柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因片段的克隆与序列分析
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堕噬童隆
利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取的北柴胡根尖的总ＲＮＡ为
模板，经ＲＴ—ＰＣＲ后，凝胶电泳显示得到４７０ｂｐ、 ５３０ｂｐ及４６０ｂｐ左右的ＰＣＲ产物（图２）。ＰＣＲ片段纯 化后，连接到ＰＭＤｌ９一Ｔ载体上，蓝白斑筛选获得阳 性转化子，进一步提取质粒，用原引物进行ＰＣＲ扩 增，再用位于克隆位点两侧的限制酶切出插入片段， 与ＰＣＲ扩增产物作电泳比较，结果初步证明这些 ＰＣＲ扩增片段已被成功克隆。将此阳性克隆测序，结
万方数据
［Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ胁妣妇ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ］ ５８
２００８第十卷第五期
Ｖ０１．１０ Ｎｏ．５
果显示插入的ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因ｃＤＮＡ片段大
小分别为４７０ｂｐ、５３２ｂｐ、４６６ｂｐ。 ３．ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因ｃＤＮＡ片断的序列分析
ｈｙｄｒｏｘｙ一３一ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．ＨＭ— ＧＲ）是ＭＶＡ途径的一个关键酶，它在ＮＡＤＰＨ存在
ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＩＰＰ）虽是萜类化合物的共同前体，但在 生物合成过程中ＩＰＰ自身并不能通过自身缩合来实 现碳链延伸，而是首先通过异构反应形成甲基丙稀
研究方向：药用植物学，Ｔｅｌ：０１０－６２３３７８５５，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｊｈｕｂｉｏ＠１６３．ｃｏｍ。
万方数据
［‰枷Ｓｃ／ｅｎｅｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ】５６
２００８第十卷第五期－ｒＶ０１．１０ Ｎｏ．５
５７［Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ∥Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ］
万方数据
世界科学技术一中医药现代化★基础研究
０．５１ｘＬ ＡＭＶ逆转录酶（５Ｕ／ｔｒＬ），用ＤＥＰＣ水补齐至 １０Ｌ体系。４２℃温育４０ｍｉｎ后于一２０℃存放。
（２）ＰＣＲ扩增。 ＰＣＲ扩增总的反应体系为２５１山Ｌ，其中１０ｘＥｘ Ｔａｇ ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍ９２＋）２．５１ｘＬ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２恤Ｌ，１０ ｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各ｌｌｘＬ，模板ｃＤＮＡ第一链２斗Ｌ， ５Ｕ／“Ｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．２斗Ｌ，重蒸超纯水
１６．３斗Ｌ。
三、结果与分析
１．总ＲＭ△握壑 北柴胡总ＲＮＡ的琼脂糖凝胶电泳检测结果见 图１。可以清晰地看出３条ｒＲＮＡ条带（２８Ｓ ｒＲＮＡ、 １８Ｓ ｒＲＮＡ和５Ｓ ｒＲＮＡ），其中２８Ｓ ｒＲＮＡ条带的亮度 大约为１８Ｓ ｒＲＮＡ的２倍，说明了总ＲＮＡ良好的完
泳道１：ＨＭＧＲ；泳道２：ＩＰＰＩ；泳道３：ＦＰＳ；Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ 图２北柴胡来自百度文库ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因的ＲＴ—ＰＣＲ产物
整性。进一步通过紫外分光光度法测得吸光度（Ａ） 值，Ａ２６０／Ａ２８０比值介于１．８～２．０，表明总ＲＮＡ纯度 较高，酚类、多糖、蛋白质和无机盐等杂质已基本去 除干净。此提取方法提取时间仅为１．５ｄ左右，大大提 高了提取效率，降低了ｍＲＮＡ降解的风险。
