硅胶柱层析技术

4 溶剂的选择 溶剂的选择也许是整个柱色谱分离操作中最困难之处, 溶剂的选择也许是整个柱色谱分离操作中最困难之处,也是实验成功 的最关键之处.溶剂通常先利用简便的硅胶薄层色谱进行筛选. 的最关键之处.溶剂通常先利用简便的硅胶薄层色谱进行筛选. 4.1 薄层色谱点样 把样品溶解在一种低沸点的有机溶剂中(如氯仿,丙酮.甲醇.乙醇等) 把样品溶解在一种低沸点的有机溶剂中(如氯仿,丙酮.甲醇.乙醇等)然 后用毛细管或微量点样管将试液点到薄层板上.点样量要适当, 后用毛细管或微量点样管将试液点到薄层板上.点样量要适当,一般点 样量少些,则分离叫清晰.但要注意到检测灵敏度. 样量少些,则分离叫清晰.但要注意到检测灵敏度. 4.2 展开 4.2.1展开剂选择 4.2.1展开剂选择 选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择. 选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择.
2.3 装柱 2.3.1 吸附剂的加入 干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉， ①干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管 壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞， 壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞， 加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出， 加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加 入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。 入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操 作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。 作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。 湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除去空气泡， ②湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱管 然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下， 中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面 平整。 俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下， 平整。 俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下，液面将与柱表 面相平时，即加试样溶液。 面相平时，即加试样溶液。
硅胶柱层析技术
常说的过柱子应该叫柱层析分 也叫柱色谱。 离，也叫柱色谱。我们常用的是以 硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。 硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。 其实硅胶柱层析技术也可以称 作硅胶吸附柱色谱技术
色谱法，又称层析法。 色谱法，又称层析法。是一种以分配平衡为机理 的分配方法。色谱体系包含两个相， 的分配方法。色谱体系包含两个相，一个是固定 一个是流动相。当两相相对运动时， 相，一个是流动相。当两相相对运动时，反复多 次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差 最后达到彼此分离的目的。 异，最后达到彼此分离的目的。 色谱法按固定相的状态可分为柱色谱、 色谱法按固定相的状态可分为柱色谱、平板色谱 和棒色谱三种， 和棒色谱三种，而实验室中最常用的是柱层析和 薄层层析，以及它们之间的配合应用。 薄层层析，以及它们之间的配合应用。
2.4洗脱 2.4洗脱 除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小， 除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品种 和比例，分别分部收集流出液， 和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再 含有时，再改变流动相的品种和比例。 含有wk.baidu.com，再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流 动相留在吸附层的上面。 动相留在吸附层的上面。 2.5 检测 2.5.1 初步检测 当冲洗溶剂流出一定量后，可对流出液进行初步检测， 当冲洗溶剂流出一定量后，可对流出液进行初步检测，并且将锥形瓶 更换成小试管进行收集。一般只进行初步的快捷检测， 更换成小试管进行收集。一般只进行初步的快捷检测，因此通常是取 一小薄层板，用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块， 一小薄层板，用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块，并按一定的 次序编号。取一根内径为0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液， 0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液 次序编号。取一根内径为0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液， 点于薄层板的一个小格内，待半点干后， 点于薄层板的一个小格内，待半点干后，然后用物理的或化学的方法 检测。 检测。
2.5.2 正式检测 点样: 取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样,如果冲洗溶液太稀, ①点样: 取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样,如果冲洗溶液太稀,浓 度太小,可先浓缩.点样的容器一般用玻璃毛细管, 度太小,可先浓缩.点样的容器一般用玻璃毛细管,点样斑点的直径一般 为3-5mm. 展开:在普通的展开槽中进行,展开方式常选用上行展开. ②展开:在普通的展开槽中进行,展开方式常选用上行展开. 展开剂:使用冲洗溶液. ③展开剂:使用冲洗溶液. ④显色:一般常用物理检测法和化学检测法.物理检测法中首先有紫外光 显色:一般常用物理检测法和化学检测法. 紫外光常用两种波长(254nm与365nm).其次是碘蒸气显色法. (254nm 法,紫外光常用两种波长(254nm与365nm).其次是碘蒸气显色法.化学 其次是碘蒸气显色法 检出法通常惊醒显色剂直接喷雾.显色剂有通用显色剂和专用显色剂. 检出法通常惊醒显色剂直接喷雾.显色剂有通用显色剂和专用显色剂. 通用显色剂最常见的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,喷雾后,有的化合物 通用显色剂最常见的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,喷雾后, (1:1)溶液 立即反应,但多数化合物需加热后经历数分钟才显色,不同化合物的反 立即反应,但多数化合物需加热后经历数分钟才显色, 应不同,所以颜色也往往不同.专用显色剂是指对某个或某一类化合物 应不同,所以颜色也往往不同. 显色的试剂,利用化合物本身的特有性质,或利用其所含的某些官能团 显色的试剂,利用化合物本身的特有性质, 的特殊反应.展开后根据斑点的,可以粗略的估计待分离物的含量的大 的特殊反应.展开后根据斑点的, 小.
