醋酸菌分离及鉴定

醋酸菌分离及鉴定

一、培养基

1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无

水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼

脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌

后培养基温度降到75 ℃左右时加入。

2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5%

（体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。

3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分

数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。

二、醋酸菌分离纯化流程

样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管

保藏→产醋酸定性测试。

三、步骤

1 、菌株分离

取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。取

10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中，

30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。

2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面，

4℃冰箱保存。

3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极

其相似的菌株归为一大类。

4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于

装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上

混匀后得到菌悬液。

四、鉴定

1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成

对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。

2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生

长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能

产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生

CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。在斜面培养基上生长良好,

培养2 d后呈油脂状,并产酸。在10% ( v / v)乙醇的培养基上、

Hoyer2Frateur培养液中、30%葡萄糖培养基上均不生长。

五、测试

1、产酸量的测定方法取1 mL 发酵液, 加入10 mL 蒸馏水, 3 滴～

5 滴0.02 %酚酞酒精溶液, 用标定的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定

至浅粉色。由所耗的NaOH 溶液的量来计算样品中的含酸量(以

醋酸计)。

产酸量( %) =( V- V0) ×CNaOH×0.06×100 %

式中：

V——发酵液样品滴定耗用的NaOH 量(mL);

V0——以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH 量(mL); CNaOH——NaOH 标准溶液浓度(mol/L);

0.06——消耗1 mL 0.1mol/L NaOH 溶液相当于乙酸的质量( g) ; 100 %——转化为百分含量的系数。

六、有关背景

1、传统法酿醋过程中熏醋醅料固态发酵大致上可分为3 个阶段:

第1 阶段是第1 ～ 10 天主要为酒化、糖化阶段;

第2 阶段为醋酸发酵阶段( 第10 ～ 23天) ；

第3 阶段是第23 ～ 28 天主要为传统酿醋过程中熏醋的后熟

阶段。后熟阶段由于酸的大量积累，大部分微生物在此阶段被

严重抑制，甚至死亡，此时醋酸菌在物料中占绝对优势，物料

中的酒精此时也消耗殆尽，酒化、醋化、糖化作用都基本停止，但各种风味物质酸、醇、酮、酚、酯、醛以及它们的复合物等

的转化还在缓慢地进行。

2、对于醋品的生产而言，不仅需要产酸能力极强的醋酸菌，也需

要产酸及产香的芽孢杆菌以及一些其它的微生物，这也是各地出品的醋口感与香味不一的重要原因。但是，因为选用的分离

培养基主要适用于产酸菌的分离，因而所分离出的菌株只是醋醅中微生物的一小部分。通常环境中可培养的细菌不到细菌总

数的1%。而对于难以培养的细菌及一些需要特殊培养基的细菌，

可以采用免培养法。

3、醅料中的微生物前期以霉菌为主，中后期以酵母菌和细菌为主。