２．皇垦錾翅丛丛Ｑ照，！￡堕，￡堕基因璺旦盟△塑！兰筮
北柴胡（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ ｅｈｉｎｅｎｓｅ ＤＣ．）为伞形科柴胡 属植物，是药用柴胡的主要来源之一，其中所含的 主要有效成分柴胡皂苷类具有抗炎、保肝利胆、抗 菌、抗病毒、抗肿瘤、降低血压等作用”引。柴胡皂苷 是一种齐墩果烷类型的ｉ萜化合物，虽然其生物合 成途径到目前为止并不清楚，但Ｋｉｍ等１４１通过三岛 柴胡毛状根研究ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因表达水平 与柴胡皂苷含量的关系时发现在用３倍的毛状根 培养基培养时，ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因的表达水平与 柴胡皂苷的含量都迅速提高。除此之外，关于柴胡 皂苷合成途径的研究还很不深入，这些关键酶基因 在柴胡植株内的表达及功能尚不清楚。到目前为 止，还未见关于从北柴胡中克隆ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ 基因的报道。本文采用ＲＴ—ＰＣＲ方法首次从北柴胡 植株中克隆了ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因核心ｃＤＮＡ 片段，并进行了初步的序列分析，对从分子水平上 探讨三萜皂苷生物合成机制具有重要意义，为进一 步研究关键酶基因的表达特征和柴胡皂苷的代谢 调控打下了基础。
司，ＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ购自日本博日公司，内 切酶为美国ＮＥＢ产品。
二、方法
１．北柴胡根总ＲＮＡ提取 由于北柴胡根中含的多糖及次生物质较多，因 此北柴胡总ＲＮＡ的提取采用本实验室改进的ｔｒｉｚｏｌ 方法。（１）取ｌＯＯｍｇ北柴胡的幼嫩根，液氮速冻后研 磨成粉末，移入１．５ｍＬ预先冷却的离心管。（２）力１１人 ｌｍＬ ｔｒｉｚｏｌ试剂，轻轻摇匀，室温放置５ｍｉｎ。（３）再次 混匀后于１２０００ｘｇ、４。Ｃ离心１０ｍｉｎ。（４）取上清液，加 入ｌＯＯｍＬ ５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ，轻轻摇匀，再加３００ｍＬ的酚一 氯仿一异戊醇（２５：２４：１），混匀后于１２０００ｘｇ、４０Ｃ离心 ｌＯｍｉｎ。（５）将上层水相转移至另一离心管中，加入 ３００ｍＬ的酚一氯仿一异戊醇（２５：２４：１），重复抽提一次。 （６）取上清液，加两倍体积的无水乙醇，混匀，室温放 置ｌＯｍｉｎ。（７）１２０００ｘｇ、４。Ｃ离心１０ｍｉｎ。（７）弃去上清 液，沉淀用７０％乙醇洗两次，室温下干燥１０ｍｉｎ。（８） 沉淀溶于２０１ｘＬ ＤＥＰＣ水中，取３１ｘＬ用于１％的琼脂 糖凝胶电泳检测，其余一８０℃冰箱中保存备用。 ２．引物设计与合成 引物的设计依据其它植物的ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ 基因的保守序列，并参照Ｋｉｍ等【４１发表的引物序列设 计。ＨＭＧＲ基因上游引物Ｈ１为：５’一ＧＧＴＧＡＴＧ— ＣＡＡＴＧＧＧＡＡＴＧＡＡｃＡＴＧ一３’．下游弓Ｉ物Ｈ２为：５ ７一 Ｇ７ＩＴＩ’ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧ７Ｉ＇ＡＣＣＡＡＣＣＴ一３’；ＩＰＰＩ基因上 游引物１１为：５ ７一ＣＡＡＡＴＡＴＡＡＴＦＧＴＣＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡ Ａ一３’，下游引物１２为：５’一ＣＣＡＣＣＡＣｒｌｌＷＡＷＣＡＡ— ＧＡＡＡＴＹＧＴＣ一３’；ＦＰＳ基因上游引物Ｆｌ为：５ ７一 ＣＴＹＧＧＴＹＧＧＴＧＹＡＴｒＧＡＡＴＧＧＣＴ一３’，下游引物·Ｆ２ 为：５ ７一ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴｒＧＡＡＡＧＴＡＧＲＴＴＣＣＣＡ一３ ７。 引物的合成由北京博迈德科技发展有限公司完成。 ３．ＲＴ—ＰＣＲ反应体系及扩增条件 （１）ｃＤＮＡ第一链的合成。 将２斗Ｌ ＲＮＡ和基因（ＨＭＧＲ／ＩＰＰＩ／ＦＰＳ）下游引物 １斗Ｌ（１０斗ｍｏｌ，Ｌ）于７０。Ｃ水浴１０ ｍｉｎ打开其二级结构， 立即插入冰中１０ ｍｉｎ，依次加入４／ｘＬ ｄＮＴＰ（２．５ｒｅｔｏｏｌ／ Ｌ），１¨Ｌ１０ ｘＡＭＶ Ｂｕｆｆｅｒ，０．２５斗Ｌ ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／斗Ｌ），