①微量圆环法:将欲分离的物质,按常规方法点在薄板,两点相距2-3cm,再 微量圆环法:将欲分离的物质,按常规方法点在薄板,两点相距2 3cm,再 用毛细管吸取所实验的溶剂系统,垂直放于样点中心, 用毛细管吸取所实验的溶剂系统,垂直放于样点中心,让溶剂自毛细管 中依中立流出进行展开,干燥后显色.观察斑点的分离情况. 中依中立流出进行展开,干燥后显色.观察斑点的分离情况.背试物质为 未知化和物时,常先用低极性溶剂展开,如式样留在圆点不动, 未知化和物时,常先用低极性溶剂展开,如式样留在圆点不动,则需增加 溶剂的极性或增大洗脱液的量,如移动过快, 溶剂的极性或增大洗脱液的量,如移动过快,则必须用较低极性的溶剂 来调整. 来调整. 小型色谱法.用普通的载薄片制成薄板,把欲分离的物质点载薄板上, ②小型色谱法.用普通的载薄片制成薄板,把欲分离的物质点载薄板上,放 于小型玻璃缸或广口瓶中展开,干燥后显色,观察斑点分离情况. 于小型玻璃缸或广口瓶中展开,干燥后显色,观察斑点分离情况.
3、色谱柱的选择 柱子可以分为：加压，常压，减压。 柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间， 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低 柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的， 柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但 是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多， ①减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由 于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结）， 于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结）， 以及有些比较易分解的东西可能得不到， 以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽 很大的噪音，而且时间长）。 气（很大的噪音，而且时间长）。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似， ②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗 剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（ 剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼 缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。 ）。特别是在容易分解的样品的分离中适用 缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可 过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。 过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。 常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。 ③常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点 分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比， 是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不 需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少， 需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本 适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品， 低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学 实验室中至今仍被广泛应用。 实验室中至今仍被广泛应用。
2.3.2试样的加入 2.3.2试样的加入 将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色谱管壁缓缓加入。 ①将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿 使吸附剂翻起。 使吸附剂翻起。 或将试样溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀， ②或将试样溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽 后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。 后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如 试样在常用溶剂中不溶解， 试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混 匀后加入。 匀后加入。
2.6 合并 根据上面薄层检测的结果,我们可以将具有相同Rf值的部分进行合并, Rf值的部分进行合并 根据上面薄层检测的结果,我们可以将具有相同Rf值的部分进行合并, 然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发, 然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发,最后得到我们需要的 目标产物. 目标产物. 2.7色谱柱的洗涤 2.7色谱柱的洗涤 在绝大多数情况下,硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用,但在使用后的 在绝大多数情况下,硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用, 色谱柱中由于还含有冲洗溶剂,所以要将里面的硅胶到出是比较困难 色谱柱中由于还含有冲洗溶剂, 的.取出硅胶的一种方法是将该柱放置一段时间,让溶剂自然挥发完后, 取出硅胶的一种方法是将该柱放置一段时间,让溶剂自然挥发完后, 倒出硅胶.但这种方法既费时又污染环境.第二种方法可以用一根比色 倒出硅胶.但这种方法既费时又污染环境. 谱柱稍长的木杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地掏出,但这种 谱柱稍长的木杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地掏出, 办法也比较麻烦.第三种方法时利用一个一般地真空泵, 将柱中剩余的 办法也比较麻烦.第三种方法时利用一个一般地真空泵, 溶剂进行减压抽出,在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱,这样抽出地溶 溶剂进行减压抽出,在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱, 剂既进行了有效地收集而不污染环境,而色谱柱中地硅胶又能较快得 剂既进行了有效地收集而不污染环境, 到干燥,使硅胶能够方便地倒出. 到干燥,使硅胶能够方便地倒出.
柱层析
1、吸附色谱的原理 在一定条件下，硅胶与被分离物质之间产生作用， 在一定条件下，硅胶与被分离物质之间产生作用，这种作用主要是物 理和化学作用两种。 理和化学作用两种。物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的范 德华力； 德华力；化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键 作用。 作用。 2、操作步骤 2.1 硅胶准备 硅胶一般选用250 400目 40-63µm直径的硅胶颗粒 根据∆Rf 250直径的硅胶颗粒) ∆Rf选用 硅胶一般选用250-400目(即40-63µm直径的硅胶颗粒)，根据∆Rf选用 硅胶的用量。 硅胶的用量。 2.2 实验仪器准备 一支玻璃色谱柱,一个铁架台,烧杯,锥形瓶,径口直径较大的玻璃漏斗, 一支玻璃色谱柱,一个铁架台,烧杯,锥形瓶,径口直径较大的玻璃漏斗, 一支玻璃棒, 一支玻璃棒, 等。