第四章高效液相色谱..
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
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▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
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色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
高效液相色谱法的简介..
3．操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
二. 高效液相色谱法的特点和应用
“三高” “一快” “一广” 高压 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
三.各类高效液相色谱法
液-固吸附色谱 液-液分配色谱
3.1 液-固吸附色谱法
固定相为固体吸附剂,流动相为液体。
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂
分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异，即物质吸附作用的不同来分离的。
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性
3.2 液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相 ：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。正相 与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失较多，较少采 用；
离子交换色谱
离子色谱
排阻色谱
亲和色谱
高效液相色谱固定相和流动相 （－）固定相
1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两 大类：
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受 7.O×108 ～ 1.O×109Pa 的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官 能团，就是键合固定相。 硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基 交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
高效液相色谱法分析食品中的残留农药
高效液相色谱法分析食品中的残留农药第一章：引言在食品安全问题日益引起人们的关注的背景下，残留农药成为一个备受关注的话题。
近年来，残留农药对食品安全和人体健康造成了一定的威胁。
因此，分析食品中的残留农药的方法和技术变得至关重要。
本文将介绍一种常用的分析方法——高效液相色谱法（HPLC），并探讨其在食品中检测残留农药方面的应用。
第二章：高效液相色谱法概述2.1 高效液相色谱法原理高效液相色谱法是一种基于分离技术的分析方法，其原理是将待分析的混合物溶解在溶剂中，并通过高压将其进样到色谱柱中，然后使用流动相沿着色谱柱进行分离，最后通过检测器进行定量分析。
高效液相色谱法具有分辨率高、灵敏度好、选择性强等特点，被广泛应用于各个领域，特别是食品检测领域。
2.2 高效液相色谱法的仪器设备高效液相色谱法依赖于多种仪器设备，包括进样器、色谱柱、流动相泵和检测器等。
其中，进样器用于将待分析样品引入色谱柱，色谱柱用于样品的分离，流动相泵用于提供流动相进行分离过程，检测器则用于定量分析分离后的化合物。
第三章：高效液相色谱法在食品中的应用3.1 高效液相色谱法分析食品中的残留农药的流程在分析食品中的残留农药时，首先需采集样品并根据需要进行前处理以去除可能的干扰物，然后将样品溶解于适当的溶剂中，通过进样器将样品引入色谱柱进行分离，最后通过检测器进行定量分析。
3.2 高效液相色谱法在不同食品中的应用高效液相色谱法广泛应用于各类食品中残留农药的分析。
例如，在蔬菜中，可以使用高效液相色谱法对杀菌剂、除草剂等农药进行分析。
在水果中，可以使用高效液相色谱法对杀虫剂、杀菌剂等农药进行分析。
此外，高效液相色谱法还可以应用于粮食、肉类等食品中残留农药的分析。
3.3 高效液相色谱法的优势和不足高效液相色谱法在食品中分析残留农药方面有许多优势。
其具有分离效果好、灵敏度高、重现性好等优点。
然而，高效液相色谱法也存在一些不足之处，如需要专业的仪器设备和技术支持，分析周期长等。
高效液相色谱室规章制度
高效液相色谱室规章制度第一章总则第一条为了规范液相色谱室的管理，提高实验室工作效率和安全性，保障实验室仪器设备的正常运行，特制定本规章制度。
第二条本规章制度适用于实验室的液相色谱室管理工作。
第三条实验室负责人应当严格遵守本规章制度，对实验室的检测报告和数据负责。
第四条实验室液相色谱室的使用人员应遵循诚实守信、严格遵守规章制度、尊重实验室仪器设备和工作人员等基本原则。
第五条实验室应当定期评估并更新规章制度，使其适应实验室管理和技术改进的需求。
第二章液相色谱室的管理第六条实验室液相色谱室的管理应当建立科学合理的管理制度，明确管理责任、权限和流程，保证实验室工作的顺利进行。
第七条实验室液相色谱室的管理人员应当具备相关专业知识和技能，具有一定管理经验和能力。
第八条实验室液相色谱室的管理人员应当制定详细的工作计划和实施方案，合理安排仪器设备的使用和维护。
第九条实验室应当建立严格的实验室进出制度，严格控制外来人员和物品进入实验室。
