分子生物学作业二

生物分子的分离纯化

聚合酶链反应

一、名解

荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。酚抽提法：本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS 及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA 样品。

碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。

比活：单位蛋白质重量中靶蛋白的生物学活性（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示）。凝胶过滤层析：凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。

巢式PCR：用两对引物，一对引物序列在模板的外侧，另一对引物序列在模板的内侧（相对于第一对引物）。第一对引物做PCR的扩增产物作为第二队引物退火的模板，再做PCR。这样经过两次PVR放大，灵敏度得以提高，有时可以检出单拷贝的目的基因。

荧光定量PCR：基于荧光能量传递技术（FRET），是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。

Ct值：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。

二、问答

1、根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？

答：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、

盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；

（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；

（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；

（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、

电泳、等电聚焦法等。

（5）根据配体特异性，如亲和层析。

2、分离纯化过程中，如何保持核酸的完整性？

答：1）温度不要过高(0～4℃)；(高温破坏氢键)

2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键)

3）保持一定离子强度;

4）减少物理因素对核酸的机械剪切力。

3、什么原因易引起DNA降解，该如何解决？

答：原因：（1）材料不新鲜或反复冻融；（2）未很好抑制内源核酸酶的活性；

（3）提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断；（4）外源核酸酶污染（5）反复冻融。

如何解决：（1）尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；（2）液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液；（3）在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量；（4）细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔（5）所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌；（6）将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

4、在蛋白质分离纯化过程中应注意哪些因素？

答：（1）缓冲液，（2）盐、金属离子和螯合剂，（3）还原剂，（4）去垢剂，（5）增溶剂，（6）蛋白酶抑制剂，（7）蛋白质的环境因素：①表面效应的影响，②温度的影响，③储存。

5. 简述PCR技术的基本原理

答：PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA 的目的。

6. PCR实验中，假阴性现象如何排除？

答：引物设计是否合理；标本中是否有Taq酶抑制剂，Taq酶是否失活；反应体系中有无蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95℃以上加热10分钟使其灭活；反应体系中是否有较难去除的蛋白质抑制PCR系统，用蛋白酶K重新处理常可获预期结果；循环温度，特别是解链温度是否准确，退火温度是否过高。有些PCR仪指示温度与实际温度不符，过高则酶在前几个循环中迅速失活，过低则模板变性不彻底；检测PCR产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低；靶序列发生突变、缺失等。

7.在PCR过程中应注意哪些事项？

答：模板的选择，一般模板加入量为10^2~10^5拷贝的靶序列较为合适；引物的选择，如引物长度一般为15~30个核苷酸，碱基分布的均衡性，引物自身不应存在二级结构，引物的内部稳定性，引物的特异性；DNA聚合酶的选择；四种dNTP浓度应相等，dNTP具有较强的酸性，应以NaOH调其酸度直pH7.0~7.5，PCR缓冲液的选择，Mg2+浓度对PCR结果具有重要影响。PCR循环中变性温度和变性时间的控制，退火温度的选择，一般比引物Tm值约低5℃。延伸温度控制在70-75℃,一般为72℃，延伸反应时间1~3min，循环次数25~30个循环足够，循环次数过多易产生平台效应。