细菌内毒素检查技术培训班 讲 义精编版
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-- 具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布
2007-9-10
Bitab
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2、鲎试剂
1）鲎试剂的分类
-- 根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）
-- 根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂
-- 根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂
2007-9-10
2007-9-10
AC-lle-Glu-Ala-Arg-OH
Bitab
pN（A对硝基苯胺 黄色）
405nm测吸光度值
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3、BET用水
2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏度 的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射 用水。 2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于 0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒素 含量应少于0.005EU/ml。 美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的 灭菌注射用水或其他水。
分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性
不明显，致热性较标准内毒素弱。BET的对象是环境内毒素。
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4）标准内毒素溶液（C溶液）的制备
1）中国药典2005年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标 准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀 15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟， 其他国家药典都有类似要求
3）标准内毒素和环境内毒素
1Βιβλιοθήκη Baidu标准内毒素
经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET
检查的参考品或对照品。主要分参考标准品（RSE）及工作标准
品（CSE）。CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两
种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。
2）环境内毒素
天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成
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3）鲎试剂的质量标准
-- 灵敏度 定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集 的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml。 常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml、 0.06EU/ml、0.03EU/ml
-- 自身凝集 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应
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（2）化学结构
◆O- 特异侧链
-- 含有3个截然不同的区域 ◆核心多糖
◆类脂A
内毒素的分子结构
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2） 内毒素与热原的关系
-- 内毒素是热原之一种 -- 医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最 主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。
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一、细菌内毒素检查的基础理论
1，细菌内毒素 2，鲎试剂 3，BET用水 4，BET程序 5，2005年版细菌内毒素检查法 6，相关参数的计算 7，试验的相关知识
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1、细菌内毒素
1）化学成分及特性
-- 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物
-- 是高分子量脂多糖复合物（LPS）
1）综述部分 细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类 内毒素标准品及检查用水 BET器具的要求 供试品溶液的要求 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数的计算
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2）试验部分 （1）凝胶法
鲎试剂灵敏度复核试验 干扰试验 检查法 凝胶限量试验
凝胶半定量试验
（2）光度测定法 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 检查法
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4、BET程序
1）验证实验 灵敏度的复核试验
凝胶法
干扰试验
光度测定法 标准曲线可靠性试验
2）检查法
干扰试验
凝胶法 凝胶限量试验
凝胶半定量试验
光度测定法
动态比浊法试验
动态法
动态比色法试验
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终点法：终点比色法试验 动态终点法
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5、《中国药典》2005年版细菌内毒素检查法
3）2005年版药典BET法际验部分主要内容
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鲎试验方法
凝胶法
光度测定法
限量法
半定量法
动态法
动态 动态 浊度法 显色法
终点法
终 点 终点 浊度法 显色法
致热性
内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原， 再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应
（1）特性
耐热性 需要在250摄氏度干热至少30~60分钟才能彻底灭活
分子极性 酸碱性
多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性， 在水中呈不均匀分布 与强酸强碱水解反应
与鲎试剂反应 与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶
除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性
细菌内毒素检查技术 讲义
北京毕特博生物技术有限责任公司 2007年9月
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目录
一、细菌内毒素检查的基础理论-------------3 二、 BET试验前的准备------------------------24 三、细菌内毒素检查的实验技术-------------28 1，鲎试剂灵敏度复核-------------------------33 2，干扰初筛试验------------------------------40 3，干扰试验------------------------------------49 4，检查法---------------------------------------62 四、细菌内毒素检测技术的发展
-- 缓冲能力 -- 干燥失重 -- 无菌：中国标准无此项要求
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4）鲎试剂与内毒素的反应机理
内毒素
二价阳离子
β 葡聚糖或LAL-RM
C因子
活化的C因子
B因子
活化的B因子
活化的G因子
G因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白（凝胶）
凝固蛋白原
（酶作用物） AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA
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2）鲎试剂的规格
-- 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量 试剂）
-- 把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试 剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验 试剂
-- 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先 用相应量的溶解液复溶鲎试剂。
