第四章 高效液相色谱分析法
高效液相色谱法 PPT课件
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱分析实验讲义
高效液相色谱分析实验一、实验目的1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法3．评价色谱柱效4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；5．学习未知样品的定量分析方法。
二、实验原理不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等1．色谱定性分析方法（1）利用保留值与已知物对照定性A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）2．色谱定量分析方法⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。
⑵常见的色谱定量分析方法主要有：a 归一化法。
特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。
b内标法。
特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。
c 标准曲线法（外标法）。
简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
d 内标标准曲线法。
三、仪器与试剂LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯四、高效液相色谱仪操作步骤1. 流动相的预处理用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。
2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。
排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。
高效液相色谱分析法剖析课件
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
用于食品中农药残留、 添加剂、毒素等的检测。
环境监测
用于水体、土壤、大气 中污染物和痕量有机物
的分析。
生物分析
用于蛋白质、多肽、核 酸等生物大分子的分离
和测定。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择性、 可在室温下进行分离、可分析复杂样 品等。
通过高效液相色谱法，可以测定食品中的维生素、矿物质等营养成 分的含量。
食品污染物分析
高效液相色谱法能够检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等， 保障食品安全。
环境样品分析
01
水中有机物分析
高效液相色谱法可用于检测水中 的有机污染物，如酚类、苯胺类 等，有助于水质的监测和控制。
02
大气中气态污染物 的分离
样品保存
选择适当的保存方法，确 保样品在分析前不会变质。
样品处理
根据分析目的，对样品进 行适当的预处理，如离心、 过滤、萃取等。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
高效液相色分析法剖析
• 高效液相色法概述 • 高效液相色系的成 • 高效液相色操作流程
01
高效液相色法概述
定义与原理
定义
高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和分析复杂样品中各组 分的方法，基于不同组分在固定相和流动相之间的分配平衡 原理。
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
第四章 色谱分析法
（2）外标法
外标法也称为标准曲线法。 特点及要求： • • • 外标法不使用校正因子，准确性较高， 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的
快速分析。
（3）内标法
内标物要满足以下要求：
（a）试样中不含有该物质；
（b）与被测组分性质比较接近； （c）不与试样发生化学反应； （d）出峰位置应位于被测组分附近。
从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息： (1) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组 分的最少个数． （2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行 定性分析． (3) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分 析． （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色 谱柱分离效能的依据． （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流 动相)选择是否合适的依据．
相同的色谱分析条件下，某组份2的调整保留值与组份 1的调整保留值之比，称为相对保留值：
2.1
VR2 tR2 t R1 VR1
由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱 径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色 谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数 据． 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时 间或保留体积之比 .
⑵保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大值时所 经历的时间，称为保留时间，如图中 O′B．它相应于样品 到达柱末端的检测器所需的时间． ⑶调整保留时间tR′某组份的保留时间扣除死时间后称为该 组份的调整保留时间，即 tR′ = tR-tM
⑷死体积 VM 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒 间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间 以及检测器的空间的总和．当后两项很小而可忽略 不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0 （L／min）计算：
