表达蛋白质纯化实验参考手册
蛋白质的表达、分离、纯化实验
蛋白质的表达、分离、纯化实验蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。
实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer Elution Buffer IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
thermo蛋白质表达手册
thermo蛋白质表达手册
Thermo蛋白质表达手册是一个关于蛋白质表达的指南，旨在帮助研究人员在实验室中成功地表达目标蛋白质。
这样的手册通常包括从基本的实验室技术到最新的方法和技术的全面介绍，以及实验步骤的详细说明，以帮助研究人员克服在蛋白质表达过程中可能遇到的各种挑战。
在Thermo蛋白质表达手册中，通常会包括以下内容：
1. 蛋白质表达基础知识，介绍蛋白质表达的基本原理、常用的表达系统（如原核和真核表达系统）以及表达宿主的选择等内容。
2. 表达载体和宿主菌的选择，介绍不同类型的表达载体（如质粒、病毒载体等）以及宿主菌的选择原则，以及它们之间的相互作用。
3. 蛋白质表达的优化，包括诸如启动子的选择、译码子优化、信号肽的添加等技术，以提高目标蛋白质的表达水平。
4. 表达条件的优化，介绍温度、培养基成分、诱导条件等对蛋
白质表达的影响，以及如何优化这些条件以获得更高的表达水平。
5. 蛋白质纯化和分析，介绍蛋白质的纯化技术以及常用的蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等。
此外，Thermo蛋白质表达手册还可能包括一些实验注意事项、常见问题解决方法以及相关产品的推荐等内容，以帮助研究人员更好地进行蛋白质表达实验。
总的来说，这样的手册旨在为研究人员提供全面的、系统的蛋白质表达实验指导，帮助他们在实验室中取得成功。
蛋白质的表达纯化
400ul
750ul
1800ul
50ul
10ul
灌完浓缩胶，插入梳子。等到浓缩胶自然凝聚后，将装置放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,小心地拔出梳子，如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，可以用注射器针头小心地加以整理。
01
加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个加样孔加样不宜过多，一般每孔加样10L。
1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。 灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）
5ml
3ml
4ml
120ul
20ul
30%Arc-Bis
Tris-HCl pH 6.7
H2O
10%AP
6
稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽，需800毫升。
7
注意事项
将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间隙。 在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。
氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化
重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融50ml菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液GLB, 用吸管抽吸重悬, 4 ℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清（总蛋白细胞裂解液）吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。
NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液GLB洗涤。(调速0.5ml/3分钟 ) 。
氨苄青霉素：100mg/mL
Washing Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3
蛋白表达纯化实验步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载蛋白表达纯化实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
目的蛋白表达与纯化protocol
目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试：1、挑一单克隆到3ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。
2、保种：700μl菌液+400μl 80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。
3、扩大培养：以1:100接菌，即取50μl菌液到5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。
4、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
对照5、另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000 IPTG（终浓度为1mM），370C，220rpm振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
370C样品6、其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：12000rpm 离心1min，弃尽上清，-200C保存。
160C样品7、Bugbuster分别处理上述三个样品，取20μl总蛋白，其余离心后分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定，上样顺序为：对照370C样品160C样品总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。
