实验二 显微镜的使用及细菌革兰氏染色

实验二显微镜的使用细菌染色及革兰氏染色

一、实验目的

1、学习显微镜（油镜）的构造及使用

2、学习微生物涂片、染色等基本技术

3、认识细菌形态

4、了解革兰氏染色的原理，掌握革兰氏染色法

二、实验原理

1、光学显微镜的基本原理

（1）基本原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，但减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，香柏油的折射率为 1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。

（2）油镜是微生物学使用的显微镜的物镜中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔是一层油脂，称为“油浸系”。利用油镜的目的是增加显微镜的分辨力。

2、简单染色的原理

利用单一染料对菌体进行染色的方法叫做简单染色。常用碱性染料进行简单染色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。

3、革兰氏染色的基本原理

经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。

1）G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

2）Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

三、实验器材

金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，光学显微镜香柏油(cedar oil)，碘液，结晶紫，番红，酒精等

四﹑实验内容

1、单染色：

（1）洗片：用清水和去污粉将载玻片清洗干净。

（2）干燥：将载破片自然烘干。

（3）涂片：载玻片上滴一小滴蒸馏水。无菌环境下利用接种环，粘取少量细菌并在蒸馏水滴中均匀涂抹。

（4）加热固定、干燥：涂面朝上，通过火焰2-3次，并随时用手背试载玻片温度，不可令载玻片烫手，直至水滴完全蒸发形成菌斑。

（5）染色：滴加结晶紫燃料着色1-2min。

（6）水洗、干燥：细水流小心冲洗载玻片背面直至水流无色，并自然烘干。

（7）镜检：先在低倍镜下观察，随后换用油镜观察菌落形态（在油镜未换上之前于载玻片上滴一滴香柏油，再将油镜换上进行观察）

2、革兰氏染色

（1）洗片、干燥、涂片、加热固定：同单染色（注意大肠杆菌可以多涂，其他的注意涂量不宜过多）

（2）加热固定、干燥：同单染色

（3）染色：A初染：加结晶紫染色，1.5min后水洗

B媒染：滴加碘液洗载玻片，稀释蒸馏水，碘液覆盖1min，水洗，用滴管滴加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇不出现紫色为止，再细水冲洗。

C复染：番红染色1.5min

（4）水洗、干燥、镜检：同简单染色

五、问题与讨论

1、你认为革兰氏染色哪些步骤可以省略？为什么？

媒染可以省略，因为此步骤是为了增强燃料在菌体中的滞留能力。如果菌体本身已经与初染结晶紫结合的足够紧密了，那一定程度上可以省略媒染步骤。

2、为什么老龄菌的革兰氏染色会造成假阴性？

因为老龄的革兰氏阳性菌的肽聚糖层疏松，在乙醇脱色时也会像革兰氏阴性菌一样被脱去初染的颜色。

3、在涂片时一定要注意涂片的量，应该在涂片后，令液滴上形成微微浑浊。如果量过大

会造成染色分层的现象，如量太少会给观察带来麻烦。本次试验的大肠杆菌就经过了两次涂片才成功得到菌量合适的视野。

4、载玻片上滴水量不宜过大，这样会造成在干燥固定过程中浪费较多的时间。