定量分析方法概述
仪器的校正和检定
01
02
03
a. 波长的校正
b. 吸光度的准确性
c. 杂散光的检查
（二）仪器的校正和检定
仪器的校正和检定
波长：常用汞灯中的较强谱线、氘灯的谱线、钬玻璃尖锐吸收峰、高氯酸钬溶液
吸光度的准确度：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波长处测定并计算 ，应符合下表规定
杂散光的检查：一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液，规定波长处测定透光率，应符合下表规定
调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X≤33%时，允许改变范围为0.7 X~1.3 X，当X＞33%时，允许改变范围为X-10% ~ X+10%
药品标准中规定的色谱条件，固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改变，其他均可适当改变，以适应系统适用性实验的要求。
高效液相色谱图：信号---时间曲线
一、高效液相色谱法
温度要求：≤40℃ 流动相pH：2~8
常用紫外检测器
01
其次有二极管阵列检测器(DAD)
02
荧光检测器
03
示差折光检测器
04
蒸发光散射检侧器
05
电化学检测器和质谱检测器等
06
2.检测器Βιβλιοθήκη 010203
甲醇-水、 乙腈-水
尽可能少用含有缓冲液的流动相
有机溶剂比例不能低于5%
流动相
二、应用与实例
氧化还原滴定法 亚硝酸钠滴定法 基本原理
氧化还原滴定法
亚硝酸钠滴定法 应用:含有芳香第一胺或水解后能生成芳香第一胺的化合物
二、应用与实例
滴定条件：
加入过量的盐酸
在室温条件（10～30℃）下滴定
滴定时加入溴化钾作为催化剂
高效液相色谱分析法的基本原理和基本组成
高效液相色谱分析法的基本原理和基本组成高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，缩写为HPLC）是一种在分析和细胞分离化学领域中最重要的技术手段之一。
在这项技术中，溶剂通过精密的柱型容器内部流动，而溶质则被不同的空气动力学条件（例如压力和温度）穿越柱的表面，进而实现其分离。
高效液相色谱分析法不仅可用于单一物质的分离，也可以用于实现混合物的全分析。
本文将深入介绍高效液相色谱分析法的基本原理和基本组成。
首先，高效液相色谱分析法的基本原理是通过将混合物加入适当溶剂中并在高压动力学条件下推进，而溶质会根据其在柱中的溶解度而被分离出来，实现其分离。
当混合物经过分离处理时，每一种溶质会形成一个独立的峰，最终可以根据峰的位置，形状和大小来对混合物中的溶质进行识别和测定。
此外，实现混合物分离和测定所需要的基本组成也是非常重要的。
首先，必须有一个溶剂，用来混合溶质以及推动它们到HPLC系统中。
其次，柱是HPLC系统中的基本元件，由于其表面状态的不同，可以介导溶质的转移。
最后，还必须有一个泵，通过它可以驱动溶液从柱的入口到出口的流动，以推进混合物的分离。
在开始实验测试之前，必须先根据每一种溶质的特性，设计出适当的HPLC系统，才能得到满意的分离效果。
其中，准备柱是必不可少的，而且也是最重要的一步。
柱的特性取决于其黏度、孔径和长度等参数，而且这些参数取决于柱内吸附体的种类、形状和大小。
因此，在确定柱参数之前，必须先研究柱中添加的吸附体。
除了以上介绍的基本组成，HPLC系统中还必须具备多种检测设备，以及一个控制系统和一个数据处理系统，以便对HPLC系统的运行情况进行实时监测，确保实验的结果可靠可信。
基于以上说明，可以看出，高效液相色谱分析法不仅可用于单一物质的分离，也可以用于实现混合物的测定，其基本原理和基本组成也是至关重要的。
高效液相色谱分析法由于其准确性和灵敏度而备受赞誉，它可以用于医药、食品和环境分析以及其他行业的应用，为科学研究和实践发挥着重要的作用。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
分析化学高效液相色谱法
分析化学高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和测定化学物质的重要分析方法，具有高分离效率、高灵敏度、宽线性范围和广泛的应用范围等优点。
下面将从仪器原理、工作原理和应用等方面对HPLC进行详细分析。
一、仪器原理：HPLC仪器主要由溶剂系统、进样器、柱温箱、液相分离柱、检测器和数据处理系统等组成。
1.溶剂系统：通常采用双头柱泵供应稳定的流动相。
溶剂通过比例调节阀混合形成所需的溶剂混合物。
2.进样器：它将少量的样品溶液注入到流动相中，通常使用自动进样器进行样品进样。
3.柱温箱：控制流动相的温度，以提高分离的效果。
柱温一般在室温到高温之间进行控制。
4.液相分离柱：是HPLC的核心部分，其中填充有液相固定相。
根据不同的分析目标和样品性质，可以选择不同类型的液相柱，如反相色谱柱、离子交换柱等。
5.检测器：常见的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、折射率检测器等。
根据不同化学物质的性质和要求，可以选择不同的检测器。
6.数据处理系统：包括记录和处理仪器所得到的信号。
常见的数据处理系统有计算机数据采集系统，可以进行数据的分析和处理，生成相应的色谱图。
二、工作原理：HPLC通过运用固定相与移动相之间的亲疏水性差异来实现化学物质的分离。
样品在液相中与固定相发生相互作用，不同化合物的相互作用程度不同，因此在液相中呈现出不同的流动速度。
根据样品分离的顺序，不同的化合物在一定时间内通过液相分离柱，进而被检测器检测到。
HPLC中的流动相一般由溶剂和缓冲液组成，并通过色谱柱中的固定相将待测试的物质分离开来。
其中，缓冲液（通常称为背后电解质）可以调节流动相的pH值，改变待测试物质的性质，从而影响其分离。
三、应用：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全和生化分析等领域。
1.药物分析：HPLC可以用于药物分析中，以检测药物的含量、纯度和杂质成分。
药物的测定可以通过校准曲线来进行分析。
2.环境检测：HPLC可以用于环境监测中，例如水质分析、大气污染物分析等。
现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)