大量表达：1、挑一单克隆到7.5ml LB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。
注意：此步用50ml离心管摇菌！2、扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750ml TB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。
3、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。
（对照）4、其余约菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000 IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C 保存。
蛋白质分离纯化实验报告模板
高级生物与分子生物学实验报告姓名：学号：指导老师：实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达【实验原理】：1.DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4 DNA 连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒。
2.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。
由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因（本实验质粒带有卡那霉素抗性基因），根据转化菌的耐药特性进行删选。
3.裂解法小量制备质粒DNA的原理：SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA 存在于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的蛋白质。
4.重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切，酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒DNA。
5.组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导。
IPTP的终浓度为1mmol/L。
6.融合蛋白的表达检测的原理：经诱导表达的重组体裂解后，经SDS-PAGE鉴定。
染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无此蛋白带。
【实验步骤】：1.配制LB和LK培养基2.连接：质粒片断＋目的基因（1.5ml离心管），16℃水浴过夜，65℃水浴10min，灭火连接酶。
ddH2O 12ulX-DNA(目的基因） 3ulpET-28a（质粒片断） 2ul10×buffer 2ulT4 ligase 1ul3.复苏DH5a和BL21，并接种DH5a 1支，接种BL21 1支（10ul菌液+2ml LB）于试管，第二天7：30分别转接DH5a和BL21（1ml+20mlLB）于烧瓶。
（分别准备制备感受态，两个连接反应用来转化）4.DH5a和BL21感受态细胞的制备：在烧瓶孵育2.5h后，取1.5ml菌液至1.5ml离心管，4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/lCaCl2 ，混匀，离心4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/lCaCl2 ，混匀，冰浴30min，离心（4℃，4000rmp，5min），弃上清。
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
蛋⽩质的表达、纯化及检测-分⼦实验报告实验⽬的1.了解外源基因在⼤肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会⽤SDS-PAGE电泳法分离不同分⼦量的蛋⽩质3.学习通过亲和层析法纯化⽬的蛋⽩4.学会考马斯亮蓝染⾊法和蛋⽩质杂交法检测蛋⽩质实验原理1.外源基因在⼤肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac 操作⼦的启动⼦。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋⽩LacI与lac操作⼦结合，使外源基因不能表达；向培养基中加⼊诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋⽩变构失活，不能与lac操作⼦结合，外源基因就表达。
2.蛋⽩质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常⽤的定性分析蛋⽩质的电泳⽅式，特别是⽤于蛋⽩质纯度检测和测定蛋⽩质分⼦量。
其分离原理是根据蛋⽩质分⼦量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加⼊破坏了蛋⽩质的⼆级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋⽩质充分结合形成SDS-蛋⽩质复合物，稳定地存在于均⼀的溶液中，SDS与蛋⽩质结合后使SDS-蛋⽩质复合物上带有⼤量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从⽽使蛋⽩质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分⼦之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分⼦质量的⼤⼩，这样分离出的谱带也为蛋⽩质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋⽩质：考马斯亮蓝是⼀种蛋⽩质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋⽩肽链中碱性氨基酸残基或芳⾹族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多⽤于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋⽩质条带的染⾊；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝⾊，与蛋⽩质结合虽然⽐较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染⾊后为蓝⾊，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以⽤来对电泳条带染⾊。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按⼀定顺序连接在⼀起，融合阅读框架的表达产物是⼀个杂和蛋⽩。