本文经编委遴选，英文版将通过ＳｃｉｅｎｃｅＤｉｒｅｃｔ全球发行。
摘要：本文以北柴胡幼嫩根的总ＲＮＡ为模板，通过ＲＴ—ＰＣＲ方法，克隆出３一羟基一３甲基戊二 酰辅酶Ａ还原酶（３－ｈｙｄｒｏｘｙ一３一ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＨＭＧＲ）、异戊烯基焦磷酸异构酶 （ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＩＰＰＩ）和法尼基焦磷酸合酶（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦＰＳ）基因 的ｃＤＮＡ片断，大小分别为４７０ｂｐ、５３２ｂｐ、４６６ｂｐ，分别编码１５７、１７７、１５５个氨基酸多肽。提交到Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ上，得到登陆号分别为：ＨＭＧＲ（ＥＵ４００２１７）、ＩＰＰＩ（ＥＵ４００２１８）、ＦＰＳ（ＥＵ４００２１９）。ＮＣＢＩ在线ｂｌａｓｔ 结果表明，推断的北柴胡ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因的氨基酸序列分别与杜仲、三岛柴胡和雷公藤的一 致性最高，分别为９３％、９９％、９７％。对ＨＭＧＲ基因和ＦＰＳ基因进行特征性保守域分析，结果显示，推 断的ＨＭＧＲ氨基酸序列存在两个ＮＡＤＰＨ结合基序，ＦＰＳ存在三个特征性保守序列：ＤＤＩＭＤ、ＧＱＭＩＤ 和ＫＬ。构建的植物ＩＰＰｌ的分子进化树表明，北柴胡ＩＰＰＩ基因与伞形科植物（胡萝卜和三岛柴胡）亲缘 关系最近，与单子叶植物（玉米和水稻）亲缘关系较远。本文首次分离报道了北柴胡柴胡皂苷合成途径 中三个关键酶基因（ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ）ｃＤＮＡ的克隆，新获得的基因片段序列为进一步克隆全序列 和了解调控柴胡皂苷的生物合成奠定了基础。
一、材料与试剂
１．丝盘 本试验所用材料采自中国医学科学院药用植物 研究所试验田中栽种的北柴胡品种“中柴Ｉ号”。采 集一年生北柴胡盛花期的幼嫩根，用锡箔纸迅速包 好后，冻存于液氮中。 ２．达 型 Ｔｆｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｂ型小量胶回收 纯化试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责 任公司，Ｅｘ Ｔａｑ酶、ｐＭＤｌ９一Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ公
关键词：北柴胡 柴胡皂苷３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶（ＨＭＧＲ） 异戊烯基焦磷酸异 构酶（ＩＰＰＩ） 法尼基焦磷酸合酶（ＦＰＳ）
甲羟戊酸（ＭＶＡ）途径是植物体内合成萜类的主 的条件下可催化３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ生成
要途径。３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶（３一 ＭＶＡ。由ＭＶＡ形成的异戊烯焦磷酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ
ＩＰＰ，从而形成不同长度的碳链，因此ＩＰＰ异构反应速 度的快慢直接决定了萜类物质形成的速度。所以异 戊烯基焦磷酸异构酶（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏ— ｍｅｒａｓｅ，ＩＰＰＩ）可能对萜类的生物合成具有重要意义。 法尼基焦磷酸合酶（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ， ＦＰＳ）催化两分子ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ头尾相接缩合为法 尼基焦磷酸（ｆａｍｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＦＰＰ），继而形成萜 类化合物。