分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；
《高效液相色谱分析》课件
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱方法及应用课件
七、高分子材料的分析
高分子工业材料及生物高分子分析是近年 来新兴的课题。凝胶色谱是分离分析高分子组 成及鉴定其性能的最好方法。高分子材料中填 充各种助剂、乳化剂、分散剂等物的分离，色 谱技术也独具特点。
①控制高分子产品质量 在生产工艺中，可 利用凝胶色谱测定聚合物小分子杂质。如用 凝胶色谱测定环氧树脂中未聚合的双酚A，用 C18柱分离小分子环氧化合物，小分子聚苯乙 烯或不能成膜的聚脂等，用以鉴定聚合物的 质量。 ②测定聚合物的分子量分布宽度 分子量大 小和分子量分布宽度是衡量聚合物质量的一 种重要指标，用凝胶色谱可以测定。
高效液相色谱法的特点
• 一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装 填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
⑤糖的分析。糖的分析是其它方法较难完成 的。如把糖与硼酸缓冲液预选混合，使生成 糖-硼酸络合离子，再进行分离。可把蔗乳糖、 阿芦糖、果糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、 山梨糖、木糖、葡萄糖等几十种，全部分开。 也可用胺基柱分离各种天然产物中伯糖的各 绷分。
三、天然产物中主要组分的分析
天然物的组分非常复杂，如中草药中各组 分含量多少对药剂作用影响很大。用此技术分 离分析，具有简便、快速的特点。氨基柱能分 离分析天然物中糖的组分。氰基柱能分离中药 紫草及其衍生物的组成。C18柱分离丹参中主 要组分儿茶酚、桂皮中桂皮酸、烟草中的酚类 化合物、麦角或鸦片中各种植物碱，这些都是 近来日益受到重视的结果。
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
精选课件
2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
第四章高效液相色谱分析法
第四章高效液相色谱分析法高效液相色谱（HPLC）是一种现代化的色谱技术，该技术利用高压将溶液推入柱中，然后在固定相上进行分离。
HPLC技术广泛应用于化学、生化、生物医药、环境等领域的分析与研究。
HPLC的分析原理是利用样品中所含化合物与柱填料固定相之间的体积作用力及化学作用力来进行分离。
在HPLC系统中，样品经过样品进样器注入进样回路中，通过高压泵将样品溶液送入柱中，柱中填充有固定相，样品中的成分在固定相表面上进行吸附与解吸，其中一些化合物会更容易与固定相相互作用，因此分离出来。
分离后的化合物通过检测器进行检测和定量。
HPLC技术具有高效、灵敏、精确、稳定等特点。
相比传统色谱技术，HPLC具有较高的分离效率和灵敏度。
其中，分离效率是指单位时间内分离出的化合物的数量，而灵敏度是指仪器能够检测到的最低浓度。
通过调节柱填料、流动相组成和流速，可以实现对复杂样品的高效分离和定量分析。
HPLC技术有多种模式，包括正相色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法、分子筛色谱法等。
其中，反相色谱法是最常用的一种模式。
反相色谱法是指固定相是非极性的，而流动相是极性溶剂的情况下进行的色谱分离。
通过调整流动相的溶剂极性和流速，可以实现对不同极性化合物的分离。
除了分离功能外，HPLC还可以与其他技术联用，如质谱、荧光、紫外-可见光谱等。
这种联用技术结合了不同的分析方法，可以提高分析的特异性和灵敏度。
例如，将质谱与HPLC联用可以对化合物的结构进行确认和鉴定，而将荧光和HPLC联用可以对化合物进行特异性的定量分析。
HPLC技术在各个领域有着广泛的应用。
在化学领域，HPLC可以用来分离和分析复杂化合物，如天然产物的提取和纯化，药物的分析和鉴定等。
在生物医药领域，HPLC可以用来分析药物的含量、纯度和杂质，以及药物代谢产物和血液中的生理活性物质。
在环境领域，HPLC可以用来检测水体、土壤和空气中的有害物质，如重金属、有机污染物和农药残留等。
液相色谱分析条件的选择
在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依 据。常用溶剂的极性大小顺序为： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙 醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳> 二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
当纯溶剂不能满足分离要求时，多采用混合溶剂 或梯度洗脱。
•载体粒度较大时的LC曲线。
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• 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 • 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。分 离过程需要保持恒温。 • 改变淋洗液组成、极性是 改善分离的最直接的因素。
•上图为粒度较大时的LC曲线
•左图为粒度较小时的LC曲线
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2.流速
流速是调整分离度 和出峰时间的重要可 选择参数。
对于正相色谱，二元溶剂的极性参数P' 和组分的k 值存在如下关系：
k 10 2
( P1' P2' ) / 2
k1
式中、分别为初始和调节后二元溶剂的极性参数。k1 、k2为组分相应的容量因子。
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例4-3 在一反相色谱柱上，当流动相为30%甲醇和
70%水(体积比)时，某组分的保留时间为25.6min，死
= 0.75
即调整溶剂比例为75%甲醇和25%水可使该组分的k 值为5。
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溶剂的选择性
溶剂和样品分子间的作 用力用接受质子的能力xe、 给予质子的能力xd和静电力 xn(由偶极矩决定)三种参数 来表征，并以xe、xd和xn构 成一个三角坐标图 。