原核表达及蛋白质的纯化
原核表达及蛋白质的纯化原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之一原核表达一( 实验材料1.大肠杆菌BL21.DH5a2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时配好的。
IPTG浓度为0.8m/mL5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml): 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml): 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL 的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。
加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。
加入650mL的去离子水，均匀搅拌。
用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。
8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇 50mL;dH2O10mL,充分混合后使用。
9.10%过滤酸铵 :把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ?保存数周。
10. 5×Tris-GlycineBuffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)配制方法 :称取下列试剂，置于1L烧杯中。
蛋白质的原核生物表达与纯化实验大纲
实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
三．实验用品１. 材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL-c2x （Amp抗性）大肠杆菌DH5a２. 器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平３. 试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、Rnase A、Taq DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、1kb 分子量DNA Marker 、内切酶BamHI和SalI、DNA 片段胶回收试剂盒、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、T ris 碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2 、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖四．方法与步骤（一）缓冲液及培养基配制1.质粒提取试剂：溶液I：葡萄糖 50m mol/L,Tris-HCl(pH 8.0) 25m mol/L,EDTA(pH8.0) 10mmol/L于6.895×104Pa灭菌15 min，4℃保存。
溶液II：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%。
SDS（10%，200ml）：20 g SDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200 ml。
溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pHTE缓冲液：1ml Tris-HCl(1M pH8.0),0.2ml EDTA(0.5M pH8.0),加灭菌水至100ml。
2. LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5g pH 7.0NaCl 5g(二).步骤1．碱裂解法抽提质粒实验原理：在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
蛋白质表达：带GST标签蛋白的纯化
5. 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上 样于Novagen的纯化树脂（以及其它很多类似纯化系统）。蛋白溶液 在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步 分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋 白经冻融会失活。
GST•Bind™树脂层析纯化
为了获得好的纯化结果，建议采用载量超出抽提样本中目的蛋白约10-20%的GST•Bind™树脂。 Novagen提供的GST•Bind树脂的载量是5–8mg/ml。而以pET系统每100ml发酵液中目的蛋白的产量约为 20mg。当然每一种目的蛋白的实际产量会因为基因序列，载体结构，宿主菌品种以及生长、诱导条件等 因素的影响而差异很大。SDS-PAGE或Western blotting可以用于粗提物中的目的蛋白粗定量分析。如果 目的蛋白含有S•Tag，用Novagen提供的S•Tag快速分析试剂盒（货号69212-3）和FRETWorks S•Tag分 析试剂盒 （货号70724-3）可以实现准确定量。如果目的蛋白带有GST•Tag则可以用GST•Tag分析试剂 盒（货号70532-3）获得粗提物中GST的准确数据。
