硅胶柱层析技术

4 溶剂的选择
溶剂的选择也许是整个柱色谱分离操作中 最困难之处,也是实验成功的最关键之处.溶 剂通常先利用简便的硅胶薄层色谱进行筛 选.
4.1 薄层色谱点样
把样品溶解在一种低沸点的有机溶剂中(如 氯仿,丙酮.甲醇.乙醇等)然后用毛细管或微 量点样管将试液点到薄层板上.点样量要适 当,一般点样量少些,则分离叫清晰.但要注意 到检测灵敏度.
②湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除 去202空0/7/9气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加
2.3.2试样的加入 ①将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿
色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起 。 ②或将试样溶于适当的溶剂中，与少量吸附 剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状 ；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色 谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解， 可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混 匀后加入。
关于湿法、干法上样
• 湿法上样，一般用淋洗剂溶解样品，也可 以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少 越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样 品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可 是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般 都是比较大量的样品才会出现，是因为硅 胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比 较好的固体才会发生，这就应该先重结晶 ，得到大部分的产品后再柱分，如果不能 重结晶那就不管它了，直接过就是了，样 品202随0/7/9着淋洗剂流动会溶解的。
2020/7/9
2.4洗脱 除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大
小，递增变换流动相的品种和比例，分别 分部收集流出液，至流出液中所含成分显 著减少或不再含有时，再改变流动相的品 种和比例。操作过程中应保持有充分的流 动相留在吸附层的上面。
2.5 检测 2.5.1 初步检测
当冲洗溶剂流出一定量后，可对流出液进
2020/7/9
➢ 常说的过柱子应该叫柱层析分 离，也叫柱色谱。我们常用的是以 硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
➢ 其实硅胶柱层析技术也可以称 作硅胶吸附柱色谱技术
2020/7/9
• 色谱法，又称层析法。是一种以分配平衡为机理 的分配方法。色谱体系包含两个相，一个是固定 相，一个是流动相。当两相相对运动时，反复多 次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差 异，最后达到彼此分离的目的。
2020/7/9
• 由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装 的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升 的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯 度是较低的。经常能够从送来的大桶底部 看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知 了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂 重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了 ，反正下面还有提纯的方法。另外溶剂在 过柱子后最好也回收使用，一方面环保， 另一方面也能节省部分经费，缺点是要消 耗一定的人工。这里要注意的是，一般在 过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙
2020/7/9
• 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10， 书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体 的选择要具体分析。如果所需组分和杂质 分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4 ，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶， 用小柱子（例如200毫克的样品，用 2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1， 就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直 径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极 性等等。 2020/7/9
溶剂的选择
• 当然是最便宜，最安全，最环保的了。所 以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有 写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不 要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快 ，不过因为极性很小，有时还是非它不可 。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注 意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也 就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知 道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所 以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡， 天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶 解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分
3、装柱
将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约 1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打 开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。 随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内， 用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。
4、压实
沉降完成后，加入更多的石油醚（氯仿） ，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。 柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱 或202加0/7/9压柱，都应进行这一步，可使分离度
2020/7/9
3、色谱柱的选择
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产 品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数 。所以其他条件相同的时候，常压柱是效 率最高的，但是时间也最长，比如天然化 合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
①减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够 节省一半甚至更多，但是由于大量的空气 通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面 有水汽凝结），以及有些比较易分解的东 西可能得不到，而且还必须同时使用水泵 抽202气0/7/9（很大的噪音，而且时间长）。
2020/7/9
2.5.2 正式检测
①点样: 取分部收集的冲洗溶液进行分别直接 点样,如果冲洗溶液太稀,浓度太小,可先浓缩 .点样的容器一般用玻璃毛细管,点样斑点的 直径一般为3-5mm.
②展开:在普通的展开槽中进行,展开方式常选 用上行展开.
③展开剂:使用冲洗溶液.
④显色:一般常用物理检测法和化学检测法.物 理检测法中首先有紫外光法,紫外光常用两 种波长(254nm与365nm).其次是碘蒸气显
• ③ 双向展开法:取方形薄板像纸色谱一 样进行双向展开.
• ④ 径向展开法:可将吸附剂涂成圆形或 扇形,在圆心部分加如展开剂,使薄层径向展 开.
2020/7/9
4.3 显色
展开后,如物质有色,可明显的在薄层上观 察到它们的位置.如无色,则要通过一定的方 法显色,定位,一边确定斑点的位置及大小.
4.4 常用溶剂的极性
②小型色谱法.用普通的载薄片制成薄板,把欲 分离的物质点载薄板上,放于小型玻璃缸或 广202口0/7/9瓶中展开,干燥后显色,观察斑点分离情
4.2.2 展开
薄层色谱的展开方法有上行法,下行法,双向展 开法,径向展开法等。
• ① 上行法:使展开剂由下向上爬.
