外泌体与肿瘤
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J Cell Biol，1985，101(3): 942-948
外泌体的结构
外泌体中含有丰富的蛋白，脂质，DNA和 RNA (mRNA, miRNA, lncRNA, ncRNA等）
蛋白质占据了外泌体内含物的很大部分，种类非 常丰富,大致可分为两类：一类是外 泌体中普遍 存在,参与其结构形成的蛋白质，多分布于外泌体 的表面。另一大类蛋白质与细胞来源有关,相对特 异。 截至目前，在 Exocarta数据库中收录了近 286项 研究结果， 归纳发现，外泌体携带的蛋白质达 9769种，mRNA3408种 ，miRNA 2838种。经由外 泌体向细胞外转运，还含有1116种脂质体参与机 体多种重要的生理或病理过程。
该项研究提出的问题
• GPC1不是胰腺癌特有标记物，在乳腺癌 中的表达为75%，如何能够与其他肝胆 胰肿瘤鉴别需要进一步研究
• 能否用于胰腺癌高危人群的筛选，如胰 腺癌家族史，Peutz-Jeghers 综合征，慢 性胰腺炎患者
• GPC1与CA19-9联合用于胰腺癌诊疗效果 如何
12
外泌体在肿瘤诊断中的作用
AnnuRev Physiol. 2015;77:13-27.
外泌体的鉴定
外泌体鉴定方法： 1)Western blot analysis-通过CD9、CD63 等外泌体标志物鉴定其特异性； 2)透射电子显微镜(TEM)，鉴定外泌体囊泡 大小和形态； 3)动态光散射技术(DLS)/纳米微粒追踪分析 (NTA)，鉴定外泌体囊泡大小
AnnuRev Physiol. 2015;77:13-27.
外泌体形成
当细胞经内吞形成早期核内体后（Ees）， 其内可含有外源性抗原：Ees的囊膜内陷、 裂解，形成多个小囊泡，并选择性接收细胞 质内的蛋白成分和脂类，形成晚期核内 体 MVB 。细胞内的MVB主要有 3 种去向： (1) 继续接受细胞质中的大分子和囊泡结 构，形成内涵体，然后与溶酶体融合，使其 内容物降解；(2)直接与溶酶体结合而降解 其内容物；(3) 以钙离子依赖的方式与细胞 膜融合，将其内部所包含的多个囊泡结构释 放至细胞外基质中，即形成外泌体
外泌体与肿瘤
思路迪医学部 赵萌
外泌体
外泌体是一种直径30~100nm的膜性小囊泡， 广泛分布于唾液、血液、脑脊液、尿液，乳 汁等几乎所有体液及体外细胞培养的培基中。
外泌体起源于细胞內吞途径中的多泡体 (MVB)，通过出芽方式从细胞释放，含有蛋 白质、脂质、核酸等多种活性成分。
外泌体是细胞之间信号传递的载体，来自肿 瘤细胞的外泌体（tumor-derived exosomes, TEX）被认为在肿瘤的生长、增殖、迁移、 侵染等过程中发挥多种功能。
J Clin Invest. 2016 Apr 1;126(4):1152-62.
1 外泌体与肿瘤诊断及监测 2 外泌体与肿瘤发生发展
3 外泌体与肿瘤转移
4 外泌体与肿瘤血管新生
5
外泌体与肿瘤治疗与耐药
6
外泌体与肿瘤免疫
外泌体早期诊断
Nature. 2015 Jul 9;523(7559):177-82
TEX会使成纤维细胞分化成肌成纤维细胞， 其释放MMP并导致细胞外基质的重塑。 TEX激活肿瘤相关巨噬细胞并分泌G-CSF、 IL-6和TNF-α，它们一起促进血管生成并产 生炎性细胞。
随着肿瘤的生长，其进展代谢需求会超过其 血液供应，从而变得越来越缺氧。为了适应 低氧，肿瘤会分泌能够促进血管募集的血管 生成因子。
1 外泌体与肿瘤诊断 2 外泌体与肿瘤发生发展
3 外泌体与肿瘤转移
4 外泌体Fra Baidu bibliotek肿瘤血管新生
5
外泌体与肿瘤治疗与耐药
6
外泌体与肿瘤免疫
外泌体与肿瘤转移
Cancer Cell. 2016 Dec 12;30(6):836-848.