机械破碎法
可溶组分 这部分操作用于分离大肠杆菌可溶组分中的蛋白。用去离子水稀释试剂盒中的10×浓缩液制备1X GST Bind/Wash Buffer。 1. 10,000g离心5分钟收集细胞。倾去上清，尽量控干细胞沉淀。每100ml培养液的细胞用4ml冰冷的1X GST Bind/Wash Buffer重悬。可以加入终浓度为0.1%的NP-40或其它非离子去污剂以减少非特异性结 合。可以用Dounce匀浆器，搅拌器或超声波仪打散细胞沉淀。 2. 在冰浴或盐冰浴中超声波处理样本。根据厂家说明操作，避免长时间超声处理。如果样本已经不再粘 稠即可停止超声。如果DNA没有剪切好会因样品粘稠而堵住柱子。大的细胞块可以在1×GST Bind/Wash buffer中用弗氏压榨法处理。 或者：在细胞糊中加入终浓度为45–60KU/g细胞糊的溶菌酶溶液，吸打混合。30℃孵育15分钟。再进行 超声。将裂解液10,000g离心20分钟。用0.45um膜（滤器）过滤上清。
蛋白的表达纯化
蛋白的表达纯化一、溶液配制1×SDS凝胶上样缓冲溶液配方：Tris-HCl pH6.8 50mmol/L巯基乙醇 5%SDS 2%溴酚蓝 0.1%甘油 10%蛋白纯化配制以下溶液，用于重组蛋白的镍螯合层析分离：低浓度咪唑缓冲液（Low imidazole buffer, L-buffer）Na2HPO4- NaH2PO4 pH7.4 20mMNaCl 0.5mol/LImidazole 25mM高浓度咪唑缓冲液（High imidazole buffer, H-buffer）Na2HPO4- NaH2PO4 pH7.4 20mMNaCl 0.5mol/LImidazole 500mM二、天然条件下小量纯化目的蛋白步骤：1)当诱导表达的菌体浓度达到一定程度时，测定培养物的OD600值，4℃，12000rpm离心5min，收集菌体。
2)用L-Buffer洗涤菌体一次，然后重悬至OD600=20，冰浴条件下超声破碎菌体细胞10min（功率320W）。
然后4℃，12000rpm离心30min。
3)取1ml上清转入1.5ml的干净离心管中，加入50ulNi-NTA Agrose，4℃轻柔混匀结合60min。
4)12000rpm离心10S，小心吸去上清。
5)用100ul的L-Buffer漂洗树脂，操作时要轻柔混匀。
12000rpm离心10S，小心吸去上清，漂洗两次。
6)用20ul的H-Buffer洗脱目的蛋白，操作时要轻柔混匀，12000rpm离心10S小心将上清转入干净小管中，洗脱四次。
7)SDS-PAGE分析各管组分。
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程2010年02月27日星期六09:02丁香园chrispp作品。
一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图11:pET-32aA3未诱导，2:pET-32aA3未诱导，3:pET-32aA3诱导后，4:pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9%NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA 出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图21:pET-32aA3诱导上清，2:pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
全式金蛋白表达与纯化的实验
C端融合：
构建时注意避免移码 基因不能自带终止密码子 提前终止不影响纯化 二级翻译起始会干扰纯化
全式金蛋白表达与纯化的实验
常用融合标签 • His·Tag • GST·Tag • MBP·Tag
pET系统 pGEX系统 pMal系统
全式金蛋白表达与纯化的实验
常用表达载体系统
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体
表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
全式金蛋白表达与纯化的实验
• 启动子 • 融合标签 • 常用表达载体系统
表达载体
全式金蛋白表达与纯化的实验
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： • trc启动子： • tac启动子：
•T7/T7lac启动子：
热诱导启动子 化学诱导启动子 trp+lac杂交启动子 trp+lacUV5杂交启动子； pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB） pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）
全式金蛋白表达与纯化的实 验
全式金蛋白表达与纯化的实验
上篇 原核表达
• 原核表达概述 • 原核表达策略选择 • 表达结果验证 • 常见问题与实验例
全式金蛋白表达与纯化的实验
原核表达概述 ➢原核表达原理概述 ➢表达载体 ➢表达菌株 ➢表达条件
全式金蛋白表达与纯化的实验
目的基因
原核表达原理概述
构建
tac、trc…… (pGEX、pMal)
特性 适用于非T7启动子的表达系统
T7/T7lac (pET，pEASY)
T7/T7lac (pET，pEASY)
全式金蛋白表达与纯化的实验
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
蛋白表达纯化实验步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载蛋白表达纯化实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
蛋白质的表达纯化及结晶
2.3.2.2 蛋白质表达、纯化（1）初始种子培养：挑取阳性克隆到10 mL的含有Amp抗生素的液体LB培养基中，在37℃过夜振荡培养。
（2）扩大培养：将初始种子接入1 L含抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD600为0.6-0.8时，降温至15℃或20℃；一个小时后加入终浓度为0.6 mM的IPTG，并诱导表达过夜。
