第四章 高效液相色谱(5课时)
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱 PPT
(2)≡Si－C或Si一N共价键合固定相
制备反应如下
+ Si OH
SO Cl 2
HgBr
Si
Si Cl
NH 2 CH 2 NCH 2 H2
Si NH
CH 2 CHNH 2
共价键健合固定相不易水解,并且热稳定较硅酸 酯好。缺点就是格氏反应不方便;当使用水溶液时,必须 限制PH在4～8范围内。
(3)硅烷化(≡Si—O－Si－C)键合固定相 制备反应如下:
第3节 高效液相色谱得固定相和流动相
(－)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类, 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅 为基质,可承受高压,可制成直径、形状、孔隙度不同 得颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,就就 是键合固定相,可扩大应用范围,她就是目前最广泛使 用得一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻 色谱中,她由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定 相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固 定相两类。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
12
3 分离系统——色谱柱
色谱柱就是液相色谱得心脏部件,她包括柱管 与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑得聚合材料得其她金属。玻璃管耐压有限, 故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm,内径为 4～5mm,凝胶色谱柱内径3～12mm,制备往内径较大,可 达25mm 以上。
(三)液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱就是以固体吸附剂作为固定 相,吸附剂通常就是些多孔得固体颗粒物质,在她们 得表面存在吸附中心。液固色谱实质就是根据物 质在固定相上得吸附作用不同来进行分离得。
1、分离原理
当流动相通过固定相(吸附剂)时,吸附剂表面得活性中 心就要吸附流动相分子。同时,当试样分子(X)被流动相带 入柱内,只要她们在固定相有一定程度得保留就要取代数目 相当得已被吸附得流动相溶剂分用)于就是,在固定相表面 发生竞争吸附:
制备反应如下
+ Si OH
SO Cl 2
HgBr
Si
Si Cl
NH 2 CH 2 NCH 2 H2
Si NH
CH 2 CHNH 2
共价键健合固定相不易水解,并且热稳定较硅酸 酯好。缺点就是格氏反应不方便;当使用水溶液时,必须 限制PH在4～8范围内。
(3)硅烷化(≡Si—O－Si－C)键合固定相 制备反应如下:
第3节 高效液相色谱得固定相和流动相
(－)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类, 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅 为基质,可承受高压,可制成直径、形状、孔隙度不同 得颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,就就 是键合固定相,可扩大应用范围,她就是目前最广泛使 用得一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻 色谱中,她由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定 相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固 定相两类。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
12
3 分离系统——色谱柱
色谱柱就是液相色谱得心脏部件,她包括柱管 与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑得聚合材料得其她金属。玻璃管耐压有限, 故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm,内径为 4～5mm,凝胶色谱柱内径3～12mm,制备往内径较大,可 达25mm 以上。
(三)液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱就是以固体吸附剂作为固定 相,吸附剂通常就是些多孔得固体颗粒物质,在她们 得表面存在吸附中心。液固色谱实质就是根据物 质在固定相上得吸附作用不同来进行分离得。
1、分离原理
当流动相通过固定相(吸附剂)时,吸附剂表面得活性中 心就要吸附流动相分子。同时,当试样分子(X)被流动相带 入柱内,只要她们在固定相有一定程度得保留就要取代数目 相当得已被吸附得流动相溶剂分用)于就是,在固定相表面 发生竞争吸附:
色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析
（一）固定相
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
《高效液相色谱培训》课件