第十条实验室应当建立仪器设备借用制度，明确借用程序及责任，保障仪器设备的安全和正常使用。
第三章液相色谱仪器设备的管理第十一条实验室液相色谱仪器设备的管理应当建立详细的档案，包括设备编号、型号、进货日期、制造厂家、安装地点等信息。
第十二条实验室液相色谱仪器设备应当定期进行检查和保养，确保其正常运行和准确测量。
第十三条实验室液相色谱仪器设备使用人员应当具备相关专业知识和操作技能，严格按照操作规程操作仪器设备。
第十四条实验室应当建立仪器设备使用记录，详细记录仪器设备的使用情况和维护情况，及时发现和解决问题。
第四章实验室安全管理第十五条实验室应当制定详细的实验室安全管理制度，建立完善的安全管理体系，确保实验室工作的安全性。
第十六条实验室应当定期组织安全培训，提高实验室工作人员的安全意识和应急处置能力。
第十七条实验室应当建立火灾预防和防护措施，定期检查消防设施和器材，确保实验室的消防安全。
第十八条实验室应当建立化学品管理制度，规范化学品的采购、储存、使用和废弃处理，确保化学品的安全使用。
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
14
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
16
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
高效液相色谱技术在食品安全检测中的应用
高效液相色谱技术在食品安全检测中的应用第一章：引言随着社会经济的不断发展，人们对食品质量和安全的关注日益增加。
尤其是近年来，食品安全问题时有发生，引起广泛关注。
因此，为了确保人们的身体健康和生活质量，需要对食品进行严格的安全检测。
而高效液相色谱技术因其具有高效、准确、快捷等诸多优点，在食品安全检测中得到广泛应用。
第二章：高效液相色谱技术概述高效液相色谱（HPLC）是由液相为驱动力的一种分析技术。
通过将样品在液态移动相中进行分离，然后用检测器检测每个分离出来的物质的特定信号，最终得到色谱峰。
HPLC是一种灵活性强、可靠性高、分离效率高、分析速度快、灵敏度高的分离技术，它在食品安全领域应用广泛。
第三章：高效液相色谱在食品安全检测中的应用3.1 食品添加剂检测食品添加剂是食品加工过程中添加的各种化学物质，用于增加食品的色、香、味、营养价值和保质期等。
但是，有些食品添加剂可能对人体健康有害。
因此，如何检测食品添加剂成为食品安全领域的重要问题。
高效液相色谱技术在食品添加剂检测中有着很广泛的应用。
例如，利用HPLC可以对食品中的亚硝酸盐、硫代硫酸盐等添加剂进行检测。
3.2 食品中的农药残留农药是农业生产中一个重要的辅助决策因素，但是如果没有恰当地控制其使用，就可能对人造成危害。
因此，对食品中的农药残留情况进行监测和控制是很重要的。
高效液相色谱技术具有灵敏度高、准确性高、分析速度快等特点，可以对食品中的农药残留情况进行精确的检测，如对克百威、毒死蜱、硫磺磷等常见农药进行检测。
3.3 食品中的罕见氨基酸检测高效液相色谱技术作为营养学、化学与生物学等学科的重要分析手段，在食品科学中也被广泛地应用。
在检测食品中罕见氨基酸方面小分子双酰胺（NBD-F）标记和高效液相色谱（HPLC）测定法对于检测食品中的氨基酸具有重要意义第四章：高效液相色谱技术在食品安全领域的优势高效液相色谱技术在食品安全检测中具有以下几个优势：4.1 灵敏度高高效液相色谱技术不仅可以检测低浓度的物质，而且还可以提高精确度。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
高效液相色谱方法
经典的LC色谱（柱色谱）
经典LC特点：仅做为一种分离手段 （1）柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 （2）常压输送流动相 （3） 柱效低（H↑，n↓） （4）分析周期长 （5），仅靠肉眼观测，且无法在线检测
HPLC的特点
HPLC：分离和分析 （1）柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆 装柱） （2）高压输送流动相 （3）柱效高（H↓，n↑） （4）分析时间大大缩短 （5）靠仪器在线检测
下列优良常规操作能够最大限度降低 维修费用：
• 使用HPLC级试剂和流动相 • 清洁的仪器、流动相和样品，如果必要，进行 过滤 • 保证溶剂的相溶性 • 如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染 • 对仪器的使用、维护和保养进行记录
高效液相色谱方法及应用
• • • • 液相色谱的发展史 液相色谱的基本概念 高效液相色谱的具体操作（Aglient1100） 本实验室应用HPLC的实验总结
历史回顾
• 1906年，俄国植物学家Tswett（茨维特）用碳酸钙作为 吸附剂，分离干燥叶子的石油醚萃取物，发现三种颜 色六条色带，他把这种色带称为“色谱”；属于液固 色谱。 • 1940年，Martin和Synge提出了液液分配色谱；1941年 提出了气相色谱可能性； 1949年，Macllean制作薄层 色谱板 • 1952年，Martin和Synge发展了气相色谱，并获得诺贝 尔奖。 • 60年代末，出现商业高效液相色谱（HPLC),但是由于 泵、检测器的发展滞后，使得HPLC在80年代以后才得 以迅速发展。
HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
液相色谱
b. 光电二极管阵列检测器photo－diode－array
（PDAD，PDA, DAD） 是单色光，而是一段紫外波长上的光。
detector
紫外检测器的重要进展；钨灯和氘灯组合光源，进入检测池的不
光电二极管阵列检测器
c.