（3）收集菌体：于4200 rpm，4℃下离心15 min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl），悬浮菌体细胞；细胞破碎前加入终浓度为2 mM的蛋白酶抑制剂PMSF（Phenylmethyl sulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟）。
（4）超声破碎细胞：400W下，超声3s，间隔6s，工作60次。
（5）超速离心：细胞裂解液于14000 rpm，4℃下离心50 min，收集上清液，进行下一步的分离纯化。
（6）Ni-NTA亲和层析：将上清液体倒入Ni-NTA柱中。
流净后，用wash buffer （25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，15 mM imidazole）冲洗10个柱体积，除去杂蛋白；最后使用elution buffer（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，250 mM imidazole）将目的蛋白洗脱下来。
使用SDS-PAGE检测蛋白的可溶性、挂柱效率及蛋白的浓度。
由于本实验中YdiV等蛋白都是连接到pGl01载体中，带有可以用PPase切除的6×His标签。
为了获得更纯净的、不带标签的蛋白，我们在有那个wash buffer冲洗去除杂蛋白以后，每根镍柱中加入5 ml的重悬缓冲液然后加入100-200 μL的PPase，3-5 h后，用5 ml重选冲洗柱子，电泳检测酶切效率。
（7）阴离子交换层析纯化：先平衡离子交换柱。
然后将上一步洗脱下的蛋白用溶液A（25 mM Tris-HCl, pH8.0）稀释4-6倍，上样到离子交换柱Source Q上，使用溶液A与溶液B（25mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl）进行线性梯度洗脱。
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蛋 蛋白 白质 质纯 纯化 化实 实验验室 实 实验 验手 手册册 2007年 10月第一章 外源基因在大肠杆菌中的表达一、通过聚合酶链式反应（PCR）将靶基因亚克隆到质粒载体上 （一）PCR 引物设计的基本原则与 PCR 反应组分和条件1. PCR 引物设计的基本原则（1）引物与靶基因间配对的碱基一般为 1520。
（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G + C含量 宜在 4555%左右。
（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在 3’末端不应有互补链存在。
（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。
可用计算机进行辅助检索分析。
（5）引物 3’末端一般以单个 C或 G结尾。
2. PCR 反应组分和条件PCR 反应体系一般选用 50 μl体积，其中含有：10×Reaction buffer，5 μl2 个引物，各 12.525 pmol (终浓度各 0.250.50 μmol/L)4 种底物（dATP + dCTP + dGTP + dTTP），各 200μmol/L模板 DNA，100 ng左右Taq DNA 聚合酶，2.53 UPCR 反应条件一般为：（1）94℃，5分钟（2）94℃变性 3060 秒（3）5055℃退火 3060秒（4）7072℃延伸 3060秒℃ 10分钟（5）725共进行 2535次循环。
循环是步骤（2）和（4）(二) 质粒 DNA的小量制备1、传统方法（1）用灭菌牙签挑单菌落于 3 ml LB 培养液中，37℃培养过夜。
（2）在每个 EP管中倒入 1 ml 左右的过夜培养物，6,000 rpm 离心 1分钟以收集 菌体。
（3）将菌体重悬于 100 μl 4℃预冷的溶液 I中，并加入 200 μl新配制的溶液 II, 盖 紧管口，快速颠倒离心管 67次，然后，冰浴 5 分钟。
（4）加 150 μl 4℃预冷的溶液 III, 倒置 56次以混合内容物，然后，冰浴 5 分钟。
（5）12,000 rpm 离心 10分钟后，小心吸取上清至另一 EP管中。
（6）加 2倍体积的无水乙醇，振荡混合，并在室温放置 5分钟。
（7）12,000 rpm离心 5分钟后，移去上清，并用 70%乙醇漂洗 DNA沉淀。
DNA 沉淀自然干燥，并溶于 20 μl 双蒸水或 1×TE 缓冲液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。
2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA纯化方法离心方案（适用于产品 A1330， A1340，A1460及 A1470）（1）12,000 rpm离心 1分钟，以沉淀 110 ml过夜培养物。
（2）用 250μl Cell Resuspension Solution充分悬浮大肠杆菌细胞。
（3）加 250μl Cell Lysis Solution，倒置 56 次混合。
（4）加 10μl Alkaline Protease Solution，倒置 56次混合，室温放置 5分钟。
（5）加 350μl Neutralization Solution，倒置 56 次混合。
（6）室温，最高转速离心 10分钟，回收上清。
（7）将离心柱插入收集管中。
（8）将上清倒入离心柱中。
（9）室温，最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将离心柱重新插入收集管中。
（10）加 750μl Wash Solution（加乙醇），最高转速离心 1分钟，倒掉流穿液，将 离心柱重新插入收集管中。
（11）重复步骤（10）（用 250μl Wash Solution）。
（12）室温，最高转速离心 2分钟。
（13）将离心柱插入一个无菌的 1.5 ml微量离心管中。
（14）在离心柱中加 50100μl NucleaseFree Water，室温，最高转速离心 1分钟。
（15）DNA溶液保存在20℃备用。
