食品免疫学 第4章高效液相色谱法食品
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第四章 高效液相色谱法和超临界
流体色Hale Waihona Puke Baidu法
1
要求：
1、影响色谱峰展宽和柱效的因素有哪些？ 如何影响？
2、掌握常用定量方法；掌握化学键合固定相。 3、熟悉固定相与流动相及其选择； 4、了解高效液相色谱仪的基本组成
及各主要部件的作用。
俄国植物学家茨维特在1906年 使用的装置：色谱原型装置.
经典的液相柱色谱
理装置。
4.2.2 高效液相色谱仪的主要部件 1． 高压输液泵
4.2 高效液相色谱仪
4.2.1 高效液相色谱仪与流程
高效液相色谱 的组成：梯度淋 洗系统、高压输 液泵与流量控制 系统、进样系统、 分离柱及检测系 统。
21
流程： 1. 贮液器中贮存的流动相（常需脱气）经过过滤后
由高压泵输送到色谱柱入口。 2. 样品由进样器注入流动相系统，而后送到色谱柱进行分离 3. 分离后的组分由检测器检测，输出信号给记录器或数据处
（二）样品流出组分容易收集
混合组分为液态，tR值不同，先后流出色谱柱。
（三）流动相可选择范围广 1. GC：靠改变固定相； 2. HPLC： ⑴ 可用改变固定相； ⑵ 改变流动相的种类及极性（配比）
（四） 室温下分离，不需要高柱温
（五）HPLC检测器种类及灵敏度不及气相色谱 1、气相：检测器达34种，灵敏度高； 2、HPLC检测器只有4~5种，且灵敏度较低。 检测器种类及灵敏度是一国际性难题。
用气相色谱分析的仅占20%。
这是因为气相色谱使用气体流动相，被分析 样品必须要有一定的蒸气压，汽化后才能在柱上 分析，这就使得分离对象范围受到一定限制。
如：挥发性差的物质、生化样品等具有生物活 性的物质，用气相色谱就有一定困难。
高效液相色谱法：不受样品挥发度和热稳定性的限 制，只要求样品能制成溶液，不需要汽化。特别适 用于沸点高、极性强、热稳定性差的化合物。
4.1 高效液相色谱的特性
特点： 高效 分离柱的柱效可达每米数万； 高压 采用高压输液泵使流体流动，柱压可达
150~350×105Pa； 高速 对多数分析任务，通常在数分钟或数十分
钟内完成； 高灵敏度紫外检测器最小检测限可达109g，而荧
光检测器最小检测限可达1011g。 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离
（2）传质速率慢
固定相的微孔小且深时，扩散不易进行，传质速 率慢，对色谱峰的扩展影响较大。
固定相颗粒越小，传质过程越快，柱效越高； 减小固定相的颗粒粒度和增大孔径是提高柱效的 主要手段。 现代高效液相色谱的柱填料粒径都小于10μm。
不同粒径ODS 填料对液相色 谱H-u曲线影 响。
2020/5/29
在经典的液相柱色谱基础上，引入气相色谱的 理论和实验技术，采用高效固定相，高压输液泵及 在线检测手段而发展起来的现代分离分析方法。这 种柱色谱技术，叫做高效液相色谱法（HPLC）。 （也叫高压、高速、高分离、近代液相或现代液相 柱色谱法，1969年第一台仪器问世。）
HPLC与经典液相色谱法的比较
分析方法。
10
高效液相色谱法的分离原理与经典的液相色 谱法一致。重要的是速率理论各项动力学因素对 HPLC流出色谱峰展宽的影响。
一、高效液相色谱峰展宽和柱效 高效液相色谱峰展宽是由柱内、柱外各因素
所引起的，从而造成柱效降低。
（一）柱内展宽
柱内使色谱峰展宽主要因素是： 1、固定相的粒度大小；2、固定相填充的紧密度； 3、流动相带着组分在柱内的动力学过程。
经典液相色谱
常压或减压 填料颗粒 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高效液相色谱
高压，40~50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000~60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
一、HPLC与GC色谱法的比较
（一）适用范围广 据报道：在约300万个有机化合物中，可直接
动力学过程包括： ⑴涡流扩散A；⑵纵向扩散B/u；⑶传质速率C·u
