细胞生物学最新版本课件

Feulgen Staining
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三、特异蛋白抗原的定位与定性
免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图）
蛋白电泳(SDS-PAGE) 与免疫印迹反应(Western-Blot)
免疫电镜技术：
免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术 免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；
等生物大分子的定性定位： 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
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激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理 应用：
排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)， 可重构样品的三维结构。
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相差显微镜（phase-contrast microscope）
一、 离心分离技术
用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
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二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法
原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。
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二、 电子显微镜技术
电子显微镜的基本知识
电镜与光镜的比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术
负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术
扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） SPM(Scanning probe microscope)
并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。
装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示 系统。
特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。
（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）；
（2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；
染色背景，衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图）
冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗 粒
和膜表面结构。
快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） 电镜三维重构技术
电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。
细胞生物学
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第三章 细胞生物学研究方法
细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
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第一节 细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术（light microscopy）
电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
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三、 扫描遂道显微镜
Scanning Probe Microscope,SPM
(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)
包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等
原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如
量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，
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第二节 细胞组分的分析方法
离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
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第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
细胞的培养 细胞工程
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一、光学显微镜技术（light microscopy)
普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC）
（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。
（4）可连续成像，进行动态观察
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普通复式光学显微镜技术
光镜样本制作 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离
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荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
原理与应用
直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质
TEM
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0.1nm
电子束 电磁透镜 （0.01-0.9）
要求真空
1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子的散射 和透射形成明暗反差
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电镜与光镜光路图比较
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电子显微镜的基本构造
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主要电镜制样技术
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 负染色技术（Negative staining）与金属投影
将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞
微分干涉显微镜（differential-interference microscope）
偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器
录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振
分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）
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扫描电镜
原理与应用： 电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，
探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张
力问题
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计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动
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电镜与光镜的比较
显微镜 分辨本领 光源
透镜
真空
成像原理
LM 200nm 可见光 玻璃透镜 不要求真空 利用样品对光的吸收形
（400-700）
成明暗反差和颜色变化
100nm 紫外光 玻璃透镜 不要求真空 （约200nm)