上清中加入 5 mol/L NaCl至终浓度为 0.2 mol/L, 以及两倍体积无水乙醇，-20℃过夜；12,000 rpm离心 5 分钟以沉淀 DNA。 DNA 溶于双蒸水中。
2. 对于合成的单链 DNA片断，需要退火，具体方案如下：
将两条互补的单链 DNA 片断分别溶解于双蒸水中，在 EP 管中等摩尔数混合后， 放入 100℃水中，自然冷却到 37℃以下。
（二） DNA 片段的标记
1. 在一个洁净的 EP管中，分别加入下列组分：
DNA 片段 5-6 pmol
T4 多聚核苷酸激酶 10×Buffer 1 μl
[γ- 32 P]ATP (3,000 Ci/mmol, 10 μCi/μl) 2 μl
或 [γ- 32 P]ATP (5,000 Ci/mmol, 10 μCi/μl) 3 μl
加水至总体积为 9 μl
T4 多聚核苷酸激酶（5-10 u/μl） 1 μl
2. 混匀，37℃保温 10分钟。
3. 加 1 μl 0.5 mol/L EDTA 终止反应。
（三） 游离[γ- 32 P]ATP 的去除
1. 对于小于 18 bp的 DNA 片断，可用 G-25 离心柱去除其中未结合的[γ- 32 P]ATP。
2. 对于大于 18 bp 的 DNA 片断，可用乙醇沉淀的方法去除其中未结合的 [γ- 32 P]ATP，具体方案如下：
加0.5倍体积的7.5 mol/L乙酸铵和两倍体积的无水乙醇， -70℃放置30分钟； 12,000 rpm离心 5分钟以沉淀 DNA；DNA溶于 50μl双蒸水中，即为 32 P标记的 DNA片断溶 液。 32 P标记的 DNA片断溶液可放在密闭的铅罐中，并保存在-20℃备用。
（四） 迁移率变动实验
32 P标记 DNA片断的量一般为 0.1-1 ng，可根据具体情况适当增减，以能形成清晰 的滞后带而游离 DNA带又不过浓为宜；蛋白质的量为 0.1-10 μg，应进行预实验摸索出 适宜的蛋白质加入量。以能形成清晰的滞后带，而又有适量的游离 DNA带残存为宜。
1. 在无菌的 EP管中建立下列反应：
反应 1（负对照）：
7 μl 双蒸水
2 μl Gel Shift Binding 5×Buffer
0 μl 蛋白质溶液
9 μl 总体积
反应 2（正对照）：
μl 双蒸水
2 μl Gel Shift Binding 5×Buffer
μl 蛋白质溶液
9 μl 总体积
反应 3（专一性竞争物）：
μl 双蒸水
2 μl Gel Shift Binding 5×Buffer
μl 蛋白质溶液
1 μl 未标记的 DNA片断（5-6 pmol）
9 μl 总体积
2. 室温放置5-10分钟， 然后在上述每个反应管中分别加1 μl 32 P标记的DNA片断。
3. 室温放置 20 分钟。
4. 仅在负对照反应管中加 1 μl 凝胶上样 10×Buffer。在 300伏预电泳 10分钟后， 反应产品通过一个 4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分析
5. 在电泳后，用吸水纸吸去凝胶上多余的溶液，然后，用保鲜膜覆盖，并夹在 X 光片与增感屏之间；-70℃过夜进行放射自显影。
溶液或试剂的配方：
1. Gel Shift Binding 5×Buffer
20% 甘油
5 mM MgCl2
2.5 mM EDTA
2.5 mM DTT
250 mM NaCl
50 mMTris-HCl, pH 7.5
0.25 mg/ml poly(dI-dC)?poly(dI-dC)
2. Gel loading 10×Buffer
250 mM Tris-HCl, pH 7.5
0.2% 溴酚兰
40% 甘油
3. TBE 10×Buffer (1 升)
107.80g Tris
55g 硼酸
7.44g disodium EDTA?2H2O
4. 4%非变性聚丙烯酰胺凝胶（20 ml）
TBE 10×Buffer 1.0 ml
2% bisacrylamide 500 μl
40% acrylamide 2.0 ml
80% 甘油 625 μl
双蒸水 15.9 ml
TEMED 10 μl
10% 过硫酸铵 150 μl
二、 表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance) 实验
1. DNA 探针的制备
合成两条互补的 5’-生物素标记的单链 DNA 片段（PAGE 纯化），并用结合缓冲液 （10 mmol/L Tris, 30 mmol/L NaCl, pH 7.6） 配成终浓度为 100 μg/ml的溶液。该 DNA 溶液在 95℃保温 5分钟，然后自然冷却到 37℃以下，即达到了退火的目的。
2. DNA的偶联
DNA 溶液在 25℃下流经感应片 SA-5 (Amersham Pharmacia Biotech)，流速为 5 μl/min，注射时间为 10分钟，再用 0.05%的 SDS 冲洗。
3. DNA结合蛋白质与 DNA 结合的动力学分析
将DNA结合蛋白质用稀释缓冲液 (10 mmol/L Tris， 50 mmol/L EDTA， 0.05 mmol/L DTT，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，4% Glycerol，pH 7.5) 稀释到实验浓度 (856 nmol/L、 572 nmol/L、 286 nmol/L、 143 nmol/L 及 71.5 nmol/L)。蛋白质溶液以 30 μl/min 的流速流过偶联有 DNA 的感应片。其中，结合时间为 120 秒， 解离时间为 180 秒。 再用 0.05% SDS再生，从而得到不同浓度的 E2F1 DNA 结合结构域蛋白质的动力学结 合曲线。然后，动力学曲线经 BIA evaluation version 3.1 软件处理后，即可得到 E2F1 DNA 结合结构域与 DNA 的结合常数、解离常数、平衡常数及亲和常数。
质粒DNA的提取和纯化实验报告
质粒DNA的提取和纯化实验报告
实验一、质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。 二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体
蛋白的纯化
第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种
表达蛋白的分离与纯化
表达蛋白的分离与纯化 大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。 一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白） （一）试剂准备 采用T7· Tag Affinity Purification Kit 1．T7·Tag抗体琼脂。 2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3.
0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。 4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。 5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。 1.PEG 20000。 （二）操作步骤 1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。 2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。 3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。 4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。 5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。 6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。 7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。 8.用PEG 20000浓缩蛋白。 （三）注意事项 蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。 二、包涵体的纯化
基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质纯化
一、目的: 利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。 二、原理: 由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱 (Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。 三、试剂与器材: 1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl Ph7) ?细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性 2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7) 3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7) 上课补充: ?蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备: FPLC(速液相色谱仪) 五、步骤: 1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。 2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。 3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。 4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以 FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之 曲 线图。 上课补充: ?胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。 ?线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲 洗掉，剩下胶体溶液。 ?其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来 洗涤蛋白质。(可详见问题一及补充资料2) 六、问题:
1蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化 How to detect, analyze and prepare?