HPLC中的速率理论
H=A+Cmu+Csmu
(1) 纵向扩散对色谱峰扩展影响很小 流动相的线速率>0.5 cm·s-1，分子扩散项的影响
可以忽略，液相色谱中H-u曲线中的最佳流速值比 气相色谱小得多
13
板高方程可简化为：H=A+C·u
说明： 1、流动相最佳流速选择 如果一支色谱柱的涡 流扩散 A 固定，若流动相流速过大，板高也增大， 柱效降低。但流速太慢，要延长色谱时间，而使峰 扩张。因此在实际工作中要选择一个最佳流速。
选择方法：一般把流速提高到某一值，既可加速色 谱过程，又能保持一定低的板高，达到最佳分离效 果。在实际工作中，多采用1ml/min左右的流速。
（3）柱内展宽的其它因素
柱内径向扩散 柱越长，填料粒度越大，流动 相流速越慢，越容易产生径向扩散。目前，一般采 用短柱，小粒度填料来减小径向扩散。
管壁效应 如果管径不够大，流动相在管壁区 的流速反比管中心要快，也会使峰形扩张。目前 多采用短粗柱，来减小峰形扩张。
（二）柱外效应影响显著峰展宽
它可分为柱前和柱后两种。 1、柱前展宽：主要由进样所引起。 2、柱后展宽：主要由接管、流通池体积以及检
2020/5/29
检测器、放大器和记录仪的时间常数过大（指 试样在各部件上的响应较慢），那么，得到的色谱 峰展宽，峰高降低、柱效差。这种情况对保留体积 小的组分影响特别显著。
克服柱后展宽的主要措施： 连接管的体积和流通池的容积应尽可能地小。
简述改善HPLC色谱峰展宽（提高柱效）的方法 。
在液相色谱中要想提高柱效，必须采用小而均匀的 固定相颗粒，并填充均匀，以减少涡流扩散。而选 用低粘度流动相，并适当提高柱温，可增大Dm值 （组分在流动相中的扩散系数），有利于减少传质 阻力。还有为了减少柱外因素对峰宽的影响，必须 尽量减小柱外死体积。
测器的响应时间所引起。
通常，流动相在空管中心流速最大，管壁方 向流速逐渐减小，试样浓度也如此分布。这样， 管中的试样比管壁部分的先到达检测器，因此， 引起了峰展宽。
柱外因素：柱前峰展宽和柱后峰展宽。 柱前峰展宽：由进样及进样器到色谱柱连接管引起 的（柱头直接进样，色谱峰的不对称性和柱效有明显 改善）。 柱后峰展宽：柱后连接管和检测器死体积； 通用紫外检测器的池体积仅为8μL。
流体色Hale Waihona Puke Baidu法
1
要求：
1、影响色谱峰展宽和柱效的因素有哪些？ 如何影响？
2、掌握常用定量方法；掌握化学键合固定相。 3、熟悉固定相与流动相及其选择； 4、了解高效液相色谱仪的基本组成
及各主要部件的作用。
俄国植物学家茨维特在1906年 使用的装置：色谱原型装置.
经典的液相柱色谱
理装置。
4.2.2 高效液相色谱仪的主要部件 1． 高压输液泵
4.2 高效液相色谱仪
4.2.1 高效液相色谱仪与流程
高效液相色谱 的组成：梯度淋 洗系统、高压输 液泵与流量控制 系统、进样系统、 分离柱及检测系 统。
21
流程： 1. 贮液器中贮存的流动相（常需脱气）经过过滤后
由高压泵输送到色谱柱入口。 2. 样品由进样器注入流动相系统，而后送到色谱柱进行分离 3. 分离后的组分由检测器检测，输出信号给记录器或数据处
（二）样品流出组分容易收集
混合组分为液态，tR值不同，先后流出色谱柱。
（三）流动相可选择范围广 1. GC：靠改变固定相； 2. HPLC： ⑴ 可用改变固定相； ⑵ 改变流动相的种类及极性（配比）
（四） 室温下分离，不需要高柱温
（五）HPLC检测器种类及灵敏度不及气相色谱 1、气相：检测器达34种，灵敏度高； 2、HPLC检测器只有4~5种，且灵敏度较低。 检测器种类及灵敏度是一国际性难题。
用气相色谱分析的仅占20%。
这是因为气相色谱使用气体流动相，被分析 样品必须要有一定的蒸气压，汽化后才能在柱上 分析，这就使得分离对象范围受到一定限制。
如：挥发性差的物质、生化样品等具有生物活 性的物质，用气相色谱就有一定困难。
高效液相色谱法：不受样品挥发度和热稳定性的限 制，只要求样品能制成溶液，不需要汽化。特别适 用于沸点高、极性强、热稳定性差的化合物。
4.1 高效液相色谱的特性
特点： 高效 分离柱的柱效可达每米数万； 高压 采用高压输液泵使流体流动，柱压可达
150~350×105Pa； 高速 对多数分析任务，通常在数分钟或数十分