讲解色谱柱的分类、特点以及如何选择合适的色谱柱。
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
高效液相色谱法教学【全】精选全文
P307~311
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
中国药典-高效液相色谱PPT医学课件
AR／CR 式中 As为内标物质的峰面积或峰高； AR为对照品的峰面积或峰高； Cs为内标物质的浓度； CR为对照品的浓度。
21
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪 器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质 的峰面积或峰高，按下式计算含量：
Ax 含量（Cx）＝f·─────
式中 t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。 当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）
均以峰宽（W）的计算结果为准。
18
重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复 性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对 照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其 峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％ ；采用内标法时，通常配制相当于80％、100 ％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标 溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进 样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差 也应不大于2.0％。
25
美国药典还讨论了多波长检测器，特别是二极管阵列多波长检测 器的特点，指出，二极管阵列检测器比固定波长检测器或可变波 长检测器的信噪比低，不适宜于低浓度化合物的分析。在讨论示 差折光检测器中，认为该检测器不如紫外光检测器灵敏，且受溶 剂组成、流速、温度变化的影响大，要得到满意的基线，需用参 比柱。
由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十 八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动 相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的 随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳 定。
14
二、系统适用性试验
21
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪 器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质 的峰面积或峰高，按下式计算含量：
Ax 含量（Cx）＝f·─────
式中 t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。 当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）
均以峰宽（W）的计算结果为准。
18
重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复 性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对 照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其 峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％ ；采用内标法时，通常配制相当于80％、100 ％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标 溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进 样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差 也应不大于2.0％。
25
美国药典还讨论了多波长检测器，特别是二极管阵列多波长检测 器的特点，指出，二极管阵列检测器比固定波长检测器或可变波 长检测器的信噪比低，不适宜于低浓度化合物的分析。在讨论示 差折光检测器中，认为该检测器不如紫外光检测器灵敏，且受溶 剂组成、流速、温度变化的影响大，要得到满意的基线，需用参 比柱。
由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十 八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动 相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的 随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳 定。
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二、系统适用性试验
