精子形态学分析的标准化20160817.

四、精子形态分析与临床
一些中药、微量元素（锌等）、抗氧化 剂等能有效提高正常精子的比例。
四、精子形态分析与临床
现有资料表明：精子形态是与男性 生殖能力最相关的精液参数之一。 精子形态分析方法简单、实用性 强，临床医生应高度重视。 精子形态分析的标准化亟待完善和 推广。
• 九十年代实验室检查精液大多采用人工方法,但较 •
二、精子形态与功能
3. 尾部
运动
三、精子形态分析常用方法
用于精子形态学分析的染色方法有：
改良巴氏染色法、苏木精-伊红（HE）染色法、 瑞氏染色法、瑞-吉氏染色法、Diff-Quik染色法和 Shorr染色法。 6种染色方法对精子头大小的影响不同，瑞-吉氏和瑞 氏染色法的精子头的长轴和短轴最高，其次为DiffQuik染色法，巴氏染色法的精子头的长轴和短轴最 低，而HE和Shorr染色法的精子头长轴和短轴介于巴 氏染色法和Diff-Quik染色法之间。
头部缺陷的异常精子
• 顶体过小 • 顶体过大 • 头部一侧呈椭
圆形的弧形
2.异常精子形态
• 颈部和中段缺陷
颈部弯曲 中段非对称性插入 中段过粗 中段过细 胞浆小滴
颈部和中段缺陷的异常精子
• 颈部过粗 • 中段和头部
分离
• 尾部连来自百度文库处
扁平
2.异常精子形态
• 尾部缺陷
短尾 折尾 尾部弯曲
二、精子形态与功能
四、精子形态分析与临床
精索静脉曲张患者头部缺陷、含胞浆小 滴精子的比例比正常者显著升高，并随 精索静脉曲张程度的增加而升高。 少、弱精子症患者精子形态异常的比例 显著增加，异常精子中以头部缺陷为 主。
四、精子形态分析与临床
解脲支原体等感染的精液，异常精子率 显著增加。
四、精子形态分析与临床
长期接触农药或服用绵籽油，可引起以 小头精子、颈部缺陷精子为主的异常形 态精子的比例升高。
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1. 头部主要的结构: 细胞核和顶体 细胞核: 父方的遗传物质、单倍体，双链
DNA，与鱼精蛋白紧密结合。
顶体:覆盖精子核前2/3的扁囊状结构
含有多种与卵子的识别和受精相关 的酶 其中最重要的是顶体蛋白酶和透明 质酸酶
二、精子形态与功能
2. 颈部和中段
连接头部和尾部 中段的线粒体鞘含有大量的线粒体 为精子的运动提供能量 9+2结构
三、精子形态分析常用方法
5．苏木紫－伊红染色法(HE)
(3)固定液配制 9５％乙醇：乙醚为1:1。 (4)操作方法 ① 涂片置固定液中固定15分钟；②已固定的涂片流
水洗2分钟，蒸馏水洗1分钟；③苏木紫液染色约5分钟(视着色 情况增减)；④水洗，1%盐酸分色，显微镜下控制；⑤流水浸 洗至少15分钟，至细胞核呈蓝色；也可短时水洗后，浸于40℃ 温水使核变蓝。在显微镜下观察，若核染色过深或不足，应再 次分色或重染；⑥伊红Y液染1~2分钟后，95%乙醇浸洗2次， 无水乙醇浸洗2次，每次约1~2分钟 ；⑦苯酚 :二甲苯(1:3) 浸 洗5分钟；⑧ 二甲苯2次，每次浸洗3~5分钟；⑨用中性树胶封 片，显微镜下观察。
三、精子形态分析常用方法
2．Shorr染色法（WHO推荐）
精子涂片空气干燥后，用苏木精染色1~2分钟；流水浸洗后置 42℃温水中蓝化5分钟（或浸入乙醇铵中蓝化）；Shorr染剂 （BDH Shorr粉4 g溶于220 ml 50%温乙醇中，冷却，加入2.0 ml 冰醋酸，过滤即可）染3~5分钟；流水冲洗，晾干后镜检。
3．Diff-Quik染色法（WHO、SCA分析系统推荐）
精子涂片先置于固定液（1.8 mg二芳基甲烷加至1 L甲醇中而 成）中固定15秒；将玻片直立于吸水纸上以去除多余的液体；将 玻片在溶液1（1 g氧甲蒽加至1 L叠氮钠防腐液中）中染色10秒 钟，然后在溶液2（0.625 g天蓝A和0.625 g亚甲基蓝加至1 L缓冲 液中）中染色5秒钟，各步骤之间均除去多余的液体；在流水中 浸洗10~15次以除去多余的染料；将玻片垂直竖立以去除水分， 使之完全干燥；油镜下观察。