钟内完成； 高灵敏度紫外检测器最小检测限可达109g，而荧
光检测器最小检测限可达1011g。 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离
（2）传质速率慢
固定相的微孔小且深时，扩散不易进行，传质速 率慢，对色谱峰的扩展影响较大。
固定相颗粒越小，传质过程越快，柱效越高； 减小固定相的颗粒粒度和增大孔径是提高柱效的 主要手段。 现代高效液相色谱的柱填料粒径都小于10μm。
不同粒径ODS 填料对液相色 谱H-u曲线影 响。
2020/5/29
在经典的液相柱色谱基础上，引入气相色谱的 理论和实验技术，采用高效固定相，高压输液泵及 在线检测手段而发展起来的现代分离分析方法。这 种柱色谱技术，叫做高效液相色谱法（HPLC）。 （也叫高压、高速、高分离、近代液相或现代液相 柱色谱法，1969年第一台仪器问世。）
HPLC与经典液相色谱法的比较
分析方法。
10
高效液相色谱法的分离原理与经典的液相色 谱法一致。重要的是速率理论各项动力学因素对 HPLC流出色谱峰展宽的影响。
一、高效液相色谱峰展宽和柱效 高效液相色谱峰展宽是由柱内、柱外各因素
所引起的，从而造成柱效降低。
（一）柱内展宽
柱内使色谱峰展宽主要因素是： 1、固定相的粒度大小；2、固定相填充的紧密度； 3、流动相带着组分在柱内的动力学过程。
经典液相色谱
常压或减压 填料颗粒 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测
高效液相色谱
高压，40~50MPa 填料颗粒小，2～50μm 柱效高,40000~60000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测
一、HPLC与GC色谱法的比较
（一）适用范围广 据报道：在约300万个有机化合物中，可直接
动力学过程包括： ⑴涡流扩散A；⑵纵向扩散B/u；⑶传质速率C·u
HPLC中的速率理论
H=A+Cmu+Csmu
(1) 纵向扩散对色谱峰扩展影响很小 流动相的线速率>0.5 cm·s-1，分子扩散项的影响
可以忽略，液相色谱中H-u曲线中的最佳流速值比 气相色谱小得多
13
板高方程可简化为：H=A+C·u
说明： 1、流动相最佳流速选择 如果一支色谱柱的涡 流扩散 A 固定，若流动相流速过大，板高也增大， 柱效降低。但流速太慢，要延长色谱时间，而使峰 扩张。因此在实际工作中要选择一个最佳流速。
选择方法：一般把流速提高到某一值，既可加速色 谱过程，又能保持一定低的板高，达到最佳分离效 果。在实际工作中，多采用1ml/min左右的流速。
（3）柱内展宽的其它因素
柱内径向扩散 柱越长，填料粒度越大，流动 相流速越慢，越容易产生径向扩散。目前，一般采 用短柱，小粒度填料来减小径向扩散。
管壁效应 如果管径不够大，流动相在管壁区 的流速反比管中心要快，也会使峰形扩张。目前 多采用短粗柱，来减小峰形扩张。
（二）柱外效应影响显著峰展宽
它可分为柱前和柱后两种。 1、柱前展宽：主要由进样所引起。 2、柱后展宽：主要由接管、流通池体积以及检
2020/5/29
检测器、放大器和记录仪的时间常数过大（指 试样在各部件上的响应较慢），那么，得到的色谱 峰展宽，峰高降低、柱效差。这种情况对保留体积 小的组分影响特别显著。
克服柱后展宽的主要措施： 连接管的体积和流通池的容积应尽可能地小。
简述改善HPLC色谱峰展宽（提高柱效）的方法 。
在液相色谱中要想提高柱效，必须采用小而均匀的 固定相颗粒，并填充均匀，以减少涡流扩散。而选 用低粘度流动相，并适当提高柱温，可增大Dm值 （组分在流动相中的扩散系数），有利于减少传质 阻力。还有为了减少柱外因素对峰宽的影响，必须 尽量减小柱外死体积。
测器的响应时间所引起。
通常，流动相在空管中心流速最大，管壁方 向流速逐渐减小，试样浓度也如此分布。这样， 管中的试样比管壁部分的先到达检测器，因此， 引起了峰展宽。
柱外因素：柱前峰展宽和柱后峰展宽。 柱前峰展宽：由进样及进样器到色谱柱连接管引起 的（柱头直接进样，色谱峰的不对称性和柱效有明显 改善）。 柱后峰展宽：柱后连接管和检测器死体积； 通用紫外检测器的池体积仅为8μL。