1. 同源重组在G+球菌基因敲除中的运用

运用pKOR1敲除SE1457 srrAB
In-frame deletion of srrAB （2464bp）
∆srrAB突变株鉴定
PCR鉴定
RT-PCR鉴定
srrA srrA srrAB srrB srrB
Western Blot鉴定
srrAB互补株构建
-∆srrAB（pCN51-srrAB） -∆srrAB（pRAB11-srrA） -∆srrAB（pRAB11-srrB）
细菌的遗传变异现象
• 细菌的变异现象
– 形态结构变异 – 菌落变异 – 毒力变异 – 耐药性变异 –…
细菌遗传变异的物质基础
• 染色体:一条环状双螺旋DNA，无核膜、裸 露于细胞质中，无组蛋白包绕，附着在横 隔中介体上或细胞膜上； • 与真核细胞不同，细菌基因组无内含子， 转录后形成的mRNA不必再剪切、拼接，可 直接翻译成多肽
细菌遗传变异的物质基础
• 转座因子的特点：
– 能从染色体的一个位点转移到另一个位点，或 由一条染色体转移至另一条染色体 – 不能像质粒或噬菌体那样独立存在 – 能编码转座所需的转座酶，移动时携带转座必 需基因一起迁移 – 转座的频率很低，且插入的位点是随机的，不 依赖转座子和靶位点之间序列的同源性
• 常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部 曲思想
基因敲除的技术路线
• 构建重组基因载体（含同源片段的重组质 粒）； • 用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入 受体细胞核内（待敲除菌株中）； • 用选择培养基筛选已击中的细胞（筛选重 组子）； • 将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因 动物，对转基因动物进行形态观察及分子 生物学检测（筛选突变株）；
细菌的生物学特点
• • • • • 个体微小 结构简单：单细胞生物 易于培养 繁殖快：代时仅20-30min 具有一条染色质（无内含子），单倍型
• 细菌是生命科学研究重要的模式生物
细菌的遗传变异现象
• 遗传（heredity): 子代与亲代之间生物学 性状具有相似性。使细菌的性状保持相对 稳定，且代代相传，使其种属得以保存。 • 变异(variation)：在一定条件下，若子代 与亲代或子代与子代之间的生物学性状出 现差异。变异使细菌产生变种和新种，以 利于细菌的生存及进化。
DNA重组包括
• 细菌的基因转移与重组
– 接合/conjugation：性菌毛 – 转化/transformation：直接摄取 – 转导/transduction：温和噬菌体
• 转座子转座重组 • 位点特异重组：DNA分子特定位点上的重组 • 同源重组：核苷酸序列相同或相似的两个 DNA分子之间进行交换、重新连接
突变株筛选
Blue-white discrimination
Maryvonne A, et al. Applied Environmental Microbiology, 2004,11:6887
表皮葡萄球菌saeRS敲除
Lou Q, et al. BMC Microbiology, 2011,11:146
表皮葡萄球菌saeRS敲除
4. 运用pKOR1质粒敲除G+球菌基因
Map of pKOR1
pKOR1质粒特点
• A replacement plasmid that employs antisense secY RNA expression (secY expression are essential for bacterial growth and survival) for counter-selection （obviated the need for antibiotic marker selection） • The lambda recombination cassette (Invitrogen) is another feature of pKOR1 that permits rapid cloning of mutant alleles without the use of restriction enzymes and ligases
∆vraSR突变株生物学特性研究
E-t研究
106 105 104 103 102 106 105 104 103 102 106 105 104 103 102
∆vraSR菌株对SDS敏感性增高，对H2O2敏感性无明显差异
∆vraSR突变株生物学特性研究
同源重组在细菌基因敲除中的运用
• 基因功能研究方法
– 计算机预测基因功能 – 基因失活
• 基因敲除knock out • 转座子插入突变 • 反义RNA技术（RNA沉默）：knock down
– 基因过表达（over-expression） – 酵母双杂交（yeast two-hybridization）
3. 运用pMAD质粒敲除G+球菌基因
Blue-white discrimination
金 黄 色 葡 萄 球 菌 敲 除
vraFG
突变株筛选/screening of mutant
• Transformants were selected after 2 days at 30℃ on rich medium containing either spectinomycin (100 µg/ml) or erythromycin(5 µg/ml). • One blue colony was incubated at TSB without antibiotic，shaking for 2 h at 30 ℃，followed by 6 h at 42 ℃ • Serial dilutions of this culture were plated on tryptic soy agar (TSA) containing X-Gal and spectinomycin • All of the spectinomycin resistant, erythromycin sensitive white colonies on X-Gal-containing plates had the expected deletion
细菌遗传变异的物质基础
• 转座因子，可移动的遗传原件，jump gene • 是存在于细菌染色体或质粒分子上的一段 特异的核苷酸序列片段，它能在DNA分子 中移动，不断改变它们在基因组的位置， 能从一个基因组转移到另一基因组中； • 两种存在形式：
– 插入序列(insertion sequence, IS)，最简单的转座 因子，由反向重复序列和转座酶基因组成 – 转座子(Transposon, Tn)，IS基础上携带与转座 无关的基因，如耐药基因
5. 运用pKOR1敲除其它基因
• 表皮葡萄球菌PhoU同源物（SERP0136）的抗体制 备及免疫鉴定，微生物与感染，2014. • 金黄色葡萄球菌agr阴性突变株的构建及对PVL表 达的影响，中华检验医学，2012.
