第四章 高效液相色谱(5课时)

离子交换通式
一般形式： R-A + B
R-B + A
平衡常数（离子交换反应的选择系数）
KB/ A
[ B]s [ A] [ B][ A]s
二、固定相
离子交换剂 基质材料：合成树脂（苯乙烯）、纤维素、硅胶 带电基团：阳离子交换剂、阴离子交换剂
– 强阳离子交换剂 SCX – 弱阳离子交换剂 WCX – 强阴离子交换剂 SAX – 弱阴离子交换剂 WAX
比孔容(mL/g) 比表面积 机械强度

硅烷化试剂

氯硅烷

烷氧基硅烷
(四）检测系统---检测器

理想检测器应具有的特点：
– 灵敏度高
– 对所有的样品都有响应
– 对温度和流速波动不敏感 – 死体积小 – 对样品无破坏性
– 对溶剂无响应，能用于梯度洗脱
– 线性范围宽 – 重现性好、响应时间快 – 能给出定性信息
(7)联用技术
HPLC-MS HPLC-NMR HPLC-FTIR

(8)梯度淋洗装置
低压梯度
高压梯度
21-5 化学键合相色谱

采用化学键合相作为固定相的液相色谱称化学键合相 色谱法 特点：
– 固定相稳定性好 – 适合于梯度洗脱 – 应用范围广
化学键合相色谱
键合固定相类型 键合固定相的制备 反相键合相色谱法 正相键合相色谱法
比优化 k
k2 10( P2 P1 ) / 2 k1
– 2. 等强度更换有机改性剂，提高选择性
流动相选择例
（6）应用例
高尔夫球场杀虫剂的分离
21-6 离子交换色谱与离子色谱


以离子交换剂为固定相，借助于试样中电离组分对固 定在交换剂上的带相反电荷的离解部位亲合力，使其 彼此分离。 分离对象：在溶液中可电离的物质
-SO3H -CO2H -N+R3 -NH2
常用的离子交换剂

多孔型离子交换树脂
– 粒径 5-20m – 交换容量高 – 柱效低

薄膜型离子交换树脂 表面多孔型离子交换树脂
– 柱效高 – 交换容量低

离子交换键合固定相
– 机械强度高 – 柱效高

理论交换容量：每克干树脂所含离子交换基团的量
三、流动相
示差折光检测器使用要点

流动相组成要恒定（变化值<10-6）


温度恒定 （样品池与参比池的温差 ±10-4 C)
压力恒定 （检测池不耐压）


流速稳定 （流量波动<5%）
不可用于梯度洗脱
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ5）蒸发光散射检测器


通用型检测器
– 不需要衍生便可检测任何不带发色基团的化合物
比示差折光检测器更佳的灵敏度及稳定性 对温度变化不敏感 可用于梯度洗脱 响应值与样品质量有关，对所有样品的检测给 出近乎一样的响应因子

可获得三维色谱-光谱图的检测器

三维色谱-光谱图：时间-波长-吸收值
– 波长范围：190 - 950nm

可同时获得不同波长条件下的色谱图 可利用色谱保留值及光谱特征吸收曲线定性 可判别色谱峰的纯度及分离状态
(3)荧光检测器

利用某些试样具有荧光特性建立的检测方法

高灵敏度和高选择性（检出限 10-12 - 10-13

一、键合固定相类型

键合固定相的基质材料主要为硅胶 （1）疏水基团 不同链长的烷烃（C8, C18）和苯基 等 （2）极性基团 氨丙基、腈乙基、醇和醚等 （3）其它基团 离子交换基、手性识别基、配基 （如酶、抗原、激素等）
二、键合固定相的制备

（1）硅酸酯
二、键合固定相的制备

（2）Si - C 和 Si - N 型

硅胶表面的硅羟基

硅羟基浓度：8.0 ±0.1mol/m2
吸附水
(2)硅胶的化学稳定性
一般可以耐受酸性介质的侵蚀 在纯水中的平衡溶解度100mg/L pH>9时溶解度显著增加 溶解度与粒径有关

