血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒
犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对 分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只 能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此 流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱； 反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝 胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再 进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中 等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布， 部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质 之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的 各物质按其分子大小不同而被分离。
血红蛋白与核黄素的 凝胶层析分离
实验目的
• （1）掌握凝胶层析的原理 • （2）掌握柱层析的基本装置 • （3）熟悉凝胶层析的操作过程
实验原理
凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不 同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝 胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子 大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚 糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267） 和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样 品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶 颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速 度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝 胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢， 后流出层析柱。这样就可分离核黄素和血红蛋白。
凝胶层析法
凝胶层析（gel chromatography）常 出现多种名称 ：如凝胶过滤、分子筛层析、 排阻层析、凝胶渗透层析等。
凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分
子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状 不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。
凝胶层析的应用范围：
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、 酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过 单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用 凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。
• 色谱床的检查：
• 为了取得良好的色谱效果，须在色 谱前对所装色谱桂进行检查。首先 观察色谱床是否均匀，床面是否平 整，有无“纹路”和气泡等。
• 5、加样与洗脱：
打开平衡好的色谱柱底端出口，使柱
内溶液流至床表面相切时时关闭出口。将 吸有0.5ml样品的加样滴管在床表面lmm处 沿管内壁轻轻转动加样，加完后，打开底 端出口使样品流至床表面，关闭出口，用 少量洗脱液同样小心清洗管内壁表面l-2次， 使样品流至床表面，然后将洗脱液在柱内 约加至2-3cm高，接上高位贮液瓶并调好流 速即开始洗脱（注意：在加样和洗脱过程 中应缓慢加入液体，防止冲坏床表面，影 响分辨率）。
• 6、收集与测定：
收集时可用自动收集器或手工操 作，每管接洗脱液3mL，直至第二个 洗脱峰降至基线附近。收集后用721E 型分光光度计在451nm波长处以洗脱 液为空白，对每管收集液进行光吸收 测定。以收集管数(或洗脱体积)为横座 标，吸光度为纵坐层析 （2）离子交换层析 （3）亲和层析 （4）吸附层析 （5）分配层析
• 4、平衡：
柱装好后，使色谱床稳定5-10分钟， 然后接上高位贮液瓶，打开出口活塞，调 节高位贮液瓶的高度，控制流速为 1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平 衡，是层析床稳定。
注意：在洗脱时，要将恒流泵至色谱 桂的连接管内气泡全部排除，以免影响流 速。另外务必防止流速过大以及过小，造 成色谱床液体流干。
• 1、凝胶处理； • 将SephadexG-25凝胶干粉放入过量水
中浸泡24小时或沸水浴2小时。浸泡后搅动 凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细 粒悬浮，如此反复多次。
• 2、层析柱的预备
用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程 中不能使用毛刷，以免擦伤层析柱内壁，影响层 析分离效果。固定好层析柱各处的接口，用水检 察层析柱各处的接口密封性。将清洗后的层析柱 垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的聚乙烯管 内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气泡排除后，是溶液在底部留至3-5cm高即关 闭出水口。
4．分辩率不高 （1）装拄不均匀 （2）样品量过大 （3）流速太快 （4）拄不垂直或拄不合适
凝胶层析的优点
凝胶层析具有设备简单、操作方便、 分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。 目前已被广泛应用于各种生化产品的分离 和纯化。
－、凝胶层析的基本原理
凝胶层析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩
散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小 分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分 子尚在进行中
实验器材与试剂
（一）器材 1.2cm x 40cm层析柱、1mL微量可调式移液
器、721E型分光光度计、恒压贮液瓶、自动部分 收集器 （二）试剂
（1）葡聚糖凝胶Sephades G-25 （2）血红蛋白与核黄素的混合液 （3）洗脱液：0.05mol/L磷酸盐缓冲液
（pH=7.3）或生理盐水
实验操作
凝胶过滤层析经常遇见的问题
1．流速慢 （1）有气泡、出水管阻塞 （2）没打开夹子 （3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、 接头漏气）
2．拄内产生气泡 （1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流 （2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧
3．条带扭曲 （1）胶面不平 （2）样品或洗脱液中有颗粒 （3）装拄不均匀
• 3、装柱：
将处理好的凝胶在烧杯内用1倍体积的洗脱 液搅拌成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱 中。待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开底 端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝 胶体积沉淀至25cm高度为止。操作中注意防止气 泡与节痕产生。
注意：操作要温和。凝胶床要整体均匀连续,不得 有气泡、断纹与节痕。如凝胶床表面不平整，可 用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自 然下沉。