流式细胞技术及其应用
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104000
488 488 488 488 488 488 633
525 575 677 670 755 620 670
颜色
用途
深蓝 橙色 红色 红色 深红色 橙红色 红色
免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光
流式细胞技术及其应用
§3.1 荧光探针的选择
异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）
流式细胞技术及其应用
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
3. 光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤 光片、小孔组成，它们分别将不同波 长的荧光信号送入到不同的电子探测 器。
流式细胞技术及其应用
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
4. 信号检测 （1）散射光信号
前向角散射(Forward Scatter, FSC ) 侧向角散射(Side Scatter, SSC) （2）荧光信号
流式细胞仪（Flow Cytometor, FCM）是一项集激光技术、 电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。 又称 (Fluorecence activated cell sorter, FACS) FACSort FACSCalibur FACSVantage
流式细胞技术及其应用
流式细胞技术及其应用
第二部分 仪器构造及工作原理
流式细胞技术及其应用
§2.1 仪器构造
1. 流动室及液流 驱动系统
2. 激光光源及光 束形成系统
3. 光学系统
4. 信号检测与存 贮、显示、分 析系统
5. 细胞分选系统
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
1. 流动室
仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开
流式细胞技术及其应用
课程内容
第一部分 第二部分 第三部分 第四部分
概要 仪器构造及工作原理 技术及方法
流式细胞技术及其应用
第一部分 概要
流式细胞技术及其应用
§1.1 基本概念
流式细胞技术（Flow Cytometry, FCM） 是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多 参数、快速定量分析和分选的技术。(荧光显微镜技术的改 良)
§2.2 工作原理
单参数直方图
流式细胞技术及其应用
➢二维散点图
流式细胞技术及其应用
§2.3 细胞分选原理
当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压电 晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动，使 液流注断裂成一连串均匀的液滴，仅少量液滴含有细胞， 有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了被分 选的细胞的特性参数时， 此类细胞在形成液滴时会被充 电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细 胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转 板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或 向左的偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目 的。
流式细胞技术及其应用
流式细胞技术及其应用
第三部分 技术要点
流式细胞技术及其应用
§3.1 荧光探针的选择
1. 根据仪器类型选择荧光探针 FACSort 配有488nm单激光器。 FACSCalibur 配有488nm和633nm双激光器。
2. 根据荧光强度大小选择荧光探针 各种荧光色素有不同的发射荧光强度。在多色免
流式细胞技术及其应用
§1.2 技术特点
单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、 体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制 成单细胞悬液。
快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标 本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数 十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的 细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。
一个孔径为430×180um长方形孔，供细胞单 个流过，检测区在该孔的中心。 流动室内充满鞘液，鞘液的作用是将样品流环 包，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且 保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从 而得到准确的细胞荧光信息。
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
液流驱动系统 将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标 本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室， 用不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高 压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细 胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或 微粒高速流动，形成一个圆形的流速（即鞘 流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依 次通过流式细胞仪的检测区域。
流式细胞技术及其应用
§1.2 技术特点
多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当 同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同 单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析, 即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、 计数等更为准确。
定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些 成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等 均可进行单细胞水平的定性与定量分析。
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
2. 激光光源
目前FCM大多采用氩离子气体激光器，波长为 488nm。激光是一种相干光源，它能提供单 波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱 荧光快速分析的理想光源。用聚焦透镜对激光 光束聚焦后，可以在照射区得到一个近似扁平 的椭圆形光斑，其厚度可达20μm。当流动的 细胞经过光斑时才能被激光照射并产生光散射 和发射荧光。
流式细胞技术及其应用
前向角散射光（FSC）
激光器
大颗粒
激光器
小颗粒
激光探测器
流式细胞技术及其应用
侧向角散射光（SSC）
激光器
侧向散射光探测器
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
5. 数据的存贮、显示与分析
FCM数据存贮的方式均采用列表排 队方式。 数据的显示通常有一维直方图、二 维点图等。
流式细胞技术及其应用
疫荧光分析中，应选择荧光强度最强的荧光色素Βιβλιοθήκη Baidu 记的单克隆抗体，尤其是对于表达量较低抗原的分 析更是如此。
流式细胞技术及其应用
