酶的提取与分离纯化课件
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酶的提取与分离纯化
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分ห้องสมุดไป่ตู้
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
2
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
24
（二）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速
25
离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机 高速离心机 超速离心机
6000 6000〜 25000 >25000
常温，注意样品热变性和离心 管平衡
冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
冷冻＋真空系统（减少空气阻 力和摩擦）， 离心管的精确平衡
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
纯化工艺评价
3
基因工程酶/蛋白分离纯化的一般流程
第一节 酶的分离
一、发酵液预处理
目的：
提高固液分离效率 使产物转移用于后处理相中 去除部分杂质
(一)发酵液的相对纯化
1. 无机离子的去除 （降低离子强度、酶活性影响） 2. 杂蛋白质的去除 （沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附） 3. 色素及其他物质的去除
指单位离心力下颗粒的沉降速度 （sedimentation velocity）,用S表示。
由于许多生物大分子的S值很小，所以定 义10 13 s 为一个沉降单位，1S = 11013 s。
常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚 细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系 数一般在1 ~ 200之间。
（二）细胞破碎的方法
机械法 机械捣碎法 研磨破碎法 匀浆破碎法 高压匀浆法 超声破碎法
非机械法 酶法 化学法 物理法 干燥法
12
1.机械法：
1）液体剪切：搅拌、匀浆。 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。 3）超声波破碎法。 2. 非机械法——物理法 1）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 2）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
21
四、 离心分离
三种形式： 1）离心沉降 2）离心过滤 3）离心分离和超离心
22
（一）基本原理
1. 离心力 Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
9
细菌细胞壁的结构
10
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
6
(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
7
二、细胞破碎（胞内酶）
（一）细胞壁组成
细胞壁的主要成分： 细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸) 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌: 多糖（几丁质和葡聚糖）
破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率：
利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。
3.测定释放的蛋白质量或酶活力：
测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，
估算破碎率。
17
三、酶的提取(extraction)
把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放 出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂 质从原料中引入溶液。
即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一 般用g（或数字g）表示。
RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r
此公式描述了相对离心力与转速之间的关系
旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm
23
2. 沉降系数:（sedimentation constant）
13
3.酶解法（enzymatic lysis）：
外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。 自溶法（autolysis）: 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 生溶解的现象。
14
4. 化学法
应用各种化学试剂与细胞膜作用， 使细胞膜结构改变或破坏。
1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用 丙酮、丁醇、氯仿等。 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面 活性剂，如Triton X-100，Tween等。
26
实验室离心机
温度类型：常温及 冷冻
超速离心机均为冷 冻型。
使用冷冻离心机时 提前降温，预冷离 心头。
使用超速离心机时 先抽真空。
27
离心的形式
15
破菌
分离策略
Intact membrane a Detergent
➢ 酶法+高压匀浆/超声
➢ 盐及表面活性剂
Detergent
➢ 低浓度的变性剂
Detergent-solubilized proteins
16
（三）细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；
8
各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
物
细菌
细菌
菌
酵母菌
霉菌
壁厚 /nm
层次
15 ~ 50 单层
10 ~ 13 同G+ 多层
100 ~ 300 多层
100 ~ 250 多层
主要 组成
肽聚糖
(40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
肽聚糖 (5% ~ 10%)
18
提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
19
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
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提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分ห้องสมุดไป่ตู้
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
2
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
24
（二）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速
25
离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机 高速离心机 超速离心机
6000 6000〜 25000 >25000
常温，注意样品热变性和离心 管平衡
冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
冷冻＋真空系统（减少空气阻 力和摩擦）， 离心管的精确平衡
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
纯化工艺评价
3
基因工程酶/蛋白分离纯化的一般流程
第一节 酶的分离
一、发酵液预处理
目的：
提高固液分离效率 使产物转移用于后处理相中 去除部分杂质
(一)发酵液的相对纯化
1. 无机离子的去除 （降低离子强度、酶活性影响） 2. 杂蛋白质的去除 （沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附） 3. 色素及其他物质的去除
指单位离心力下颗粒的沉降速度 （sedimentation velocity）,用S表示。
由于许多生物大分子的S值很小，所以定 义10 13 s 为一个沉降单位，1S = 11013 s。
常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚 细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系 数一般在1 ~ 200之间。
（二）细胞破碎的方法
机械法 机械捣碎法 研磨破碎法 匀浆破碎法 高压匀浆法 超声破碎法
非机械法 酶法 化学法 物理法 干燥法
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1.机械法：
1）液体剪切：搅拌、匀浆。 2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。 3）超声波破碎法。 2. 非机械法——物理法 1）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等） 平衡后迅速转入低渗溶液或水中。 2）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
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四、 离心分离
三种形式： 1）离心沉降 2）离心过滤 3）离心分离和超离心
22
（一）基本原理
1. 离心力 Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）； Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表示，
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
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细菌细胞壁的结构
10
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
6
(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
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二、细胞破碎（胞内酶）
（一）细胞壁组成
细胞壁的主要成分： 细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸) 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌: 多糖（几丁质和葡聚糖）
破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
2.测定导电率：
利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。
3.测定释放的蛋白质量或酶活力：
测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，
估算破碎率。
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三、酶的提取(extraction)
把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放 出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂 质从原料中引入溶液。
即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一 般用g（或数字g）表示。
RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r
此公式描述了相对离心力与转速之间的关系
旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm
23
2. 沉降系数:（sedimentation constant）
13
3.酶解法（enzymatic lysis）：
外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。 自溶法（autolysis）: 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 生溶解的现象。
14
4. 化学法
应用各种化学试剂与细胞膜作用， 使细胞膜结构改变或破坏。
1）有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用 丙酮、丁醇、氯仿等。 2）表面活性剂处理：常用非离子型表面 活性剂，如Triton X-100，Tween等。
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实验室离心机
温度类型：常温及 冷冻
超速离心机均为冷 冻型。
使用冷冻离心机时 提前降温，预冷离 心头。
使用超速离心机时 先抽真空。
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离心的形式
15
破菌
分离策略
Intact membrane a Detergent
➢ 酶法+高压匀浆/超声
➢ 盐及表面活性剂
Detergent
➢ 低浓度的变性剂
Detergent-solubilized proteins
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（三）细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；
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各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 革兰氏阳性 革兰氏阴性 放线
物
细菌
细菌
菌
酵母菌
霉菌
壁厚 /nm
层次
15 ~ 50 单层
10 ~ 13 同G+ 多层
100 ~ 300 多层
100 ~ 250 多层
主要 组成
肽聚糖
(40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
肽聚糖 (5% ~ 10%)
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提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
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提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
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提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），