第四章高效液相色谱..
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薄壳型填料，柱效 仅每米1000~3000 塔板数 5~10μm球型和无定 型微粒硅胶，每米 5~6万理论塔板数
键合相色谱、离子色谱、疏水色谱、亲和色谱、手性色 谱、脂质体色谱、生物膜色谱、整体柱色谱、微径柱和 毛细管柱色谱及液相色谱-质谱联用等 http://v.qq.com/page/q/b/z/q0166w2f9bz.html
3. 离子对色谱(Ion Pair Chromatography)
在色谱体系中引入一种与样品溶质离子电荷相反的离子对 试剂，通常称为对离子或反离子(counterion)，它与溶质离子形 成离子对，从而改变溶质在两相中的分配，使离子性溶质的保 留行为和分离选择性发生显著变化。 常用的离子对试剂有提供阴离子的C4 - C8烷基磺酸盐、烷 基硫酸盐、羧酸盐、萘磺酸盐、高氯酸盐等;提供阳离子的季 铵盐和烃基胺，如四丁基铵盐、十六烷基三甲基铵盐、三乙胺 等。 将离子对试剂涂渍在液液色谱的硅胶载体上或溶于流动相 中，可构成液液离子对分配色谱，主要用于强极性的有机酸、 有机碱的分离分析。 在反相色谱中，离子对试剂加入缓冲液和甲醇、乙腈等极 性有机溶剂的流动相构成反相离子对色谱。
b. 现在采用Φ〈10 μm全多孔 型担体，它是由nm级的硅胶微 粒堆积而成Φ为5 μm或稍大的全 多孔小球。优点：颗粒小而均匀， 传质快（距离短），柱效高。
2018/10/15
担体
(2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 它是直径为 30 ～ 40 μ m 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ， 表层上附有一层厚度约为 1～ 2μ m 多孔表面 ( 多孔硅 胶)。 优点：孔穴浅（固定相仅为 表面的一薄层），传质速度 快,易于填充均匀,柱效高。 缺点：柱子容量低、需要配 用高灵敏检测器。 这种担体目前应用较为普 遍。 2．固定液 液—液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要 互不相容。在液-液色谱中常用的固定相也只有极性不同的几 种，如β，β'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。
第 4章
高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
第一节 高效液相色谱法的特点 高压、高速的现代高效液相色谱wenku.baidu.com于1967年面世， 导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。
5.离子色谱(Ion Chromatography，IC)
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离 方法。离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。 例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用 电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相 的高背景电导信号掩没而无法检测。 为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同 时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分 离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的 离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具 有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而 用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术 称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑 制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交 换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生 两个重要反应：
基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性 操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力 适用范围广
第二节、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
一、液相色谱速率理论—影响色谱峰扩展因素
2018/10/15
提高柱效的途径，也就是如何提高液相色 谱的分离效率：
1、吸附色谱（adsorption chromatography）
原理：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用， 且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生 保留和实现分离。
固定相： 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性 炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱 也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。
第四节 液相色谱法固定相
一、液—液色谱法及离子对色谱法固定相 1．担体 (1) 全多孔型担体： a. HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体， 如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的Φ100μm全多孔 型担体。缺点：填料的不规则性和较宽的粒度范围会导 致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在 “裂隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分 子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。
IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固 定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可 以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺 盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作 用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而 被相互分离。
此法是利用离子交换原理和液相色 谱技术的结合来测定溶液中阳离子和 阴离子的一种分离分析方法。凡在溶 液中能够电离的物质，通常都可用离 子交换色谱法进行分离。它不仅适用 无机离子混合物的分离，亦可用于有 机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋 白质等生物大分子。因此，应用范围 较广。
4、离子交换色谱 （ion exchange chromatography, IEC） 原理： 用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动 相。 以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相，分离阴离子 (如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入 色谱柱时，发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的， 的逆过程)：
2018/10/15
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液相色谱法固定相
二、液－固吸附色谱法固定相
采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等， 仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。
三、离子交换色谱法固定相
薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体，在它的 表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。 2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基团键合在 惰性担体表面。
由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为 电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又 将样品阳离子 M+转变成相应的碱，由于OH -离子的淌度 为 Cl - 离子的 2 ． 6 倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏 度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型 离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而 且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来， Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导 率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸 盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子 色谱或单柱离子色谱。
1.