示差折光检测器
通用型 浓度型 非破坏型
（ Differential Refractive Index Detector）
The Source of Health
f. 电导检测器（conductivity detector, CD）
原理： 基于离子性物质的溶液具有导电性，其 电导率与离子的性质和浓度相关。 电导检测器 是离子色谱中必备的检测器。
4.3 液相色谱的流动相和固定相
1、流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
①吹氦气脱气法 (如：右图) ②加热回流法 ③抽真空脱气法 ④超声波脱气法 以上方法均为离线脱气，随溶剂存放时间延 长又会有空气进入溶剂。。 ⑤在线真空脱气法 将真空脱气装置串接到贮液罐 与高压泵之间，实现溶剂在进入高压泵之前的连 续脱气。脱气效果最优。
3）高压输液泵 pumps
压力：150～350×105 Pa
2）键合固定相 （为什么要键合？）
采用硅胶表面键合技术, 对硅胶微粒表面进行修
饰---硅烷化, 使得硅胶表面带有不同的功能团, 以适
应不同的分离需要。目前在色谱填料中, 键合相约占 78%(其中C18占反相色谱的72%), 硅胶约占10%。
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
精选课件
2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
高效液相色谱的基本原理
第二章 仪器装置
液相色谱仪可分为四大系统：
泵系统 进样系统 分离系统 检测系统
§2－1 泵系统
作用：向色谱柱输送一个连续、恒定的移 动相。
一、对泵系统的要求 1.使用方便（易调节流量、过压保护等） 2.更换洗脱液容易、死体积小 3.有最大工作压力 4.一定流量范围（0.1~10ml/min) 5.流量稳定性好 6.流量精度高
于世林编著)
第一章、高效液相色谱的基本原理
§1-1 概述 一、发展历史 1903年提出、1969～1970年开始发展 流动相－－液体 基本原理：在经典液相色谱基础上，引入
气相色谱理论 技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器 实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化
工作原理：
通过高压泵，连续地将流动相按 一定流速流过柱子；通过进样器， 注入样品混合物。由于混合物中各 组分性质不同，因而它们在柱内移 动速度不同而逐渐分离。通过检测 器检测，得到组分的电信号并进行 放大；记录仪将放大的电信号以图 形形式记录下来。
高效液相色谱法特点：
1.高压：一般：150～300kg/cm2 甚至：500kg/cm2
2.高速：两相间交换：千分之几秒 分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟)
3 高效：气相：2000塔板/米 液相：5000塔板/米
4.高灵敏度：紫外检测器：10－9g数量级 荧光检测器：10－11g(百万分之几） 试样量小（几微升）
泵系统
泵系统发展趋势
①高效：填料颗粒↓→分离效率↑→ 柱压降↑→泵的工作压力↑
ⅱ流动相作用：气相：运载样品，不影响色谱分离 液相：运载样品，参与、影响色谱分离， 且起主要作用。
ⅲ分析样品：气相：破坏样品，不能回收。 液相：不破坏样品，能回收。
实验四 高效液相色谱法测定水体中的苯酚及α-萘酚
高效液相色谱法测定水体中的苯酚和α-萘酚一、实验目的1、了解色谱法的分离原理，初步学会使用高效液相色谱仪；2、利用高效液相色谱仪分离测定水体中的苯酚及α-萘酚。
二、实验原理1、色谱法的分离原理溶于流动相中的各待测组分经过色谱柱固定相时，由于各组分与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸收、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，达到分离的目的，又称色层法、层析法。
2、高效液相色谱仪使用原理高效液相色谱仪由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成四个系统即高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
正是根据物质的定性与定量关系，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。
3、苯酚及α-萘酚的分离原理及标准溶液准备对于一些组分比较简单的已知范围的混合物，或无已知物的情况下，可以利用保留值定性。
保留值的大小取决于分配系数之比，即与组分的性质、固定液的性质及柱温有关，与固定液的用量、柱长、流速及填充情况无关。
在一定操作条件下，用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积或峰高对对照品的量（或浓度）做校正曲线，求回归方程，然后在相同条件下分析试样，计算含量，这种方法称为校正曲线法。
通常截距近似为零，若截距较大，说明存在一定的系统误差。
本实验，苯酚的波长为270nm，α-萘酚的波长为295nm。
使得两种物质的吸收峰达最大值，最终选定在254nm条件下。
分别配置单样和混合液浓度为100mg/L、80mg/L、60mg/L、40 mg/L、20mg/L标准溶液，分别进样，记录保留时间和出峰面积，用于定性分析。
液相色谱分析条件的选择
在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依 据。常用溶剂的极性大小顺序为： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙 醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳> 二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
当纯溶剂不能满足分离要求时，多采用混合溶剂 或梯度洗脱。
•载体粒度较大时的LC曲线。
13:47:40
• 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 • 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。分 离过程需要保持恒温。 • 改变淋洗液组成、极性是 改善分离的最直接的因素。
•上图为粒度较大时的LC曲线
•左图为粒度较小时的LC曲线
13:47:40
2.流速
流速是调整分离度 和出峰时间的重要可 选择参数。
对于正相色谱，二元溶剂的极性参数P' 和组分的k 值存在如下关系：
k 10 2
( P1' P2' ) / 2
k1
式中、分别为初始和调节后二元溶剂的极性参数。k1 、k2为组分相应的容量因子。
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例4-3 在一反相色谱柱上，当流动相为30%甲醇和
70%水(体积比)时，某组分的保留时间为25.6min，死
= 0.75
即调整溶剂比例为75%甲醇和25%水可使该组分的k 值为5。
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溶剂的选择性
溶剂和样品分子间的作 用力用接受质子的能力xe、 给予质子的能力xd和静电力 xn(由偶极矩决定)三种参数 来表征，并以xe、xd和xn构 成一个三角坐标图 。
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2018/10/15
液相色谱法固定相
四、排阻色谱法固定相
2018/10/15