收稿日期：２００８＿０７一１４
基焦磷酸酯（ＤＭＡＰＰ），然后向ＤＭＡＰＰ上逐个添加
修回日期：２００８－－０９—１５
★
国家科技支撑计划重点项目（２００６ＢＡｌ０９ＢＯ！）：生物技术与中药材优良品种选育研究，负责人：魏建和；国家中医药管理局科技专项
（２００４ＺＸ０６－３）：北柴胡、丹参、川贝母种子种苗质量标准化、规范化示范研究，负责人：陈士林。 ★★ 联系人：魏建和，研究员，主要研究方向：药用植物基因资源及分子育种研究。Ｔｅｌ：０１０－６２８１８８４１，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｊｉａｎｈ＠２６３．ｎｅｔ；刘玉军，教授，主要
（３）ＰＣＲ反应条件。 ９５℃预变性５ｍｉｎ；然后９４℃变性３０ｓ。退火３０ｓ （ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰｓ基因的退火温度分别为５７℃、 ５５．８℃、４５．８℃），７２℃延伸２ｍｉｎ，３５个循环；最后７２℃ 延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用ｌ％的琼脂糖凝胶电泳检测。 （４）ＰＣＲ产物回收、克隆及序列测定。 ＰＣＲ产物经ｌ％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片 段，用胶回收试剂盒经回收纯化后与ＰＭＤｌ９一Ｔ载体 在１６℃下连接过夜，将连接产物转化入Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｅｔ 感受态细胞中。在ＬＢ／ＡＭＰ／ＩＰｒＧ／Ｘ—Ｇａｌ平板上筛选 阳性克隆，然后随机挑选５个白斑菌落和一个蓝斑 菌落，抽提质粒ＤＮＡ，对质粒ＤＮＡ进行双酶切鉴定、 ＰＣＲ鉴定和蓝白斑质粒ＤＮＡ比较鉴定。鉴定结果为 阳性克隆的用于测序，测序工作由北京三博远志生 物技术有限责任公司完成。 （５）序列分析。 将所测定的序列结果通过ＢＬＡＳＴ搜索Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）的蛋白质 和核苷酸数据库，将所测序列通过ＤＮＡＭＡＮ软件寻 找最大读码框，翻译成氨基酸序列并与其他植物的 ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因的氨基酸序列进行多重比较。 特征序列查找及分子系统进化分析也是通过ＤＮＡ— ＭＡＮ软件完成。
利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取的北柴胡根尖的总ＲＮＡ为
模板，经ＲＴ—ＰＣＲ后，凝胶电泳显示得到４７０ｂｐ、 ５３０ｂｐ及４６０ｂｐ左右的ＰＣＲ产物（图２）。ＰＣＲ片段纯 化后，连接到ＰＭＤｌ９一Ｔ载体上，蓝白斑筛选获得阳 性转化子，进一步提取质粒，用原引物进行ＰＣＲ扩 增，再用位于克隆位点两侧的限制酶切出插入片段， 与ＰＣＲ扩增产物作电泳比较，结果初步证明这些 ＰＣＲ扩增片段已被成功克隆。将此阳性克隆测序，结
万方数据
［Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ胁妣妇ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ］ ５８
２００８第十卷第五期
Ｖ０１．１０ Ｎｏ．５
果显示插入的ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因ｃＤＮＡ片段大
小分别为４７０ｂｐ、５３２ｂｐ、４６６ｂｐ。 ３．ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因ｃＤＮＡ片断的序列分析
ｈｙｄｒｏｘｙ一３一ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．ＨＭ— ＧＲ）是ＭＶＡ途径的一个关键酶，它在ＮＡＤＰＨ存在
ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＩＰＰ）虽是萜类化合物的共同前体，但在 生物合成过程中ＩＰＰ自身并不能通过自身缩合来实 现碳链延伸，而是首先通过异构反应形成甲基丙稀
研究方向：药用植物学，Ｔｅｌ：０１０－６２３３７８５５，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｊｈｕｂｉｏ＠１６３．ｃｏｍ。