Different purposes, different protocols Detective/analytical level: nanogram(ng) or picogram(pg) Preparative level: milligram (mg)
Protein detection/analysis: 1, Hybridization: Western blot 2, Immunological Techniques: Elisa & Co-IP 3, electrophoresis SDS PAGE, 2-D gel, CE, IEF 4, chromatography: HPLC, FPLC, 5, Spectrometry: DLS, NMR, Mass-Spect, LC-MS 6, X-ray crystallography …
Western blot: Protein-protein This method is dependent on the use of a high-quality antibody directed against a desired protein. Southern blot: DNA-DNA (Edward Southern. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol. 1975 Nov 5;98(3):503-17) Northern blot: DNA-RNA
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴 定实验报告 生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称实验日期合作者评分 XX 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验地点指导老师教师签名李某某批改日期 20XX-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。一、实验目的 1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。 3、了解柱层析技术。 二、实验原理 1、粗提： 蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定
因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。 2、脱盐 凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动。 所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。 3、纯化 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化
微机模拟蛋白质纯化实验
微机模拟蛋白质纯化实验 学号：1025004555 姓名：王圣强专业：生物工程 一、实验目的： 1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法。 2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。 二、实验原理： “Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。 在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。 本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。 三、实验步骤： 实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品： 1. pH稳定范围较大的蛋白（Windows 1号酶） 2. 酸性条件下稳定的蛋白（Windows 3号酶） 3. 碱性条件下稳定的蛋白（Windows 36号酶） 1.pH稳定范围较大的蛋白（Windows 1号酶） 1号酶在50度下稳定，稳定范围2-11(稳定范围较大)
蛋白质纯化方法
含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化 一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂：1M IPTG 1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的 表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养 过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。 2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB 培养液中，37℃通气培养过夜。 3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各 10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550 ＝0.1-1.0）。 4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物 中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5， 5.0mM相同的温度继续通气培养。 5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。 细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱 导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加 重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大 肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑 制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过 试验确定最佳的培养条件是很必要的。 6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升 1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1 分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE 观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。 二.大量表达靶蛋白 1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的 LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。
实验报告血红蛋白doc
实验报告血红蛋白 篇一：生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤 实验报告 课程名称：生化实验B实验日期： 班级：姓名学号： 血红蛋白凝胶过滤 一、背景及目的 血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。 凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的
分离效果。 影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的(本文来自：小草范文网:实验报告血红蛋白)颗粒大小、均匀度 2.筛孔直径和床体积的大小 3.洗脱液的流速 4.样品的种类等， 5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。 影响凝胶过滤的因素主要有： 1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。 2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。 3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。 4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。 目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点： 1、脱盐 2、用于分离提纯 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 5、蛋白质的复性 二、实验原理 层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)
蛋白体外表达与纯化
蛋白体外表达与纯化 随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。 蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 一：原核表达系统 原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养；外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰；广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制；另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体；有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异，而的不到足够的产物。二：真核表达系统 真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表，酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制，形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便，通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续，缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件：安全无毒，不致病；遗传背景较清楚，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入；培养条件简单；有良好的蛋白分泌能力；有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。 三：哺乳动物细胞表达系统 由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用，故此不赘述。 表达载体的种类及相应的分离纯化方法 作为表达载体必须具备以下特征：稳定的遗传复制、传代能力，无选择压力下能存在于宿主细胞内；具有显性的筛选标记；启动子的转录是可调控的；启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止；具有外源基因插入的多克隆位点。 在原核表达系统中常用的表达载体有：PET－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白在Ｎ端或Ｃ端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX－载体系列，用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在，以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。 本实验将以PGEX4T—3为载体，在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。 实验方法与步骤： 一：目的蛋白的粗提 1．构建载体，转化BL21DE3宿主菌感受态细胞 2．挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3．取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培，至对数生长中后期