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低压梯度(内梯度) 低压梯度(内梯度)
一台高压泵, 通过比例调节阀, 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。 极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。
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第二节 主要分离类型
二、液-液分配与化学键合相色谱 液分配与化学键合相色谱
）、液 （一）、液-液分配色谱
与气相色 谱中气--液 谱中气 液 色谱比较？ 色谱比较？
固定相与流动相均为液体（互不相溶）。 固定相与流动相均为液体（互不相溶）。 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。 K不仅与固定相的种 不仅与固定相的种 类有关， 类有关，也与流动相 的种类有关。 的种类有关。
固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。 固定相 固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。 固体吸附剂 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂。 各种不同极性的一元或多元溶剂 分离机理：流动相中的溶质分子(X)与溶剂分子 分离机理 ： 流动相中的溶质分子 与溶剂分子 (S)在固体吸附剂上竞争吸附的结果。 在固体吸附剂上竞争吸附的结果。 在固体吸附剂上竞争吸附的结果
没食子酸
3,4-二羟基苯甲酸 二羟基苯甲酸
固定相: 非极性; 流动相: 极性 固定相 非极性 流动相 组分极性: 二羟基苯甲酸<没食子酸 组分极性 3,4-二羟基苯甲酸 没食子酸 二羟基苯甲酸
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第二节 主要分离类型
三、离子交换色谱
固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。 固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。 键合基团 担 体 苯乙烯-二 苯乙烯 二 乙烯苯共 聚物微球 键合 阳离子： 阳离子： －SO3H(强) 强 －CO2H(弱) 弱 阴离子： 阴离子： －N+R3(强) 强 －NH2 (弱) 弱
对多环芳烃 维生素B、黄曲霉素、 对多环芳烃，维生素 、黄曲霉素、卟啉类化合 农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。 物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
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第一节 高效液相色谱仪
特点： 特点：
高灵敏度； 高灵敏度； 高选择性； 高选择性； 可用于梯度洗脱。 可用于梯度洗脱。
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第二节 主要分离类型
X M + nS S = X S + nS M
c( X s )[c(S M )] K= n c( X M )[c(S s )]
n
下标M、 分别代表流动相和固定相 分别代表流动相和固定相， 代表被吸附的 下标 、 s分别代表流动相和固定相 ， n代表被吸附的 溶剂分子数；K代表吸附平衡常数。 代表吸附平衡常数。 溶剂分子数； 代表吸附平衡常数
氨丙基 氰乙基、 氰乙基、醚和醇等 极性基团
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第二节 主要分离类型 键合色谱柱、 例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离 键合色谱柱 甲醇以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。 以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。
保留时间： 保留时间：
HO
COOH
COOH
<
OH OH
OH OH
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第二节 主要分离类型 1. 键合固定相制备 硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 键合相 非极性
使用pH范围： 使用 范围： 2-8 范围
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第二节 主要分离类型 2. 键合固定相类型
反相柱
类 型
正相柱
不同碳原子数的 烷烃（ 和 烷烃（C8和C18）、 ）、 苯基等疏水基团
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第一节 高效液相色谱仪
缺点： 缺点：
灵敏度低； 灵敏度低； 对温度敏感； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱。 不能用于梯度洗脱。
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第一节 高效液相色谱仪 ）、荧光检测器 专用型检测器 （三）、荧光检测器—专用型检测器 基本原理：在一定的条件下， 基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动 相中的组分的浓度成之比。 相中的组分的浓度成之比。
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第三节 液相色谱的固定相与流动相
一、固定相 二、流动相
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第三节 液相色谱的固定相与流动相
一、固定相 分配色谱固定相 液-固吸附色谱固定相 固吸附色谱固定相 固定相 离子交换色谱固定相 空间排阻色谱固定相 手性固定相