金黄色葡萄球菌临床株多基因敲除
三、转座子插入突变在基因失活中的运用 • Nguyen HT, et al. A lipoprotein modulates activity of the MtrAB two-component system to provide intrinsic multidrug resistance, cytokinetic control and cell wall homeostasis in Mycobacterium，Molecular Microbiology, 2010, 76(2), 348–364.
同源重组在G+球菌基因敲除中 的运用
武有聪 大理大学基础医学院
分子微生物学实验技术
• 学时
– 理论学时：12hrs – 实验学时：28hrs
• 分值构成
– 期末考试：50% – 实验报告：30% – 作业：15% – 考勤：5%
主要内容
• DNA重组概述 • 同源重组敲除G+球菌基因
– 运用质粒pBT2构建同源重组质粒 – 运用质粒pMAD构建同源重组质粒 – 运用质粒pKOR1构建同源重组质粒
细菌遗传变异的物质基础
• 质粒（plasmid）：是细菌染色体外的遗传 物质，为环状闭合的双链DNA，携带遗传 信息，决定细菌的某些生物学特性； • 其分子量远比染色体为小，仅为细菌染色 体DNA的0.5～3%；非细菌生命活动所必须
细菌遗传变异的物质基础
• 噬菌体phage：是感染 细菌、真菌、放线菌 或螺旋体等微生物的 病毒； • 无细胞结构、只含有 一种核酸，严格细胞 内寄生等病毒特性； • β棒状杆菌噬菌体
表皮葡萄球菌lytSR敲除
selection of Erm-resistant and Cm-sensitive strain
重组质粒pBT2-∆lytSR 酶切鉴定 Lane 3: cut by EcoRI &HindIII; lane 4: : cut by BamHI &NheI
∆lytSR突变株RT-PCR鉴定 Lane 1：∆lytSR突变株； Lane 2：SE1457野生株 ∆lytSR突变株PCR鉴定
细菌的遗传变异现象
• 变异的分类：
– 基因型变异（genotypic variation)：由于基因结 构的改变而引起生物学性状的改变；不受外界 因素的影响；仅发生在少数个体；可遗传给后 代； – 表型变异（phenotypic variation）：受环境因素 影响所致，基因结构未发生改变，会波及环境 中的全部个体，变化是可逆的，不能遗传给后 代。
1. G-杆菌基因敲除技术
• Red同源重组技术 • 原理 • 将一段携带与靶基因两翼各有40～60bp同源 序列的PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌 体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性 DNA片段与染色体 (或载体)的特定靶序列进 行同源重组，靶基因被标记基因置换下来
Red同源重组技术
2. 运用pBT2质粒敲除G+球菌基因
• 转座子插入突变
一、概述：微生物的概念及分类
• 概念：microorganism，是一群形体微小、 结构简单、肉眼直接看不到的，必须借助 光学或电子显微镜才能观察到的微小生物 的总称 • 分类：
– 非细胞型微生物： non-cellular microorganisms – 原核细胞型微生物： prokaryotes – 真核细胞型微生物： eukaryotes
• An XbaI/HindIIIdigested erythromycinresistance cassette (ermB) from plasmid pEC1 was inserted into the pBT2 plasmid, named as pBT2-ermB
temperature-sensitive plasmid
二、同源重组
• 概念：同源重组(Homologus Recombination) 是指发生在非姐妹染色单体(sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序 列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 • 同源重组机制（Holliday模型） • 意义：
– 基因损伤修复 – 生物适应环境 – 加速进化
表皮葡萄球菌lytSR敲除
lytS:1773bp, lytR:756bp, 有20bp重叠序列
pBT2-ermB-∆lytSR
Construction of lytSR knockout mutant in staphylococcus epidermidis Zhu T, et al. BMC Microbiology, 2010, 10:287
Atc诱导下反向选择菌落
pKOR1 allelic replacement generates staphylococcal chromosomal deletions
运用 pKOR1 敲除 SE1457 vraSR
运用pKOR1敲除SE1457 vraSR
∆vraSR PCR鉴定 同源重组敲除vraSR （1644bp）