生化血清蛋白分离提纯实验报告
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称血清清蛋白、γ蛋白分离提纯与纯度鉴定 实验日期2018-12-27实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5.了解柱层析技术 二、实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 三、材料与方法：以流程图示意 材料：人混合血清、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)、纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、各不同浓度的醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸溶液、1%BaCl2溶液 器材：层析柱、电泳仪、电泳槽等
操作方法：
取浓度最高的一管做纯度鉴定。 2管均作纯度鉴定 最后DEAE-纤维柱先用6ml 1.5mol/L NaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC 缓冲液流洗再生平衡。 醋酸纤维素薄膜电泳：
点样（粗面）→电泳→染色和漂洗 注意： ①点样线尽量点得细窄而均匀 ②电泳时薄膜粗面朝下、点样端置阴极端、两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平，切勿使点样处与电泳槽接触 ③电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。 四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。 从上到下分别为血清、清蛋白一、清蛋白二、球蛋白。 从上图可以看出，此次实验结果不太理想，血清电泳结果只有两条带，推测原因有 ①血清点样时量不足 ②点样时手法不恰当
微机模拟蛋白质纯化实验
微机模拟蛋白质纯化实验 学号： 1035130150 ：睿 班级：生命科学学院 10级生物工程 ： 1059508633qq. 一、实验目的： 1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein 软件提纯蛋白质的方法。 2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法 的原理和应用。 二、实验原理： 1：“Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度围和pH稳定围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。 2：“Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性； ②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析； ⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。 3：在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变
性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。 4：“Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。 三、实验要求： 完成实验软件中三种酶的分离纯化。 四、实验步骤： 实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品： 1. pH稳定围较大的1号蛋白 2. 碱性条件下稳定的36号蛋白 3. 酸性条件下稳定的3号蛋白 1：酸性条件下稳定的3号蛋白 3号酶在62℃以下稳定，稳定pH围3.8～5.8（酸性条件）。
重组蛋白纯化基本策略
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。 关键词：蛋白质分离纯化 前言： 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
生化实验报告模版
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
蛋白质分离纯化技术实验讲义教材
实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法） 一、实验目的 1、制作蛋白质浓度标准曲线； 2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线讣算出蛋白质的浓度。 二、实验原理 Bradford法（考马斯亮蓝法）测左蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250 （CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm:当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的泄量测左。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下lh内保持稳泄。 Bradford法的突出优点是：灵敏度髙：测左快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测左，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100. SDS 和 0.1N 的 NaOH9 三、试剂与器材 1、试剂： lmg/ml牛血淸蛋白（BSA）母液:考马斯亮蓝G-250；无水乙醇：85%磷酸；MiliQ水。 2、器材： 滤纸；烧杯；漏斗：可见分光光度计：试管。 四、实验方法 1、考马斯亮蓝G-25O染料的配宜 称100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于47.5 ml无水乙醇后,再加入100 ml 85%的磷酸，加 MiliQ水泄容至1L,过滤备用。 2、标准蛋白溶液的稀释 取10支试管，按表中顺序排列，分別加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。 每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的编号为8、9、10号管。 3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测泄各样品在595nm处的吸光值 OD595o 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 4、标准曲线制作 以标准蛋白的量（mg）为横坐标，吸光值OD595为纵坐标作图，即得一条标准曲线。由此标准曲线，求得趋势线以及公式（y=ax+b,其中y为吸光度值OD595, x为蛋白质的量，a和b为常量）并给出疋值，R?值越接近1证明曲线越接近实际结果，根据此公式及未知样品的吸光度值，计算每管中加入的未知蛋白的量，进而推算其浓度。 5、本实验采用的未知样品为麦曲中糖化酶分离纯化实验所得的粗酶液样品。
蛋白质纯化原理
蛋白质的纯化原理 一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 （三）根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 实验报告集 班级生工1411 学号 组别7 姓名
实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）
实验报告 溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定 一、目的 对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定 二、原理 鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。 1、溶菌酶分离纯化原理： （1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白 （2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白 2、溶菌酶鉴定分析 （1）考马斯亮蓝法测蛋白含量 （2）分光光度法测定酶活性 （3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度 三、实验材料与方法 1、实验材料与试剂 鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等 2、实验仪器 低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。 3、实验方法 1.新鲜鸡蛋清的制备与粗分离 2. 树脂柱层析分离纯化 （1）D152树脂处理(2)湿装法装柱(3) 上柱离子交换吸附(4) 冲平(5) 洗脱 3.透析与浓缩 (1) 透析除盐(2) 聚乙二醇浓缩 4.蛋白质含量的测定 5.溶菌酶纯度的测定（SDS凝胶电泳）
蛋白质的表达、分离、纯化实验.doc
蛋白质的表达、分离、纯化实验 蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。 实验方法原理 携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 实验材料：大肠杆菌BL21 试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer Elution Buffer IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠 仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒 实验步骤 一、试剂准备 1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。 2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。 3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。 4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。 5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。 6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 二、获得目的基因 1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。