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2、鲎试剂
1）鲎试剂的分类
-- 根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）
-- 根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂
-- 根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂
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AC-lle-Glu-Ala-Arg-OH
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pN（A对硝基苯胺 黄色）
405nm测吸光度值
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3、BET用水
2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏度 的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射 用水。 2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于 0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒素 含量应少于0.005EU/ml。 美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的 灭菌注射用水或其他水。
分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性
不明显，致热性较标准内毒素弱。BET的对象是环境内毒素。
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4）标准内毒素溶液（C溶液）的制备
1）中国药典2005年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标 准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀 15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟， 其他国家药典都有类似要求
3）标准内毒素和环境内毒素
1Βιβλιοθήκη Baidu标准内毒素
经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET
检查的参考品或对照品。主要分参考标准品（RSE）及工作标准
品（CSE）。CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两
种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。
2）环境内毒素
天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成
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3）鲎试剂的质量标准
-- 灵敏度 定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集 的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml。 常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml、 0.06EU/ml、0.03EU/ml
-- 自身凝集 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应
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（2）化学结构
◆O- 特异侧链
-- 含有3个截然不同的区域 ◆核心多糖
◆类脂A
内毒素的分子结构
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2） 内毒素与热原的关系
-- 内毒素是热原之一种 -- 医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最 主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。
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一、细菌内毒素检查的基础理论
1，细菌内毒素 2，鲎试剂 3，BET用水 4，BET程序 5，2005年版细菌内毒素检查法 6，相关参数的计算 7，试验的相关知识
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1、细菌内毒素
1）化学成分及特性
-- 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物
-- 是高分子量脂多糖复合物（LPS）
1）综述部分 细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类 内毒素标准品及检查用水 BET器具的要求 供试品溶液的要求 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数的计算
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2）试验部分 （1）凝胶法
鲎试剂灵敏度复核试验 干扰试验 检查法 凝胶限量试验
凝胶半定量试验
（2）光度测定法 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 检查法
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4、BET程序
1）验证实验 灵敏度的复核试验
凝胶法
干扰试验
光度测定法 标准曲线可靠性试验
2）检查法
干扰试验
凝胶法 凝胶限量试验
凝胶半定量试验
光度测定法
动态比浊法试验
动态法
动态比色法试验
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终点法：终点比色法试验 动态终点法
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5、《中国药典》2005年版细菌内毒素检查法
3）2005年版药典BET法际验部分主要内容
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鲎试验方法
凝胶法
光度测定法
限量法
半定量法
动态法
动态 动态 浊度法 显色法
终点法
终 点 终点 浊度法 显色法
致热性
内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原， 再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应
（1）特性
耐热性 需要在250摄氏度干热至少30~60分钟才能彻底灭活
分子极性 酸碱性
多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性， 在水中呈不均匀分布 与强酸强碱水解反应
与鲎试剂反应 与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶
除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性
细菌内毒素检查技术 讲义
北京毕特博生物技术有限责任公司 2007年9月
2007-9-10
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目录
一、细菌内毒素检查的基础理论-------------3 二、 BET试验前的准备------------------------24 三、细菌内毒素检查的实验技术-------------28 1，鲎试剂灵敏度复核-------------------------33 2，干扰初筛试验------------------------------40 3，干扰试验------------------------------------49 4，检查法---------------------------------------62 四、细菌内毒素检测技术的发展
-- 缓冲能力 -- 干燥失重 -- 无菌：中国标准无此项要求
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4）鲎试剂与内毒素的反应机理
内毒素
二价阳离子
β 葡聚糖或LAL-RM
C因子
活化的C因子
B因子
活化的B因子
活化的G因子
G因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白（凝胶）
凝固蛋白原
（酶作用物） AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA
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2）鲎试剂的规格
-- 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量 试剂）
-- 把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试 剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验 试剂
-- 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先 用相应量的溶解液复溶鲎试剂。
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