万方数据
［‰枷Ｓｃ／ｅｎｅｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ】５６
２００８第十卷第五期－ｒＶ０１．１０ Ｎｏ．５
５７［Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ∥Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ］
万方数据
世界科学技术一中医药现代化★基础研究
０．５１ｘＬ ＡＭＶ逆转录酶（５Ｕ／ｔｒＬ），用ＤＥＰＣ水补齐至 １０Ｌ体系。４２℃温育４０ｍｉｎ后于一２０℃存放。
（２）ＰＣＲ扩增。 ＰＣＲ扩增总的反应体系为２５１山Ｌ，其中１０ｘＥｘ Ｔａｇ ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍ９２＋）２．５１ｘＬ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２恤Ｌ，１０ ｍｏｌ／Ｌ上、下游引物各ｌｌｘＬ，模板ｃＤＮＡ第一链２斗Ｌ， ５Ｕ／“Ｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．２斗Ｌ，重蒸超纯水
１６．３斗Ｌ。
三、结果与分析
１．总ＲＭ△握壑 北柴胡总ＲＮＡ的琼脂糖凝胶电泳检测结果见 图１。可以清晰地看出３条ｒＲＮＡ条带（２８Ｓ ｒＲＮＡ、 １８Ｓ ｒＲＮＡ和５Ｓ ｒＲＮＡ），其中２８Ｓ ｒＲＮＡ条带的亮度 大约为１８Ｓ ｒＲＮＡ的２倍，说明了总ＲＮＡ良好的完
泳道１：ＨＭＧＲ；泳道２：ＩＰＰＩ；泳道３：ＦＰＳ；Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ 图２北柴胡来自百度文库ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因的ＲＴ—ＰＣＲ产物
整性。进一步通过紫外分光光度法测得吸光度（Ａ） 值，Ａ２６０／Ａ２８０比值介于１．８～２．０，表明总ＲＮＡ纯度 较高，酚类、多糖、蛋白质和无机盐等杂质已基本去 除干净。此提取方法提取时间仅为１．５ｄ左右，大大提 高了提取效率，降低了ｍＲＮＡ降解的风险。
２．皇垦錾翅丛丛Ｑ照，！￡堕，￡堕基因璺旦盟△塑！兰筮
北柴胡（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ ｅｈｉｎｅｎｓｅ ＤＣ．）为伞形科柴胡 属植物，是药用柴胡的主要来源之一，其中所含的 主要有效成分柴胡皂苷类具有抗炎、保肝利胆、抗 菌、抗病毒、抗肿瘤、降低血压等作用”引。柴胡皂苷 是一种齐墩果烷类型的ｉ萜化合物，虽然其生物合 成途径到目前为止并不清楚，但Ｋｉｍ等１４１通过三岛 柴胡毛状根研究ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因表达水平 与柴胡皂苷含量的关系时发现在用３倍的毛状根 培养基培养时，ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因的表达水平与 柴胡皂苷的含量都迅速提高。除此之外，关于柴胡 皂苷合成途径的研究还很不深入，这些关键酶基因 在柴胡植株内的表达及功能尚不清楚。到目前为 止，还未见关于从北柴胡中克隆ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ 基因的报道。本文采用ＲＴ—ＰＣＲ方法首次从北柴胡 植株中克隆了ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因核心ｃＤＮＡ 片段，并进行了初步的序列分析，对从分子水平上 探讨三萜皂苷生物合成机制具有重要意义，为进一 步研究关键酶基因的表达特征和柴胡皂苷的代谢 调控打下了基础。
司，ＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ购自日本博日公司，内 切酶为美国ＮＥＢ产品。
二、方法
