酶的提取与分离纯化课件

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提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
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提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
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提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
酶的提取与分离纯化
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
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第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
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细菌细胞壁的结构
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酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
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(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
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二、细胞破碎（胞内酶）
（一）细胞壁组成
细胞壁的主要成分： 细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸) 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌: 多糖（几丁质和葡聚糖）
即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一 般用g（或数字g）表示。
RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r
此公式描述了相对离心力与转速之间的关系
旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm
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2. 沉降系数:（sedimentation constant）
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各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
物
细菌
细菌
菌
酵母菌
霉菌
壁厚 /nm
层次
15 ~ 50 单层
10 ~ 13 同G+ 多层
100 ~ 300 多层
100 ~ 250 多层
主要 组成
肽聚糖
(40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
肽聚糖 (5% ~ 10%)
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
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四、 离心分离
三种形式： 1）离心沉降 2）离心过滤 3）离心分离和超离心
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（一）基本原理
1. 离心力 Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，
指单位离心力下颗粒的沉降速度 （sedimentation velocity）,用S表示。
由于许多生物大分子的S值很小，所以定 义10 13 s 为一个沉降单位，1S = 11013 s。
常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚 细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系 数一般在1 ~ 200之间。
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实验室离心机
温度类型：常温及 冷冻
超速离心机均为冷 冻型。
使用冷冻离心机时 提前降温，预冷离 心头。
使用超速离心机时 先抽真空。
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离心的形式
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
纯化工艺评价
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基因工程酶/蛋白分离纯化的一般流程
第一节 酶的分离
一、发酵液预处理
目的：
提高固液分离效率 使产物转移用于后处理相中 去除部分杂质
(一)发酵液的相对纯化
1. 无机离子的去除 （降低离子强度、酶活性影响） 2. 杂蛋白质的去除 （沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附） 3. 色素及其他物质的去除
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（二）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速
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离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机 高速离心机 超速离心机
6000 6000〜 25000 >25000
常温，注意样品热变性和离心 管平衡
冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
冷冻＋真空系统（减少空气阻 力和摩擦）， 离心管的精确平衡
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3.酶解法（enzymatic lysis）：
外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。 自溶法（autolysis）: 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 生溶解的现象。
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4. 化学法
应用各种化学试剂与细胞膜作用， 使细胞膜结构改变或破坏。
1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用 丙酮、丁醇、氯仿等。 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面 活性剂，如Triton X-100，Tween等。
（二）细胞破碎的方法
机械法 机械捣碎法 研磨破碎法 匀浆破碎法 高压匀浆法 超声破碎法
非机械法 酶法 化学法 物理法 干燥法
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1.机械法：
1）液体剪切：搅拌、匀浆。 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。 3）超声波破碎法。 2. 非机械法——物理法 1）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 2）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。
破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率：
利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。
3.测定释放的蛋白质量或酶活力：
测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，
估算破碎率。
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三、酶的提取(extraction)
把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放 出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂 质从原料中引入溶液。
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破菌
分离策略
Intact membrane a Detergent
➢ 酶法+高压匀浆/超声
➢ 盐及表面活性剂
Detergent
➢ 低浓度的变性剂
Detergent-solubilized proteins
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（三）细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；