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
高效液相色谱法教学课件 全共169页
•
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
谢谢！
高效液相色谱法教学课件 全
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
《仪器分析》4-高效液相色谱法
精选课件
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
精选课件
2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
精选课件
2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
实验四 高效液相色谱法测定水体中的苯酚及α-萘酚
高效液相色谱法测定水体中的苯酚和α-萘酚一、实验目的1、了解色谱法的分离原理，初步学会使用高效液相色谱仪；2、利用高效液相色谱仪分离测定水体中的苯酚及α-萘酚。
二、实验原理1、色谱法的分离原理溶于流动相中的各待测组分经过色谱柱固定相时，由于各组分与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸收、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，达到分离的目的，又称色层法、层析法。
2、高效液相色谱仪使用原理高效液相色谱仪由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成四个系统即高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
正是根据物质的定性与定量关系，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。
3、苯酚及α-萘酚的分离原理及标准溶液准备对于一些组分比较简单的已知范围的混合物，或无已知物的情况下，可以利用保留值定性。
保留值的大小取决于分配系数之比，即与组分的性质、固定液的性质及柱温有关，与固定液的用量、柱长、流速及填充情况无关。
在一定操作条件下，用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积或峰高对对照品的量（或浓度）做校正曲线，求回归方程，然后在相同条件下分析试样，计算含量，这种方法称为校正曲线法。
通常截距近似为零，若截距较大，说明存在一定的系统误差。
本实验，苯酚的波长为270nm，α-萘酚的波长为295nm。
使得两种物质的吸收峰达最大值，最终选定在254nm条件下。
分别配置单样和混合液浓度为100mg/L、80mg/L、60mg/L、40 mg/L、20mg/L标准溶液，分别进样，记录保留时间和出峰面积，用于定性分析。
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高效液相色谱柱
高效液相色谱柱
匀浆法装柱示意图
匀浆法装柱示意图
色谱柱色谱性能的评价
柱效：理论塔板数 不对称因子 渗透性
渗透性
渗透性 K 定义为：
K K 0 T K 0为比渗透率
T 为柱子的总孔隙率
FL K r 2 P
高效液相色谱填料
填料热力学特性影响色谱柱的选择性 填料的动力学性质或结构特点影响色谱 柱的效率
可获得三维色谱-光谱图的检测器
三维色谱-光谱图：时间-波长-吸收值
– 波长范围：190 - 950nm
可同时获得不同波长条件下的色谱图 可利用色谱保留值及光谱特征吸收曲线定性 可判别色谱峰的纯度及分离状态
(3)荧光检测器
利用某些试样具有荧光特性建立的检测方法
高灵敏度和高选择性（检出限 10-12 - 10-13
一定pH值和盐浓度的缓冲溶液
流动相强度和选择性(k, )
– 盐浓度（离子强度）
– 种类
– pH
(1)流动相中盐浓度的影响
盐浓度增加，降低试样组分在固定相上 的保留。
(2)盐种类的影响
阴离子交换：
– 洗脱强度：柠檬酸离子>SO42- > C2O42- > I- > NO3- >CrO42- > Br-
检测器的分类
溶质性检测器：对被分离组分的物理或 化学特性有响应
– 紫外、荧光、电化学检测器等
总体检测器：对试样和流动相总的物理 或化学性质有响应
– 示差折光检测器、电导检测器等
几种常用检测器简介
紫外光度检测器(ultraviolet photometric detector) 光电二极管阵列检测器(photo-diode array detector) 荧光检测器(fluorescence detector) 示差折光检测器(differential refractive index detector) 蒸发光散射检测器（evapor ative light scattering
1.储液罐
必须有足够的容积 与溶剂不发生化学反应 便于对溶剂进行脱气 不锈钢、玻璃、氟材料 容积：500 - 2000 cm3
溶剂的Байду номын сангаас滤与脱气
过滤：除去溶剂中的固体微粒 脱气：除去溶剂中溶解的气体
过滤
过滤
脱气
加热法 抽真空 吹氦气 超声波 在线脱气
2.高压输液泵
流动相
气相色谱流动相：对组分没有亲和力的惰性气 体，对分离选择性几乎无影响 高效液相色谱流动相：可选用不同极性的液体
– 选择余地大 – 对分离影响大（与组分或固定相均作用）
色谱柱温
气相色谱柱温： 一般较高
高效液相色谱柱温：通常为室温
二、高效液相色谱的分类