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液相色谱法固定相
四、排阻色谱法固定相
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到 流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方 法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶 解到流动相中去了。
键合固定相
OH OH + C18H37SiCl3 OH
O
O
O
Si
C18H37
非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、 苯 基 等 非 极 性 有 机 分 子 。 如 最 常 用 的 ODS （ Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18 柱就是最典型的代表，其 极性很小。 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二 醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。
流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶 剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、 二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
应用： 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是 最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、 芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。
2、分配色谱
原理： 主要基于样品分子在流动相和固定相间的 溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱 分离模式。 研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。 可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前者是早 期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多 孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相， 即化学键合固定相至载体或基质表面。 化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱 类型。
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液—液色谱法及离子对色谱法固定相
3．化学键合固定相： 即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担 体表面。根据在硅胶表面 (具有≡Si－OH基团) 的化学反 应不同，键合固定相可分为： 硅氧碳键型(≡ Si－O－C ): 硅氧硅碳键型(≡Si－O－Si－C):稳定，耐水、耐光、耐有 机溶剂，应用最广。 硅碳键型(≡Si－C): 和硅氮键型（≡Si－N):
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液—液色谱法及离子对色谱法固定相
化学键合固定相具有如下一些特点： ⅰ . 表面没有坑，比一般液体固定相传质快得多； ⅱ . 无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； ⅲ . 可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种 色谱类型及样品的分析； ⅳ . 有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收 集。
离子色谱具有以下优点： （1）分析速度快 可在数分钟内完成一 个试样的分析； （2）分离能力高 在适宜的条件下，可使 常见的各种阴离子混合物 分离；例：使用双柱法， 在十几分钟内，可使七种 阴离子完全分离。 （3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）仪器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蚀
2018/10/15
正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相 所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、 氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属 正相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色 谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定 相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是 甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。 ODS（Octa Decyltrichloro Silane)
减 小填料粒度；提高柱内填料装填的均 匀性来以加快传质速率。
对于液相色谱而言，除了上述的影响因素，还有柱 外展宽的影响，所谓柱外展宽是指色谱柱外各种因 素引起的峰扩展。
第三节、高效液相色谱法的主要分离类型及其分离原 理
1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子对色谱法 （ion pair Chromatography） 4. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 5. 离子色谱法 (ion Chromatography ) 6. 空间排阻色谱(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的 主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。
6、空间排阻色谱
（又称凝胶色谱和分子筛色谱）
以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径（x nm~x00 nm）的多聚体的通称。如葡聚 糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬 质凝胶。 机理：当试样进入凝胶色谱柱时，尺寸过大的分子 完全不能渗透到胶孔中去而受到排阻，沿胶粒之间的间隙直 接流出色谱柱，产生一个色谱峰；尺寸过小的分子可完全渗 透到胶孔中去，流动速度慢，最后流出色谱柱，产生一个色 谱峰；中等尺寸的分子 ，以其大小的不同，可渗透到某些 孔穴而不能进入另一些空穴，流出速度取决于分子尺寸的大 小, 按分子尺寸由大到小的顺序先后流出色谱柱，从而实现 分离。 应用：适合分离分子量大的化合物（100~800,000)， 只要相对分子量相差大于10%。
键合相色谱、离子色谱、疏水色谱、亲和色谱、手性色 谱、脂质体色谱、生物膜色谱、整体柱色谱、微径柱和 毛细管柱色谱及液相色谱-质谱联用等 http://v.qq.com/page/q/b/z/q0166w2f9bz.html
3. 离子对色谱(Ion Pair Chromatography)
在色谱体系中引入一种与样品溶质离子电荷相反的离子对 试剂，通常称为对离子或反离子(counterion)，它与溶质离子形 成离子对，从而改变溶质在两相中的分配，使离子性溶质的保 留行为和分离选择性发生显著变化。 常用的离子对试剂有提供阴离子的C4 - C8烷基磺酸盐、烷 基硫酸盐、羧酸盐、萘磺酸盐、高氯酸盐等;提供阳离子的季 铵盐和烃基胺，如四丁基铵盐、十六烷基三甲基铵盐、三乙胺 等。 将离子对试剂涂渍在液液色谱的硅胶载体上或溶于流动相 中，可构成液液离子对分配色谱，主要用于强极性的有机酸、 有机碱的分离分析。 在反相色谱中，离子对试剂加入缓冲液和甲醇、乙腈等极 性有机溶剂的流动相构成反相离子对色谱。
b. 现在采用Φ〈10 μm全多孔 型担体，它是由nm级的硅胶微 粒堆积而成Φ为5 μm或稍大的全 多孔小球。优点：颗粒小而均匀， 传质快（距离短），柱效高。
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担体
(2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 它是直径为 30 ～ 40 μ m 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ， 表层上附有一层厚度约为 1～ 2μ m 多孔表面 ( 多孔硅 胶)。 优点：孔穴浅（固定相仅为 表面的一薄层），传质速度 快,易于填充均匀,柱效高。 缺点：柱子容量低、需要配 用高灵敏检测器。 这种担体目前应用较为普 遍。 2．固定液 液—液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要 互不相容。在液-液色谱中常用的固定相也只有极性不同的几 种，如β，β'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。
第 4章
高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
第一节 高效液相色谱法的特点 高压、高速的现代高效液相色谱wenku.baidu.com于1967年面世， 导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。
5.离子色谱(Ion Chromatography，IC)
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离 方法。离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。 例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用 电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相 的高背景电导信号掩没而无法检测。 为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同 时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分 离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的 离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具 有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而 用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术 称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑 制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交 换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生 两个重要反应：
基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性 操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力 适用范围广
第二节、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
一、液相色谱速率理论—影响色谱峰扩展因素
2018/10/15
提高柱效的途径，也就是如何提高液相色 谱的分离效率：
1、吸附色谱（adsorption chromatography）
原理：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用， 且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生 保留和实现分离。