（3）硅胶的物理性质
颗粒的形状与大小 孔径大小及其分布

– 微孔<2 nm ; 中孔(2-50nm); 大孔>50nm
detector)
电导检测器(electrical conductivity detector)
(1)紫外光度检测器

应用最广泛的一种高效液相色谱检测器
– 约80%的样品

固定波长 可变波长
紫外光度检测器光路图
紫外光度检测器光路图
(2)光电二极管阵列检测器
三维色谱-光谱图
光电二极管阵列检测器的主要特点
– 无机离子混合物 – 有机物：氨基酸、核酸、蛋白质等
主要内容
离子交换原理 固定相 流动相 应用例 离子排斥色谱 离子色谱

一、离子交换原理
离子交换通式

阳离子交换 R-SO3-H+ + M+ 阴离子交换 R-NR3+Cl- + X-
R-SO3-M+ + H+

R-NR3+X- + Cl-

（二）进样系统
取样和进样功能 手动和自动 要求：

– 密封性好
– 死体积小
– 重复性好 – 进样时对色谱系统的压力和流量波动小
进样1
进样2
进样3
自动进样器
(三)分离系统
色谱柱 柱箱*

色谱柱
柱材料：不锈钢 柱长度： 5 - 30 cm 柱内径：2 - 5 mm 填料：3 - 10m 填充：匀浆法
二、高效液相色谱的分类
按分离规模分类： 制备色谱 柱内径>10mm 半制备色谱 柱内径>5-10mm 分析型色谱 柱内径< 5 mm

三、高效液相色谱的特点
高压 150 - 350 105 Pa 高速 一般< 1 h, <1min. 高效 柱效高 高灵敏度 10-9 g (紫外检测器） 10-11 g（荧光检测器）
21-1 概述

一、高效液相色谱与气相色谱的比较 二、高效液相色谱的分类 三、高效液相色谱的特点
一、高效液相色谱与气相色谱的比较

分析对象


流动相
色谱柱温度
分析对象
– 气相色谱：气体和沸点较低的化合物，
占有机物总数20%
– 高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、
分子量大的物质，
占有机物总数80%

– 颗粒的大小、形状、均匀性、表面积
– 孔径、孔体积等。
高效液相色谱填料（物理形态）

全多孔型（porous particle)
– 球形 – 不规则形
无孔小粒径型(non-porous small particle) 表面多孔型(porous layer beads) 贯流型粒子(flow-through particle)

•21-2 高效液相色谱仪
21-2 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构 高效液相色谱仪的主要部件

一、高效液相色谱仪的结构
二、高效液相色谱仪的主要部件
高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 附属系统

(一）高压输液系统
储液罐 高压输液泵 过滤器 压力脉动阻尼器
二、键合固定相的制备

（3）硅烷化
三、反相键合相色谱法
流动相极性大于固定相的色谱法

固定相 保留机理 溶剂强度 溶剂选择性 流动相及其选择 应用例
（1）固定相

最常用的固定相：
– C18 (ODS: chemically bonded octadecylsilane)

C8和其它短链烷烃、苯基键合硅胶固定

– 贯穿孔(through pores, 600-800 nm) – 扩散孔(diffuse pores,50-150nm)

连续床 (monolithic stationary phase)
全多孔型（porous particle)
孔的类型
微孔 中孔 大孔

孔径 <2 nm 孔径<50 nm, >2 nm 孔径>50 nm
一定pH值和盐浓度的缓冲溶液

流动相强度和选择性(k, )
– 盐浓度（离子强度）
– 种类
– pH
(1)流动相中盐浓度的影响

盐浓度增加，降低试样组分在固定相上 的保留。
(2)盐种类的影响

阴离子交换：
– 洗脱强度：柠檬酸离子>SO42- > C2O42- > I- > NO3- >CrO42- > Br-
– 测定物质的纯度和定量测定未知物
蒸发光散射检测器(ELSD)
蒸发光散射检测器工作原理
ELSD 和RI的基线稳定性及灵 敏度比较
应用例1
应用例2
应用例3
(6)电导检测器
基于物质在某些介质中电离后所产生电导变化 进行测定的检测器 主要应用于离子色谱 受温度影响较大