• ② 下行法:使展开剂由上向下.该法可使 用极性较弱的展开剂.
• 色谱法按固定相的状态可分为柱色谱、平板色谱 和棒色谱三种，而实验室中最常用的是柱层析和 薄层层析，以及它们之间的配合应用。
2020/7/9
柱层析
1、吸附色谱的原理 在一定条件下，硅胶与被分离物质之间产
生作用，这种作用主要是物理和化学作用 两种。物理作用来自于硅胶表表面与溶质 分子之间的范德华力；化学作用主要是硅 胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键 作用。
2020/7/9
①微量圆环法:将欲分离的物质,按常规方法点 在薄板,两点相距2-3cm,再用毛细管吸取所 实验的溶剂系统,垂直放于样点中心,让溶剂 自毛细管中依中立流出进行展开,干燥后显 色.观察斑点的分离情况.背试物质为未知化 和物时,常先用低极性溶剂展开,如式样留在 圆点不动,则需增加溶剂的极性或增大洗脱 液的量,如移动过快,则必须用较低极性的溶 剂来调整.
2020/7/9
2.6 合并 根据上面薄层检测的结果,我们可以将具有
相同Rf值的部分进行合并,然后利用旋转蒸 发器对合并部分进行旋转蒸发,最后得到我 们需要的目标产物.
2.7色谱柱的洗涤 在绝大多数情况下,硅胶分离柱中的硅胶是
一次性使用,但在使用后的色谱柱中由于还 含有冲洗溶剂,所以要将里面的硅胶到出是 比较困难的.取出硅胶的一种方法是将该柱
7、检测
要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外 灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般 比喷显剂底1-2个数量级。
8、送谱
收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结 晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝 胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除 去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。
2020/7/9
TIPS:
2020/7/9
关于操作问题
1 装柱
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被 淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门 （T型四氟节门三通接头）的。干法和湿法 装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实 就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太 密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不 然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的 都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况 下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡 就全下来了。当然如果你装的柱子总是有 气202泡0/7/9就说明需要多练习了。但是柱子更忌
5、上样
干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样 后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞 至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入 大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。
6、过柱和收集
柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡 。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗 脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H ，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶 （20220/70/9 0-300目），20-50ml收一馏分。
2、操作步骤 2.1 硅胶准备
硅胶一般选用250-400目(即40-63μm直径
2020/7/9
2.3 装柱
2.3.1 吸附剂的加入
①干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管 壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开 始层析时使用的流动相，或将色谱管下端 出口加活塞，加入适量的流动相，旋开活 塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加 入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内 形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保 持有充分的流动相留在吸附层的上面。
2020/7/9
匀浆法
1、称量
200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如 果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干 硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅 胶，用烧杯量100ml也可以。
2、搅成匀浆
加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分 搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮 体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/ 醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆 ，说明 2020/7/9 溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙
• 1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻 物质Rf值之差最大化
• 2.将柱子必须装平整、均匀 • 3.考虑有限柱填料的吸附量 • 4.可考虑用梯度法分开并洗脱
2020/7/9
柱子可以分为：加压，常压，减 压。
• 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产 品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数 。所以其他条件相同的时候，常压柱是效 率最高的，但是时间也最长，比如天然化 合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
2 加样 用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面
的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时 ，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活 塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白 色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压， 等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2～ 4cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（ 如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。
• 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够 节省一半甚至更多，但是由于大量的空气 通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面 有水汽凝结），以及有些比较易分解的东 西可能得不到，而且还必须同时使用水泵 抽气（很大的噪音，而且时间长）。
• 加202压0/7/9柱是一种比较好的方法，与常压柱类
关于柱子的尺寸
• 柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了 ，上样后样品的原点就小（反映在柱子上 就是样品层比较薄），这样相对的减小了 分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样 品就有二厘米，那么分离的难度可想而知 ，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而 如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比 较容易得到完全分离了。当然采用粗大的 柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过 这些成本相对于产品来说也许就不算什么
常用溶剂的极性顺序：石油醚〈环己烷/己 烷〈苯〈乙醚〈氯仿〈乙酸乙酯〈正丁醇 〈丙酮〈乙醇〈甲醇〈水。
在薄层色谱中,当溶剂的极性太大时. 会使待分离物全部接近溶剂前沿,当溶剂的 极性太小时,又会使待分离物几乎全部保留
2020/7/9
wk.baidu.com
柱层析
• 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 • 极性较大的用甲醇：氯仿系统 • 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统 • 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