外泌体与肿瘤转移
TEX在转移的远端位点转移前龛（PMN）
J Clin Invest. 2016 Apr 1;126(4):1216-23.
外泌体分离
离心法：这是目前外泌体提取最常用的方法，此 种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜 鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体 没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此 种方法得到的是微泡不是外泌体、 过滤离心：外泌体是一个囊状小体，相对分子质 量大于一般蛋白质，因此选择不同大小的MWCO 膜可使外泌体与其他大分子物质分离。这种操作 简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样 存在纯度不足的问题。 密度梯度离心:用此种方法分离到的这种方法可以 保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、 免疫磁珠法:不需要昂贵的仪器设备, 但是非中性 pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不 便进行下一步的实验，外泌体纯度高，但是前期 准备工作繁杂，耗时，量少 色谱法:分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是 需要特殊的设备，应用不广泛
9
外泌体与手术
术后GPC1+ 外泌体均下降
10
外泌体与预后
✓ GPC1+ 外泌体下降大于中位水平的OS和disease-specific survival 水平 高于低于中位水平者（OS: 26.2月 vs 15.5 月; DSS: 27.7 月vs 15.5月）
✓ CA19-9水平现将无法判断预后 11
D.D. Taylor, C. Gercel-Taylor / Gynecologic Oncology 110 (2008) 13–21
1 外泌体与肿瘤诊断 2 外泌体与肿瘤发生发展
3 外泌体与肿瘤转移
4 外泌体与肿瘤血管新生
5
外泌体与肿瘤治疗与耐药
6
外泌体与肿瘤免疫
外泌体与肿瘤发生、发展
TEX会携带肿瘤的突变物质，进入到正常细 胞中，将这些突变物质整合到正常细胞当中。
PKT小鼠模仿人类胰腺癌发展过程， 4.5周时形成PanIN，8周时死于 PDAC GPC1+ 外泌体的比例随着肿瘤体 积增大和组织学分化异型性增大 而不断升高
外泌体的浓度与大小同样与病情 进展无相关性
8 Ann Transl Med. 2016 Feb;4(4):64
外泌体早期诊断
GPC1+ 外泌体比例在鉴别胰腺导管腺癌与胰 腺良性疾病和正常人群中的作用
外泌体的结构
外泌体中含有丰富的蛋白，脂质，DNA和 RNA (mRNA, miRNA, lncRNA, ncRNA等）
蛋白质占据了外泌体内含物的很大部分，种类非 常丰富,大致可分为两类：一类是外 泌体中普遍 存在,参与其结构形成的蛋白质，多分布于外泌体 的表面。另一大类蛋白质与细胞来源有关,相对特 异。 截至目前，在 Exocarta数据库中收录了近 286项 研究结果， 归纳发现，外泌体携带的蛋白质达 9769种，mRNA3408种 ，miRNA 2838种。经由外 泌体向细胞外转运，还含有1116种脂质体参与机 体多种重要的生理或病理过程。
该项研究提出的问题
• GPC1不是胰腺癌特有标记物，在乳腺癌 中的表达为75%，如何能够与其他肝胆 胰肿瘤鉴别需要进一步研究
• 能否用于胰腺癌高危人群的筛选，如胰 腺癌家族史，Peutz-Jeghers 综合征，慢 性胰腺炎患者
• GPC1与CA19-9联合用于胰腺癌诊疗效果 如何
12
外泌体在肿瘤诊断中的作用
AnnuRev Physiol. 2015;77:13-27.
外泌体的鉴定
外泌体鉴定方法： 1)Western blot analysis-通过CD9、CD63 等外泌体标志物鉴定其特异性； 2)透射电子显微镜(TEM)，鉴定外泌体囊泡 大小和形态； 3)动态光散射技术(DLS)/纳米微粒追踪分析 (NTA)，鉴定外泌体囊泡大小
AnnuRev Physiol. 2015;77:13-27.