１．北柴胡根总ＲＮＡ提取 由于北柴胡根中含的多糖及次生物质较多，因 此北柴胡总ＲＮＡ的提取采用本实验室改进的ｔｒｉｚｏｌ 方法。（１）取ｌＯＯｍｇ北柴胡的幼嫩根，液氮速冻后研 磨成粉末，移入１．５ｍＬ预先冷却的离心管。（２）力１１人 ｌｍＬ ｔｒｉｚｏｌ试剂，轻轻摇匀，室温放置５ｍｉｎ。（３）再次 混匀后于１２０００ｘｇ、４。Ｃ离心１０ｍｉｎ。（４）取上清液，加 入ｌＯＯｍＬ ５ｍｏｌ／Ｌ Ｎａｃｌ，轻轻摇匀，再加３００ｍＬ的酚一 氯仿一异戊醇（２５：２４：１），混匀后于１２０００ｘｇ、４０Ｃ离心 ｌＯｍｉｎ。（５）将上层水相转移至另一离心管中，加入 ３００ｍＬ的酚一氯仿一异戊醇（２５：２４：１），重复抽提一次。 （６）取上清液，加两倍体积的无水乙醇，混匀，室温放 置ｌＯｍｉｎ。（７）１２０００ｘｇ、４。Ｃ离心１０ｍｉｎ。（７）弃去上清 液，沉淀用７０％乙醇洗两次，室温下干燥１０ｍｉｎ。（８） 沉淀溶于２０１ｘＬ ＤＥＰＣ水中，取３１ｘＬ用于１％的琼脂 糖凝胶电泳检测，其余一８０℃冰箱中保存备用。 ２．引物设计与合成 引物的设计依据其它植物的ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ 基因的保守序列，并参照Ｋｉｍ等【４１发表的引物序列设 计。ＨＭＧＲ基因上游引物Ｈ１为：５’一ＧＧＴＧＡＴＧ— ＣＡＡＴＧＧＧＡＡＴＧＡＡｃＡＴＧ一３’．下游弓Ｉ物Ｈ２为：５ ７一 Ｇ７ＩＴＩ’ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧ７Ｉ＇ＡＣＣＡＡＣＣＴ一３’；ＩＰＰＩ基因上 游引物１１为：５ ７一ＣＡＡＡＴＡＴＡＡＴＦＧＴＣＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡ Ａ一３’，下游引物１２为：５’一ＣＣＡＣＣＡＣｒｌｌＷＡＷＣＡＡ— ＧＡＡＡＴＹＧＴＣ一３’；ＦＰＳ基因上游引物Ｆｌ为：５ ７一 ＣＴＹＧＧＴＹＧＧＴＧＹＡＴｒＧＡＡＴＧＧＣＴ一３’，下游引物·Ｆ２ 为：５ ７一ＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴｒＧＡＡＡＧＴＡＧＲＴＴＣＣＣＡ一３ ７。 引物的合成由北京博迈德科技发展有限公司完成。 ３．ＲＴ—ＰＣＲ反应体系及扩增条件 （１）ｃＤＮＡ第一链的合成。 将２斗Ｌ ＲＮＡ和基因（ＨＭＧＲ／ＩＰＰＩ／ＦＰＳ）下游引物 １斗Ｌ（１０斗ｍｏｌ，Ｌ）于７０。Ｃ水浴１０ ｍｉｎ打开其二级结构， 立即插入冰中１０ ｍｉｎ，依次加入４／ｘＬ ｄＮＴＰ（２．５ｒｅｔｏｏｌ／ Ｌ），１¨Ｌ１０ ｘＡＭＶ Ｂｕｆｆｅｒ，０．２５斗Ｌ ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／斗Ｌ），
本文经编委遴选，英文版将通过ＳｃｉｅｎｃｅＤｉｒｅｃｔ全球发行。
摘要：本文以北柴胡幼嫩根的总ＲＮＡ为模板，通过ＲＴ—ＰＣＲ方法，克隆出３一羟基一３甲基戊二 酰辅酶Ａ还原酶（３－ｈｙｄｒｏｘｙ一３一ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＨＭＧＲ）、异戊烯基焦磷酸异构酶 （ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＩＰＰＩ）和法尼基焦磷酸合酶（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦＰＳ）基因 的ｃＤＮＡ片断，大小分别为４７０ｂｐ、５３２ｂｐ、４６６ｂｐ，分别编码１５７、１７７、１５５个氨基酸多肽。提交到Ｇｅｎ— Ｂａｎｋ上，得到登陆号分别为：ＨＭＧＲ（ＥＵ４００２１７）、ＩＰＰＩ（ＥＵ４００２１８）、ＦＰＳ（ＥＵ４００２１９）。ＮＣＢＩ在线ｂｌａｓｔ 结果表明，推断的北柴胡ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ基因的氨基酸序列分别与杜仲、三岛柴胡和雷公藤的一 致性最高，分别为９３％、９９％、９７％。对ＨＭＧＲ基因和ＦＰＳ基因进行特征性保守域分析，结果显示，推 断的ＨＭＧＲ氨基酸序列存在两个ＮＡＤＰＨ结合基序，ＦＰＳ存在三个特征性保守序列：ＤＤＩＭＤ、ＧＱＭＩＤ 和ＫＬ。构建的植物ＩＰＰｌ的分子进化树表明，北柴胡ＩＰＰＩ基因与伞形科植物（胡萝卜和三岛柴胡）亲缘 关系最近，与单子叶植物（玉米和水稻）亲缘关系较远。本文首次分离报道了北柴胡柴胡皂苷合成途径 中三个关键酶基因（ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ和ＦＰＳ）ｃＤＮＡ的克隆，新获得的基因片段序列为进一步克隆全序列 和了解调控柴胡皂苷的生物合成奠定了基础。
一、材料与试剂