精子形态学分析的标准化
生殖健康
一、精子的基本形态
• 精子主要由三部分组成
头部 颈部和中段 尾部
1. 精子的正常形态
头部：扁椭圆形，长4~5μm、宽 2.5~3.5μm、厚约1.0μm。 中段：细，宽度＜1μm，大约为头部 长度的1.5倍；胞浆小滴＜正常 头部大小的1/2。 尾部：长约45μm，比中段细，均 一、非卷曲。
四、精子形态分析与临床
吸烟和大量饮酒是产生异常形态精子 增加的重要因素，异常精子以头部异常 为主。
四、精子形态分析与临床
雷达辐射可造成双头精子、大头精子、 无定形精子、颈部和中段异常精子显著 升高。
四、精子形态分析与临床
在去除感染、辐射、农药中毒、不良生 活习惯（吸烟等）的因素后，正常形态 精子的比例迅速增加。精子形态分析是 提供男性不育症预后的重要指标。
三、精子形态分析常用方法
6．瑞-姬氏混合染色法
(1) 瑞氏染液 称取瑞氏染料0.1g，放在清洁干燥乳钵里，加少 量甲醇，边加边磨使染料溶解。将已溶解的染料倒入棕色瓶 中，加甲醇至60ml，置室温下1周即可使用。 (2) 姬姆萨染液 称取姬母萨染料0.5g，置于33ml甘油中，60℃ 水浴2h，使其溶解，再加入60℃预热的甲醇33ml，混合后 置棕色瓶内，室温下放置数日后方能使用。 (3) 操作方法: 取液化的精液离心(１000r/min)10分钟，弃上清 液，留取沉淀再加生理盐水，相同上述操作，洗涤3次，配 制成10×106/ml浓度的精子悬液，涂片自然干燥。用瑞-姬 氏混合液(10:1)染30~60秒，加等量pH6.9磷酸盐缓冲液， 染色10分钟，自来水冲洗，待自然干燥后，用光学树脂封 片，置油镜下镜检。
•
八十年代比较,由于不少单位使用了MACRO精子计 数板而提高了准确性。 近十年来电脑技术的运用使精子速疫和轨迹成为 精液分析的重要参数。 精子形态检查成为重要的男性不育症的分析指标, 仪器设备的更新势在必行,谁先更新谁的诊疗技术 先提高,科研成果更有价值。抢占市场先机更能吸 引更多的病人,创造更好的经济效益。
三、精子形态分析常用方法
6种精子染色方法的染色效果亦不同:
Diff-Quik和Shorr染色法可以很清楚地区分顶体和核 其次为HE染色法， 而巴氏、瑞氏和瑞-吉氏染色的精子顶体和核分界不 很明显。 基于不同染色方法对精子头大小的影响、染色效果以 及操作的简易与否，推荐Diff-Quik和Shorr染色法。
方法
涂片的方法有多种，WHO推荐的方法有拉薄技术和滴管法，拉 薄技术即用另一张载玻片的边缘拖拉载玻片上的一滴精液；滴管 法即水平持滴管使一滴精液沿载玻片的表面展开。由于精液有一 定粘稠度，这两种方法都很难涂成均匀的涂片，可作为可选择性 方法使用。
三、精子形态分析常用方法
推荐涂片方法
推荐精子涂片方法 (改良滴管法)：用滴管将一滴精液置于载玻 片上，然后从液滴中央向周围循环吸净多余的精液，注意滴管 的头要平整，滴管与载玻片垂直，缓慢吸去多余的液体。 低密度、粘稠的、或充满碎屑的标本，建议先离心去除精浆， 沉淀的精子团重新悬浮在适当体积中，以获得尽可能高的密 度，但不应超过80×106/ml。正常精子密度且液化良好的精液 标本亦可以洗涤后用精子悬液进行涂片，但离心操作对精子形 态分析有无影响，尚需要进一步验证。 精子涂片可进行空气干燥并固定。固定程序取决于染色方法。
三、精子形态分析常用方法
4．改良巴氏染色(WHO推荐)
(6)操作方法 ①将洗涤后的精子悬液涂片，在空气中自然干燥，然 后用固定液固定6~10分钟㈩② 将已固定的涂片依次浸入80%， 70%，50%乙醇内30秒，最后置于蒸馏水中1分钟；③在苏木素 染液中染10分钟，取出流水洗5分钟，然后浸入酸性乙醇1分 钟，流水洗5~10分钟；④涂片依次浸入50%，70%，80%， 95%乙醇内各30秒㈩⑤在橙黄G6染液中染3~5分钟，在95%乙 醇中浸洗1分钟；⑥在EA-50染液中染15~20分钟，于95%乙醇 中浸洗30秒，再依次浸入3缸二甲苯中使其透明，每缸约1~2分 钟㈩⑦用光学树脂加盖片封固，油镜下观察。