外泌体形成
当细胞经内吞形成早期核内体后（Ees）， 其内可含有外源性抗原：Ees的囊膜内陷、 裂解，形成多个小囊泡，并选择性接收细胞 质内的蛋白成分和脂类，形成晚期核内 体 MVB 。细胞内的MVB主要有 3 种去向： (1) 继续接受细胞质中的大分子和囊泡结 构，形成内涵体，然后与溶酶体融合，使其 内容物降解；(2)直接与溶酶体结合而降解 其内容物；(3) 以钙离子依赖的方式与细胞 膜融合，将其内部所包含的多个囊泡结构释 放至细胞外基质中，即形成外泌体
外泌体与肿瘤
思路迪医学部 赵萌
外泌体
外泌体是一种直径30~100nm的膜性小囊泡， 广泛分布于唾液、血液、脑脊液、尿液，乳 汁等几乎所有体液及体外细胞培养的培基中。
外泌体起源于细胞內吞途径中的多泡体 (MVB)，通过出芽方式从细胞释放，含有蛋 白质、脂质、核酸等多种活性成分。
外泌体是细胞之间信号传递的载体，来自肿 瘤细胞的外泌体（tumor-derived exosomes, TEX）被认为在肿瘤的生长、增殖、迁移、 侵染等过程中发挥多种功能。
J Clin Invest. 2016 Apr 1;126(4):1152-62.
1 外泌体与肿瘤诊断及监测 2 外泌体与肿瘤发生发展
3 外泌体与肿瘤转移
4 外泌体与肿瘤血管新生
5
外泌体与肿瘤治疗与耐药
6
外泌体与肿瘤免疫
外泌体早期诊断
Nature. 2015 Jul 9;523(7559):177-82
TEX会使成纤维细胞分化成肌成纤维细胞， 其释放MMP并导致细胞外基质的重塑。 TEX激活肿瘤相关巨噬细胞并分泌G-CSF、 IL-6和TNF-α，它们一起促进血管生成并产 生炎性细胞。
随着肿瘤的生长，其进展代谢需求会超过其 血液供应，从而变得越来越缺氧。为了适应 低氧，肿瘤会分泌能够促进血管募集的血管 生成因子。
1 外泌体与肿瘤诊断 2 外泌体与肿瘤发生发展
3 外泌体与肿瘤转移
4 外泌体Fra Baidu bibliotek肿瘤血管新生
5
外泌体与肿瘤治疗与耐药
6
外泌体与肿瘤免疫
外泌体与肿瘤转移
Cancer Cell. 2016 Dec 12;30(6):836-848.
外泌体与肿瘤转移
TEX在转移的远端位点转移前龛（PMN）
J Clin Invest. 2016 Apr 1;126(4):1216-23.
外泌体分离
离心法：这是目前外泌体提取最常用的方法，此 种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜 鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体 没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此 种方法得到的是微泡不是外泌体、 过滤离心：外泌体是一个囊状小体，相对分子质 量大于一般蛋白质，因此选择不同大小的MWCO 膜可使外泌体与其他大分子物质分离。这种操作 简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样 存在纯度不足的问题。 密度梯度离心:用此种方法分离到的这种方法可以 保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、 免疫磁珠法:不需要昂贵的仪器设备, 但是非中性 pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不 便进行下一步的实验，外泌体纯度高，但是前期 准备工作繁杂，耗时，量少 色谱法:分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是 需要特殊的设备，应用不广泛
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外泌体与手术
术后GPC1+ 外泌体均下降
10
外泌体与预后
✓ GPC1+ 外泌体下降大于中位水平的OS和disease-specific survival 水平 高于低于中位水平者（OS: 26.2月 vs 15.5 月; DSS: 27.7 月vs 15.5月）
✓ CA19-9水平现将无法判断预后 11
D.D. Taylor, C. Gercel-Taylor / Gynecologic Oncology 110 (2008) 13–21
1 外泌体与肿瘤诊断 2 外泌体与肿瘤发生发展
3 外泌体与肿瘤转移
4 外泌体与肿瘤血管新生
5
外泌体与肿瘤治疗与耐药
6
外泌体与肿瘤免疫
外泌体与肿瘤发生、发展
TEX会携带肿瘤的突变物质，进入到正常细 胞中，将这些突变物质整合到正常细胞当中。
PKT小鼠模仿人类胰腺癌发展过程， 4.5周时形成PanIN，8周时死于 PDAC GPC1+ 外泌体的比例随着肿瘤体 积增大和组织学分化异型性增大 而不断升高
外泌体的浓度与大小同样与病情 进展无相关性
8 Ann Transl Med. 2016 Feb;4(4):64
外泌体早期诊断
GPC1+ 外泌体比例在鉴别胰腺导管腺癌与胰 腺良性疾病和正常人群中的作用