(三) 质粒 DNA 的中量制备1. 在100 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB培养液中加入1 ml pET15b/Novablue 甘油菌，37℃培养过夜；℃ 4,000 rpm离心 10分钟以收集菌体；在菌体用 3 ml 溶液 I (50 mmol/L 葡2. 4 ,萄糖，25 mmol/L Tris, pH 8.0, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0) 充分悬浮后，加入 6 ml 溶液 II (0.2 mol/L NaOH, 1% SDS)，并倒置混合，冰浴 510分钟；3. 加入4.5 ml 溶液 III（60ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml 冰乙酸和 28.5ml水），轻 摇混合，冰浴 10分钟；4. 4℃，12,000 rpm 离心 20分钟，小心吸取上清至另一个 50 ml离心管中；加入 0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10分钟；5. 室温，10,000 rpm离心 10分钟以沉淀 DNA；6. 在沉淀用 70%乙醇漂洗，自然干燥，并溶于 0.3 ml 的 TE (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 缓冲液中，然后转入 EP管中；7. 加入等体积的 5 mol/L LiCl, 室温，10,000 rpm离心 10 分钟以沉淀大分子 RNA 分子；8. 回收上清，加入等体积的异丙醇，室温放置 10 分钟，12,000 rpm 离心 5 分钟以 沉淀 DNA；9. DNA沉淀用 70%乙醇漂洗，然后，自然干燥；10. DNA沉淀溶于 200 μl含 50100 μg/ml 胰 RNA 酶的 TE缓冲液中， 在 37℃保温 30 分钟；11. 加入等体积的 13% PEG8000/1.6 mol/L NaCl, 室温放置 5 分钟； 12,000 rpm 离 心 10分钟以沉淀 DNA；12. 小心移去上清，DNA沉淀溶于 200 μl TE (pH 8.0) 缓冲液中，并用酚氯仿异 戊醇（25:24:1）抽提一次；小心将上层溶液转移到一个干净的 EP管中，并加入 0.1体 积的 3mol/L NaAc (pH 5.2)和 2倍无水乙醇，混匀，40℃放置 30分钟；13. 12,000 rpm 离心 5分钟以沉淀 DNA； DNA沉淀用 70%的乙醇漂洗， 自然干燥， 并溶于 100 μl TE 缓冲液中。
最后，用 1%的琼脂糖凝胶电泳对 DNA进行定量和纯度鉴定。
（四）DNA（PCR 产物或质粒）的酶切1. 一般在 1520μl体积中酶切 0.21 μg的 DNA，可根据实际情况，按比例放大酶切 反应的体积和 DNA的量。
2. 一般用 78 u 的限制性内切酶酶切 1 μg的 DNA，酶:DNA的比率应小于 25u/μg， 以防止 star activity。
3. 限制性内切酶一般保存在 50%的甘油中，而大于 5%的甘油可能会引起 star activity 或抑制酶切反应。
因此，在酶切反应体系中，甘油的浓度一般应小于 5%，也 就是说，限制性内切酶的体积应小于酶切反应总体积的 1/10。
4. 对于双酶切反应，可考虑在同一种缓冲液中进行，一般要求任一一种限制性内切 酶的活性不低于其最大活性的 50%。
5. 酶切反应的时间一般为 23 小时。
如果酶切不完全，可适当延长酶切反应的时间。
（五） 从琼脂糖凝胶或PCR反应物中回收DNA（用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR CleanUp System—适用于产品 A9280、A9281 及 A9282）1. 从琼脂糖凝胶中切下含 DNA的胶条，并放入一洁净的 EP管中。
按每 10 mg 胶 条加 10 μl的 Membrane Binding Solution，漩涡震荡，并在 5060℃保温直到胶条完全 溶解；对于 PCR反应物，可直接加等体积的 Membrane Binding Solution混合。
2. 将 SV 微柱插入收集管中，并将上述溶液加入 SV微柱，室温放置 1分钟。
3. 10,000 g离心 1 分钟，丢弃流穿液，重新将微柱插入收集管中。
4. 加 700 μl Membrane Wash Soluton，10,000 g离心 1 分钟，丢弃流穿液，重新将 微柱插入收集管中。
5. 用 500 μl Membrane Wash Solution 重复步骤 4，10,000 g 离心 5分钟。
6. 小心将微柱插入一洁净的 EP管中。
7. 在微柱中加 50 μl NucleaseFree Water，室温放置 1分钟，10,000 g离心 1 分钟。
8. 丢弃微柱，将 DNA储存在 4℃或20℃。
（六）PCR 产物或 DNA 酶切片断与质粒载体的连接1. 常规方法加酶切并回收的质粒载体50100 μg左右及1 μl的T4 DNA 一般在10μl反应体系中，连接酶（35 u/μl），按 PCR产物或 DNA酶切片断摩尔数与载体摩尔数比约为 3:1 的比 例进行连接。
连接反应在 1316℃保温过夜。
2. 快速连接方法可以通过连接 Kit进行。
例如，对于 Takara 公司的连接 Kit，可在载体与插入片段 的混合液（5 μl）中加入 5 μl Kit溶液，16℃保温 2 小时即可。
（七）大肠杆菌感受态细胞的制备1. 单菌落接种于 3 ml LB 培养液中，37℃过夜培养。
2. 取 2 ml 过夜培养物接种于 200 ml LB 培养液中，并且，当 37℃培养至 OD600 为 0.4左右时，转移至 250 ml离心管中，立即冰浴 30 分钟。
3. 在 4℃，3,600 rpm离心 10分钟，弃上清，加 4℃预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液 10 ml, 轻摇以充分悬浮细胞。
4. 转移至 50 ml 离心管中，在 4℃，3,500rpm离心 7分钟，小心弃上清。
5. 加 5 ml 预冷的 0.1 mol/L CaCl2 ，轻摇离心管以充分悬浮细胞；冰浴 2小时后， 加 4℃预冷的 80%甘油至终浓度为 15%，混匀分装，并保存于70℃。