按分离原理分类： 正相色谱 反相色谱 离子交换色谱 尺寸排阻色谱 疏水作用色谱 亲和色谱 手性色谱
使用中孔和大孔填料 微孔易造成色谱峰拖尾
表面多孔型(porous layer beads)
贯流型粒子(flow-through particle)
色谱用硅胶基质材料
硅胶的表面 硅胶的化学稳定性 硅胶的物理性质 多孔硅胶的制备 多孔硅胶的表面改性
（1）硅胶的表面
暴露于表面的 Si-O-Si （疏水） 硅羟基 Si-OH 吸附水
– 颗粒的大小、形状、均匀性、表面积
– 孔径、孔体积等。
高效液相色谱填料（物理形态）
全多孔型（porous particle)
– 球形 – 不规则形
无孔小粒径型(non-porous small particle) 表面多孔型(porous layer beads) 贯流型粒子(flow-through particle)
二、高效液相色谱的分类
按分离规模分类： 制备色谱 柱内径>10mm 半制备色谱 柱内径>5-10mm 分析型色谱 柱内径< 5 mm
三、高效液相色谱的特点
高压 150 - 350 105 Pa 高速 一般< 1 h, <1min. 高效 柱效高 高灵敏度 10-9 g (紫外检测器） 10-11 g（荧光检测器）
比孔容(mL/g) 比表面积 机械强度
硅烷化试剂
氯硅烷
烷氧基硅烷
(四）检测系统---检测器
理想检测器应具有的特点：
– 灵敏度高
– 对所有的样品都有响应
– 对温度和流速波动不敏感 – 死体积小 – 对样品无破坏性
– 对溶剂无响应，能用于梯度洗脱
– 线性范围宽 – 重现性好、响应时间快 – 能给出定性信息
g/cm3)
稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、
色素、蛋白质等荧光物质。
荧光检测器光路图
(4)示差折光检测器
连续测定流出液折光指数的变化
通用型检测器，但灵敏度较低（10-7 g/cm3)
– 反射式示差折光检测器 – 偏转式示差折光检测器 – 干涉式示差折光检测器
偏转式示差折光检测器光路图
•21-2 高效液相色谱仪
21-2 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构 高效液相色谱仪的主要部件
一、高效液相色谱仪的结构
二、高效液相色谱仪的主要部件
高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 附属系统
(一）高压输液系统
储液罐 高压输液泵 过滤器 压力脉动阻尼器
（二）进样系统
取样和进样功能 手动和自动 要求：
– 密封性好
– 死体积小
– 重复性好 – 进样时对色谱系统的压力和流量波动小
进样1
进样2
进样3
自动进样器
(三)分离系统
色谱柱 柱箱*
色谱柱
柱材料：不锈钢 柱长度： 5 - 30 cm 柱内径：2 - 5 mm 填料：3 - 10m 填充：匀浆法
比优化 k
k2 10( P2 P1 ) / 2 k1
– 2. 等强度更换有机改性剂，提高选择性
流动相选择例
（6）应用例
高尔夫球场杀虫剂的分离
21-6 离子交换色谱与离子色谱
以离子交换剂为固定相，借助于试样中电离组分对固 定在交换剂上的带相反电荷的离解部位亲合力，使其 彼此分离。 分离对象：在溶液中可电离的物质
– 贯穿孔(through pores, 600-800 nm) – 扩散孔(diffuse pores,50-150nm)
连续床 (monolithic stationary phase)
全多孔型（porous particle)
孔的类型
微孔 中孔 大孔
孔径 <2 nm 孔径<50 nm, >2 nm 孔径>50 nm
相
ODS示意图
（2）保留机理
试样组分的流出顺序
组分流出顺序为：
– 疏水性小者先流出 – 疏水性大者后流出
（3）溶剂强度
反相液相色谱最常用的溶剂：
– 甲醇 (methanol)、乙腈 (acetonitril)、四氢呋喃 (tetrahydrofuran)、
水
用极性参数 P 表示
– 极性大，强度弱； 极性小，强度强 （为什么？）
Pmethanol Pacetonitril Ptetrahydrofuran Pwater
5.1 5.8 4.0 10.2
混合溶剂的强度
PAB = APA + BPB
（4）溶剂选择性
（5）流动相及其选择
反相液相色谱流动相的基本组成：水+有机改性剂（甲 醇或乙腈或四氢呋喃） 选择：
– 1.用水和甲醇（或乙腈）的混合溶剂为流动相，通过改变混合
一、键合固定相类型
键合固定相的基质材料主要为硅胶 （1）疏水基团 不同链长的烷烃（C8, C18）和苯基 等 （2）极性基团 氨丙基、腈乙基、醇和醚等 （3）其它基团 离子交换基、手性识别基、配基 （如酶、抗原、激素等）
二、键合固定相的制备
（1）硅酸酯
二、键合固定相的制备
（2）Si - C 和 Si - N 型
– 无机离子混合物 – 有机物：氨基酸、核酸、蛋白质等
主要内容
离子交换原理 固定相 流动相 应用例 离子排斥色谱 离子色谱
一、离子交换原理
离子交换通式
阳离子交换 R-SO3-H+ + M+ 阴离子交换 R-NR3+Cl- + X-
R-SO3-M+ + H+
R-NR3+X- + Cl-
(7)联用技术
HPLC-MS HPLC-NMR HPLC-FTIR
(8)梯度淋洗装置
低压梯度
高压梯度
21-5 化学键合相色谱
采用化学键合相作为固定相的液相色谱称化学键合相 色谱法 特点：
– 固定相稳定性好 – 适合于梯度洗脱 – 应用范围广
化学键合相色谱
键合固定相类型 键合固定相的制备 反相键合相色谱法 正相键合相色谱法
二、键合固定相的制备
（3）硅烷化
三、反相键合相色谱法
流动相极性大于固定相的色谱法