2018/10/15
液相色谱法固定相
二、液－固吸附色谱法固定相
采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等， 仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。
三、离子交换色谱法固定相
薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体，在它的 表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。 2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基团键合在 惰性担体表面。
IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固 定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可 以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺 盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作 用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而 被相互分离。
此法是利用离子交换原理和液相色 谱技术的结合来测定溶液中阳离子和 阴离子的一种分离分析方法。凡在溶 液中能够电离的物质，通常都可用离 子交换色谱法进行分离。它不仅适用 无机离子混合物的分离，亦可用于有 机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋 白质等生物大分子。因此，应用范围 较广。
1、吸附色谱（adsorption chromatography）
原理：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用， 且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生 保留和实现分离。
固定相： 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性 炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附—液色谱法及离子对色谱法固定相
化学键合固定相具有如下一些特点： ⅰ . 表面没有坑，比一般液体固定相传质快得多； ⅱ . 无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； ⅲ . 可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种 色谱类型及样品的分析； ⅳ . 有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收 集。
6、空间排阻色谱
（又称凝胶色谱和分子筛色谱）
以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状 结构和不同孔径（x nm~x00 nm）的多聚体的通称。如葡聚 糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬 质凝胶。 机理：当试样进入凝胶色谱柱时，尺寸过大的分子 完全不能渗透到胶孔中去而受到排阻，沿胶粒之间的间隙直 接流出色谱柱，产生一个色谱峰；尺寸过小的分子可完全渗 透到胶孔中去，流动速度慢，最后流出色谱柱，产生一个色 谱峰；中等尺寸的分子 ，以其大小的不同，可渗透到某些 孔穴而不能进入另一些空穴，流出速度取决于分子尺寸的大 小, 按分子尺寸由大到小的顺序先后流出色谱柱，从而实现 分离。 应用：适合分离分子量大的化合物（100~800,000)， 只要相对分子量相差大于10%。
第 4章
高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
第一节 高效液相色谱法的特点 高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世， 导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。
正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相 所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、 氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属 正相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色 谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定 相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是 甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。 ODS（Octa Decyltrichloro Silane)
基本特点 1. 高效、高速、高灵敏度 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3．局限性 操作条件 1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力 适用范围广
第二节、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
一、液相色谱速率理论—影响色谱峰扩展因素
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提高柱效的途径，也就是如何提高液相色 谱的分离效率：
第四节 液相色谱法固定相
一、液—液色谱法及离子对色谱法固定相 1．担体 (1) 全多孔型担体： a. HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体， 如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的Φ100μm全多孔 型担体。缺点：填料的不规则性和较宽的粒度范围会导 致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在 “裂隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分 子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。
5.离子色谱(Ion Chromatography，IC)