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第三节 液相色谱的固定相与流动相 ）、分配色谱固定相 （一）、分配色谱固定相 全多孔型固定相
试样组分与交换基 团间的作用力的大小决 定色谱的保留行为。 定色谱的保留行为。
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第二节 主要分离类型
阳离子交换： 阳离子交换：R—SO3H + M+ = R—SO3 M + H+ 阴离子交换： 阴离子交换：R—NR4OH + X- = R—NR4 X + OH组分与离子交换剂之间作用力的大小与离子半径、 组分与离子交换剂之间作用力的大小与离子半径、 离子半径 电荷、存在形式等有关。作用大，保留时间长。 电荷、存在形式等有关。作用大，保留时间长。 等有关 应用：离子及可离解的化合物， 应用：离子及可离解的化合物， 氨基酸、核酸、蛋白质等。 氨基酸、核酸、蛋白质等。
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第二节 主要分离类型 流动相： 流动相 阳离子交换树脂固定相，采用酸性水溶液； 阳离子交换树脂固定相，采用酸性水溶液； 阴离子交换树脂固定相，采用碱性水溶液。 阴离子交换树脂固定相，采用碱性水溶液。
基本原理： 基本原理： 试样组分在固定相上发生的反复离子交换反 应 ， 依据组分与离子交换剂之间亲和力的不同而 分离。 分离。
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改变流动相的组成来 改善分离效果。 改善分离效果。
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第二节 主要分离类型 固定相极性>流动相极性 固定相极性 流动相极性 正相分配色谱 （正相柱） 正相柱） 固定相极性<流动相极性 固定相极性 流动相极性 反相分配色谱 反相柱） （反相柱）
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组分极性越大， 组分极性越大，保留 时间越长； 时间越长；使用极性 化合物的分离。 化合物的分离。
组分极性越小， 组分极性越小，保留 时间越长；适用非极 时间越长； 性化合物的分离。 性化合物的分离。
第二节 主要分离类型 ）、化学键合固定相色谱 （二）、化学键合固定相色谱 将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 担体）表面的游离羟基上。 （担体）表面的游离羟基上。
特点
固定相非常稳定，在使用中不易流失。 固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于 可将各种极性的官能团键合到载体表面， 可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它 适用于种类繁多样品的分离。 适用于种类繁多样品的分离。
多孔球体(氧化铝 、 硅藻土等) 多孔球体 氧化铝、 硅藻土等 氧化铝 +固定液 固定液 早期固定相 已不多见
分类
表面多孔型固定相
微珠担体(玻璃微球 固定液 微珠担体 玻璃微球) +固定液 玻璃微球
化学键合固定相
硅胶表面键合有机分子
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第三节 液相色谱的固定相与流动相 化学键合固定相 利用硅胶表面存在的硅羟基， 利用硅胶表面存在的硅羟基 ， 通过化学反应将 有机分子键合到硅胶表面。 有机分子键合到硅胶表面。 A. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C 硅氧碳键型： B. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： C. 硅碳键型： 硅碳键型： D. 硅氮键型： 硅氮键型：
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第一节 高效液相色谱仪
三、 梯度淋洗装置
在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、 在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、 极性来改善分离和调节出峰时间。 极性来改善分离和调节出峰时间。
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第一节 高效液相色谱仪
高压梯度(外梯度 高压梯度 外梯度) 外梯度
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第二节 主要分离类型 阳离子交换： 阳离子交换：R—SO3H + M+ = R—SO3 M + H+ 阴离子交换： 阴离子交换：R—NR4OH + X- = R—NR4 X + OH一般形式： 一般形式： R—A + B = R—B + A
KBA
仪器分析
c(R − B )c( A) = c(R − A)c(B )
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第一节 高效液相色谱仪
六、 液相色谱检测器
紫外检测器 示差折光检测器
类 型
荧光检测器 电化学检测器 电导检测器
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第一节 高效液相色谱仪 ）、紫外检测器 应用最广泛的检测器 （一）、紫外检测器—应用最广泛的检测器 基本原理： 基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择 性的吸收， 性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系 符合郎伯-比耳定律。 符合郎伯-比耳定律。 优点： 优点：
第四章 高效液相色谱分析法 第一节 高效液相色谱仪 第二节 主要分离类型 第三节 液相色谱的固定相与流动相 第四节 影响分离的因素与分离类型的选择
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第一节 高效液相色谱仪
一、 高效液相色谱仪结构流程
二、 高压输液系统 三、 梯度淋洗装置 四、 进样系统 五、 分离系统 六、 液相色谱检测器