１．丝盘 本试验所用材料采自中国医学科学院药用植物 研究所试验田中栽种的北柴胡品种“中柴Ｉ号”。采 集一年生北柴胡盛花期的幼嫩根，用锡箔纸迅速包 好后，冻存于液氮中。 ２．达 型 Ｔｆｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｂ型小量胶回收 纯化试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责 任公司，Ｅｘ Ｔａｑ酶、ｐＭＤｌ９一Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ公
关键词：北柴胡 柴胡皂苷３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶（ＨＭＧＲ） 异戊烯基焦磷酸异 构酶（ＩＰＰＩ） 法尼基焦磷酸合酶（ＦＰＳ）
甲羟戊酸（ＭＶＡ）途径是植物体内合成萜类的主 的条件下可催化３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ生成
要途径。３一羟基一３甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶（３一 ＭＶＡ。由ＭＶＡ形成的异戊烯焦磷酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ
ＩＰＰ，从而形成不同长度的碳链，因此ＩＰＰ异构反应速 度的快慢直接决定了萜类物质形成的速度。所以异 戊烯基焦磷酸异构酶（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏ— ｍｅｒａｓｅ，ＩＰＰＩ）可能对萜类的生物合成具有重要意义。 法尼基焦磷酸合酶（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ， ＦＰＳ）催化两分子ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ头尾相接缩合为法 尼基焦磷酸（ｆａｍｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＦＰＰ），继而形成萜 类化合物。
收稿日期：２００８＿０７一１４
基焦磷酸酯（ＤＭＡＰＰ），然后向ＤＭＡＰＰ上逐个添加
修回日期：２００８－－０９—１５
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国家科技支撑计划重点项目（２００６ＢＡｌ０９ＢＯ！）：生物技术与中药材优良品种选育研究，负责人：魏建和；国家中医药管理局科技专项
（２００４ＺＸ０６－３）：北柴胡、丹参、川贝母种子种苗质量标准化、规范化示范研究，负责人：陈士林。 ★★ 联系人：魏建和，研究员，主要研究方向：药用植物基因资源及分子育种研究。Ｔｅｌ：０１０－６２８１８８４１，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｊｉａｎｈ＠２６３．ｎｅｔ；刘玉军，教授，主要
（３）ＰＣＲ反应条件。 ９５℃预变性５ｍｉｎ；然后９４℃变性３０ｓ。退火３０ｓ （ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰｓ基因的退火温度分别为５７℃、 ５５．８℃、４５．８℃），７２℃延伸２ｍｉｎ，３５个循环；最后７２℃ 延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用ｌ％的琼脂糖凝胶电泳检测。 （４）ＰＣＲ产物回收、克隆及序列测定。 ＰＣＲ产物经ｌ％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片 段，用胶回收试剂盒经回收纯化后与ＰＭＤｌ９一Ｔ载体 在１６℃下连接过夜，将连接产物转化入Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ｅｔ 感受态细胞中。在ＬＢ／ＡＭＰ／ＩＰｒＧ／Ｘ—Ｇａｌ平板上筛选 阳性克隆，然后随机挑选５个白斑菌落和一个蓝斑 菌落，抽提质粒ＤＮＡ，对质粒ＤＮＡ进行双酶切鉴定、 ＰＣＲ鉴定和蓝白斑质粒ＤＮＡ比较鉴定。鉴定结果为 阳性克隆的用于测序，测序工作由北京三博远志生 物技术有限责任公司完成。 （５）序列分析。 将所测定的序列结果通过ＢＬＡＳＴ搜索Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）的蛋白质 和核苷酸数据库，将所测序列通过ＤＮＡＭＡＮ软件寻 找最大读码框，翻译成氨基酸序列并与其他植物的 ＨＭＧＲ、ＩＰＰＩ、ＦＰＳ基因的氨基酸序列进行多重比较。 特征序列查找及分子系统进化分析也是通过ＤＮＡ— ＭＡＮ软件完成。