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离 方法。离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。 例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用 电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相 的高背景电导信号掩没而无法检测。 为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同 时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分 离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的 离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具 有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而 用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术 称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑 制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交 换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生 两个重要反应：
离子色谱具有以下优点： （1）分析速度快 可在数分钟内完成一 个试样的分析； （2）分离能力高 在适宜的条件下，可使 常见的各种阴离子混合物 分离；例：使用双柱法， 在十几分钟内，可使七种 阴离子完全分离。 （3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）仪器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蚀
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薄壳型填料，柱效 仅每米1000~3000 塔板数 5~10μm球型和无定 型微粒硅胶，每米 5~6万理论塔板数
键合相色谱、离子色谱、疏水色谱、亲和色谱、手性色 谱、脂质体色谱、生物膜色谱、整体柱色谱、微径柱和 毛细管柱色谱及液相色谱-质谱联用等 /page/q/b/z/q0166w2f9bz.html
流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶 剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、 二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
应用： 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是 最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、 芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。
2、分配色谱
原理： 主要基于样品分子在流动相和固定相间的 溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱 分离模式。 研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。 可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前者是早 期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多 孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相， 即化学键合固定相至载体或基质表面。 化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱 类型。
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液—液色谱法及离子对色谱法固定相
3．化学键合固定相： 即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担 体表面。根据在硅胶表面 (具有≡Si－OH基团) 的化学反 应不同，键合固定相可分为： 硅氧碳键型(≡ Si－O－C ): 硅氧硅碳键型(≡Si－O－Si－C):稳定，耐水、耐光、耐有 机溶剂，应用最广。 硅碳键型(≡Si－C): 和硅氮键型（≡Si－N):
由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为 电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又 将样品阳离子 M+转变成相应的碱，由于OH -离子的淌度 为 Cl - 离子的 2 ． 6 倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏 度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。 在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型 离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而 且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来， Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导 率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸 盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子 色谱或单柱离子色谱。
3. 离子对色谱(Ion Pair Chromatography)
在色谱体系中引入一种与样品溶质离子电荷相反的离子对 试剂，通常称为对离子或反离子(counterion)，它与溶质离子形 成离子对，从而改变溶质在两相中的分配，使离子性溶质的保 留行为和分离选择性发生显著变化。 常用的离子对试剂有提供阴离子的C4 - C8烷基磺酸盐、烷 基硫酸盐、羧酸盐、萘磺酸盐、高氯酸盐等;提供阳离子的季 铵盐和烃基胺，如四丁基铵盐、十六烷基三甲基铵盐、三乙胺 等。 将离子对试剂涂渍在液液色谱的硅胶载体上或溶于流动相 中，可构成液液离子对分配色谱，主要用于强极性的有机酸、 有机碱的分离分析。 在反相色谱中，离子对试剂加入缓冲液和甲醇、乙腈等极 性有机溶剂的流动相构成反相离子对色谱。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到 流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方 法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶 解到流动相中去了。
键合固定相
OH OH + C18H37SiCl3 OH
O
O
O
Si
C18H37
非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是烷基、 苯 基 等 非 极 性 有 机 分 子 。 如 最 常 用 的 ODS （ Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18 柱就是最典型的代表，其 极性很小。 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子是具有二 醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。
减 小填料粒度；提高柱内填料装填的均 匀性来以加快传质速率。
对于液相色谱而言，除了上述的影响因素，还有柱 外展宽的影响，所谓柱外展宽是指色谱柱外各种因 素引起的峰扩展。