电导检测器结构示意图
检测器的分类

溶质性检测器：对被分离组分的物理或 化学特性有响应
– 紫外、荧光、电化学检测器等

总体检测器：对试样和流动相总的物理 或化学性质有响应
– 示差折光检测器、电导检测器等
几种常用检测器简介

紫外光度检测器(ultraviolet photometric detector) 光电二极管阵列检测器(photo-diode array detector) 荧光检测器(fluorescence detector) 示差折光检测器(differential refractive index detector) 蒸发光散射检测器（evapor ative light scattering
Pmethanol Pacetonitril Ptetrahydrofuran Pwater
5.1 5.8 4.0 10.2
混合溶剂的强度
PAB = APA + BPB
（4）溶剂选择性
（5）流动相及其选择

反相液相色谱流动相的基本组成：水+有机改性剂（甲 醇或乙腈或四氢呋喃） 选择：
– 1.用水和甲醇（或乙腈）的混合溶剂为流动相，通过改变混合
g/cm3)

稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、
色素、蛋白质等荧光物质。
荧光检测器光路图
(4)示差折光检测器

连续测定流出液折光指数的变化

通用型检测器，但灵敏度较低（10-7 g/cm3)
– 反射式示差折光检测器 – 偏转式示差折光检测器 – 干涉式示差折光检测器
偏转式示差折光检测器光路图
相
ODS示意图
（2）保留机理
试样组分的流出顺序

组分流出顺序为：
– 疏水性小者先流出 – 疏水性大者后流出
（3）溶剂强度

反相液相色谱最常用的溶剂：
– 甲醇 (methanol)、乙腈 (acetonitril)、四氢呋喃 (tetrahydrofuran)、
水

用极性参数 P 表示
– 极性大，强度弱； 极性小，强度强 （为什么？）

1.储液罐
必须有足够的容积 与溶剂不发生化学反应 便于对溶剂进行脱气 不锈钢、玻璃、氟材料 容积：500 - 2000 cm3

溶剂的过滤与脱气
过滤：除去溶剂中的固体微粒 脱气：除去溶剂中溶解的气体

过滤
过滤
脱气
加热法 抽真空 吹氦气 超声波 在线脱气
2.高压输液泵

高效液相色谱柱
高效液相色谱柱
匀浆法装柱示意图
匀浆法装柱示意图
色谱柱色谱性能的评价
柱效：理论塔板数 不对称因子 渗透性

渗透性

渗透性 K 定义为：
K K 0 T K 0为比渗透率
T 为柱子的总孔隙率
FL K r 2 P
高效液相色谱填料
填料热力学特性影响色谱柱的选择性 填料的动力学性质或结构特点影响色谱 柱的效率

对泵性能的要求
– 输出压力高 150 - 300 kg/cm2
500 kg/cm2 – 流量范围广 0.1 -- 10 cm3/min 可调 – 流量稳定 无脉动，流量精度 0.5% 左右 – 耐腐蚀 适用于各种有机溶剂、水、缓冲溶 液
往复泵
单泵与双泵
脉动阻尼器
过滤器
烧结不锈钢材料制成 孔径：2 - 10m
使用中孔和大孔填料 微孔易造成色谱峰拖尾
表面多孔型(porous layer beads)
贯流型粒子(flow-through particle)
色谱用硅胶基质材料
硅胶的表面 硅胶的化学稳定性 硅胶的物理性质 多孔硅胶的制备 多孔硅胶的表面改性

（1）硅胶的表面
暴露于表面的 Si-O-Si （疏水） 硅羟基 Si-OH 吸附水
流动相

气相色谱流动相：对组分没有亲和力的惰性气 体，对分离选择性几乎无影响 高效液相色谱流动相：可选用不同极性的液体
– 选择余地大 – 对分离影响大（与组分或固定相均作用）

色谱柱温

气相色谱柱温： 一般较高

高效液相色谱柱温：通常为室温
二、高效液相色谱的分类




按分离原理分类： 正相色谱 反相色谱 离子交换色谱 尺寸排阻色谱 疏水作用色谱 亲和色谱 手性色谱