固定相： 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性 炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱 也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。
第四节 液相色谱法固定相
一、液—液色谱法及离子对色谱法固定相 1．担体 (1) 全多孔型担体： a. HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体， 如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的Φ100μm全多孔 型担体。缺点：填料的不规则性和较宽的粒度范围会导 致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在 “裂隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分 子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。
IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固 定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可 以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺 盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作 用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而 被相互分离。
此法是利用离子交换原理和液相色 谱技术的结合来测定溶液中阳离子和 阴离子的一种分离分析方法。凡在溶 液中能够电离的物质，通常都可用离 子交换色谱法进行分离。它不仅适用 无机离子混合物的分离，亦可用于有 机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋 白质等生物大分子。因此，应用范围 较广。
4、离子交换色谱 （ion exchange chromatography, IEC） 原理： 用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动 相。 以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相，分离阴离子 (如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入 色谱柱时，发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的， 的逆过程)：
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液相色谱法固定相
二、液－固吸附色谱法固定相
采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等， 仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。
三、离子交换色谱法固定相
薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体，在它的 表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。 2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基团键合在 惰性担体表面。
由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为 电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又 将样品阳离子 M+转变成相应的碱，由于OH -离子的淌度 为 Cl - 离子的 2 ． 6 倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏 度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型 离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而 且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来， Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导 率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸 盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子 色谱或单柱离子色谱。
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液相色谱法固定相
四、排阻色谱法固定相
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到 流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方 法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶 解到流动相中去了。
键合固定相
OH OH + C18H37SiCl3 OH
O
O
O
Si
C18H37
非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、 苯 基 等 非 极 性 有 机 分 子 。 如 最 常 用 的 ODS （ Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18 柱就是最典型的代表，其 极性很小。 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二 醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。
流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶 剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、 二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
应用： 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是 最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、 芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。
2、分配色谱
原理： 主要基于样品分子在流动相和固定相间的 溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱 分离模式。 研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。 可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前者是早 期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多 孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相， 即化学键合固定相至载体或基质表面。 化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱 类型。
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液—液色谱法及离子对色谱法固定相
3．化学键合固定相： 即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担 体表面。根据在硅胶表面 (具有≡Si－OH基团) 的化学反 应不同，键合固定相可分为： 硅氧碳键型(≡ Si－O－C ): 硅氧硅碳键型(≡Si－O－Si－C):稳定，耐水、耐光、耐有 机溶剂，应用最广。 硅碳键型(≡Si－C): 和硅氮键型（≡Si－N):
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液—液色谱法及离子对色谱法固定相
化学键合固定相具有如下一些特点： ⅰ . 表面没有坑，比一般液体固定相传质快得多； ⅱ . 无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； ⅲ . 可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种 色谱类型及样品的分析； ⅳ . 有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收 集。
离子色谱具有以下优点： （1）分析速度快 可在数分钟内完成一 个试样的分析； （2）分离能力高 在适宜的条件下，可使 常见的各种阴离子混合物 分离；例：使用双柱法， 在十几分钟内，可使七种 阴离子完全分离。 （3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）仪器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蚀
2018/10/15
正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相 所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、 氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属 正相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色 谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定 相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是 甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。 ODS（Octa Decyltrichloro Silane)
减 小填料粒度；提高柱内填料装填的均 匀性来以加快传质速率。
对于液相色谱而言，除了上述的影响因素，还有柱 外展宽的影响，所谓柱外展宽是指色谱柱外各种因 素引起的峰扩展。
第三节、高效液相色谱法的主要分离类型及其分离原 理
1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子对色谱法 （ion pair Chromatography） 4. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 5. 离子色谱法 (ion Chromatography ) 6. 空间排阻色谱(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的 主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。
6、空间排阻色谱
（又称凝胶色谱和分子筛色谱）
以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径（x nm~x00 nm）的多聚体的通称。如葡聚 糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬 质凝胶。 机理：当试样进入凝胶色谱柱时，尺寸过大的分子 完全不能渗透到胶孔中去而受到排阻，沿胶粒之间的间隙直 接流出色谱柱，产生一个色谱峰；尺寸过小的分子可完全渗 透到胶孔中去，流动速度慢，最后流出色谱柱，产生一个色 谱峰；中等尺寸的分子 ，以其大小的不同，可渗透到某些 孔穴而不能进入另一些空穴，流出速度取决于分子尺寸的大 小, 按分子尺寸由大到小的顺序先后流出色谱柱，从而实现 分离。 应用：适合分离分子量大的化合物（100~800,000)， 只要相对分子量相差大于10%。