精子头部超微结构
1.核 2.顶体 3.细胞膜 4.核囊 5.核膜孔 6.颈部 7.基底板 8.横纹小柱 9.中心子（近端） 10.中心子（远端） 11.外纤维 12.鞭毛轴丝 13.线粒体
精子超微结构
• A 精子的整体形态：1.头部顶体， •
2.颈部，3.中部，4.尾部 B 中部与尾部的联结部位：5.中部断 面线粒体，6.纤维鞘，7.九根外纤 维，8.九根周围小管，9.组中心小 管，10.细胞膜 C B的断面：11.纵向支柱 D 尾部近远端 E 终端主节与终节相连部 F 终节：12.微细管
三、精子形态分析常用方法
4．改良巴氏染色(WHO推荐)
(1) EA-50的配制 将伊红Y、俾士麦棕、亮绿SF染剂分别配成
100g/L的水溶液，作储备液；将上列储备液伊红Y 5ml，俾士 麦棕1ml，亮绿1.25ml混匀，用95%乙醇加至200ml。然后加 入0.4g磷钨酸和0.1ml饱和碳酸锂溶液，混匀后放入棕黑色瓶 中，于室温可保存3个月左右。使用前必须过滤。 (2) 橙黄G6的配制 称橙黄G6 0.5g，溶于5ml蒸馏水，待溶解后加 95%乙醇至100ml，然后加磷钨酸15mg，混匀后置棕黑色瓶 中，用前必须过滤。室温下此液可保存3个月。
三、精子形态分析常用方法
4．改良巴氏染色(WHO推荐)
(3) 哈里斯(Harris)苏木精的配制 称硫酸铝铵20g，溶于200ml蒸 馏水；称苏木精1g，溶于10ml 95%乙醇中。将苏木精溶液加 入硫酸铝铵溶液中，混匀并加热至95℃。然后慢慢加入氧化 汞0.8g。搅拌使其溶解，此时溶液呈深紫色。冷却后过滤，使 用前以等量蒸馏水稀释，并再一次过滤。 (4) 酸性乙醇溶液的配制 无水乙醇30ml，加浓盐酸0.2m和蒸馏水 10ml混匀。 (5) 固定液的配制 无水乙醇：乙醚为1:1。
四、精子形态分析与临床
精子形态是迄今为止和受精率最相关的 指标，并且操作简单，费用少。不少研 究机构的研究结果表明，采用严格精子 形态分析能较好地预测受精结果。一般 将正常形态精子的正常值定为15%，正 常形态精子＞15%的精子，体外受精率 在80%以上；而正常精子低于5%的， 其IVF受精率＜30%。
三、精子形态分析常用方法
5．苏木紫－伊红染色法(HE)
(1) 苏木紫染液的配制 实验室常用的是哈里斯(Harris)苏木紫 液。甲液：苏木紫1g，无水乙醇10ml；乙液：硫酸铝钾 20g，蒸馏水20ml，加温溶解。甲、乙两液分别溶解后混 合，加热煮沸，沸后去火，待溶液不翻腾时立即加入氧化 汞0.5g(此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢 出)。然后使染液迅速冷却，冷却后过滤即可应用。用时 每10ml加冰醋酸4ml。 (2) 伊红Y液配制 伊红Y 1g，蒸馏水5ml，溶解后将冰醋酸滴于 其中，有沉淀生成，至成浆糊状再加水数毫升，并继续滴冰 醋酸，直至沉淀不再增加，过滤，弃滤液留沉淀物，特其干 燥后，溶于95%乙醇200ml中即成。
三、精子形态分析常用方法
• 精子形态分析的标准有：
WHO标准 严格标准；
• 分析方法：
人工法 计算机自动分析
三、精子形态分析常用方法
1． 涂片的制备
一般用新鲜的液化精液或生理盐水洗涤过的精子悬液进行涂片， 通常每份标本涂双份片子，以备染色或操作出问题。载玻片应洁 净，可用70%酒精洗涤并干燥后使用；涂片的厚薄应根据精子密 度而定，精子密度高者涂片应薄些，而精子密度低者涂片应尽可 能厚些。
• • • •
精子颈部和中段超微结构
• B 颈部（局部）：
1.线粒体，2.外纤维，3.细胞膜 4.中心子（近位） 5.中心子（远位），6.外纤维 7.横纹小柱，8.关节样小头 9.关节样小头顶，10.轴丝
• C 中部断面：
1.线粒体 2.外纤维
2.异常精子形态
• 头部缺陷
锥形、梨形、圆形 无定形、头部有空泡 小顶体