常用荧光染料的特性
荧光染料 分子量 激发波长(nm) 发射波长(nm)
FITC PE PerCP PeCy5 PeCy7 PI APC
390 240000 35000 224000 224000
488 488 488 488 488 488 633
525 575 677 670 755 620 670
颜色
用途
深蓝 橙色 红色 红色 深红色 橙红色 红色
免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光 免疫荧光
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§3.1 荧光探针的选择
异硫氰酸荧光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）
流式细胞技术及其应用
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
3. 光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤 光片、小孔组成，它们分别将不同波 长的荧光信号送入到不同的电子探测 器。
流式细胞技术及其应用
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
4. 信号检测 （1）散射光信号
前向角散射(Forward Scatter, FSC ) 侧向角散射(Side Scatter, SSC) （2）荧光信号
流式细胞仪（Flow Cytometor, FCM）是一项集激光技术、 电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。 又称 (Fluorecence activated cell sorter, FACS) FACSort FACSCalibur FACSVantage
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第二部分 仪器构造及工作原理
流式细胞技术及其应用
§2.1 仪器构造
1. 流动室及液流 驱动系统
2. 激光光源及光 束形成系统
3. 光学系统
4. 信号检测与存 贮、显示、分 析系统
5. 细胞分选系统
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
1. 流动室
仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开
流式细胞技术及其应用
课程内容
第一部分 第二部分 第三部分 第四部分
概要 仪器构造及工作原理 技术及方法
流式细胞技术及其应用
第一部分 概要
流式细胞技术及其应用
§1.1 基本概念
流式细胞技术（Flow Cytometry, FCM） 是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多 参数、快速定量分析和分选的技术。(荧光显微镜技术的改 良)
§2.2 工作原理
单参数直方图
流式细胞技术及其应用
➢二维散点图
流式细胞技术及其应用
§2.3 细胞分选原理
当细胞悬液形成液流柱经流动室，流动室上方的压电 晶体产生机械振动带动流动室以相同频率进行振动，使 液流注断裂成一连串均匀的液滴，仅少量液滴含有细胞， 有大量不含细胞的空白液滴。当实验设计中设定了被分 选的细胞的特性参数时， 此类细胞在形成液滴时会被充 电，使其带有正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细 胞及空白液滴不带电荷。带电荷的液滴在落入电极偏转 板的高压静电场，依所带电荷是正或是负而发生向右或 向左的偏转，落入指定的收集器中，完成细胞分选的目 的。
流式细胞技术及其应用
流式细胞技术及其应用
第三部分 技术要点
流式细胞技术及其应用
§3.1 荧光探针的选择
1. 根据仪器类型选择荧光探针 FACSort 配有488nm单激光器。 FACSCalibur 配有488nm和633nm双激光器。
2. 根据荧光强度大小选择荧光探针 各种荧光色素有不同的发射荧光强度。在多色免
流式细胞技术及其应用
§1.2 技术特点
单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、 体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制 成单细胞悬液。
快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标 本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数 十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的 细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。
一个孔径为430×180um长方形孔，供细胞单 个流过，检测区在该孔的中心。 流动室内充满鞘液，鞘液的作用是将样品流环 包，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且 保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从 而得到准确的细胞荧光信息。
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
液流驱动系统 将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标 本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室， 用不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高 压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细 胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或 微粒高速流动，形成一个圆形的流速（即鞘 流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依 次通过流式细胞仪的检测区域。
流式细胞技术及其应用
§1.2 技术特点
多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当 同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同 单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析, 即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、 计数等更为准确。
定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些 成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等 均可进行单细胞水平的定性与定量分析。
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
2. 激光光源
目前FCM大多采用氩离子气体激光器，波长为 488nm。激光是一种相干光源，它能提供单 波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱 荧光快速分析的理想光源。用聚焦透镜对激光 光束聚焦后，可以在照射区得到一个近似扁平 的椭圆形光斑，其厚度可达20μm。当流动的 细胞经过光斑时才能被激光照射并产生光散射 和发射荧光。
流式细胞技术及其应用
前向角散射光（FSC）
激光器
大颗粒
激光器
小颗粒
激光探测器
流式细胞技术及其应用
侧向角散射光（SSC）
激光器
侧向散射光探测器
流式细胞技术及其应用
§2.2 工作原理
5. 数据的存贮、显示与分析
FCM数据存贮的方式均采用列表排 队方式。 数据的显示通常有一维直方图、二 维点图等。
流式细胞技术及其应用
疫荧光分析中，应选择荧光强度最强的荧光色素Βιβλιοθήκη Baidu 记的单克隆抗体，尤其是对于表达量较低抗原的分 析更是如此。
流式细胞技术及其应用
常用荧光染料的特性
荧光染料 分子量 激发波长(nm) 发射波长(nm)
FITC PE PerCP PeCy5 PeCy7 PI APC
390 240000 35000 224000 224000