细胞课程设计

目录

一、设计目的和要求 (1)

（一）. 设计目的 (1)

（二）. 设计要求 (1)

二、总体方案的拟定 (2)

（一）. 实验原理 (2)

（二）. 技术路线 (3)

三、原料选取说明 (7)

四、实验仪器的确定 (5)

五、实验试剂的选择及制备方法 (5)

六、实验过程设计 (7)

（一）. 实验步骤 (7)

（二）. 操作要点 (9)

（三）. 注意事项 (10)

七、设计心得 (10)

八、参考资料 (11)

一、设计目的和要求

（一）. 设计目的

（1）通过直接消化法分离小鼠干细胞进行原代培养，从而得到体外培养的小鼠肝细胞，进行相关实验研究。

（2）进一步掌握和熟练动物细胞培养的基本内容，了解细胞培养的特点和步骤。（二）. 设计要求

通过设计实验，掌握动物细胞的增殖，用消化法进行小鼠肝细胞的培养实验。

通过选取小鼠和培养基配方以及分离小鼠肝细胞，掌握配制培养液及操作具体步骤的实验设计技能；基本掌握动物组织、动物细胞培养中形态发生和建成的途径；掌握动物细胞培养中对温度、pH值、等各种条件的要求与技术。

在本设计性实验项目过程中，掌握快速查阅专业文献资料的能力，根据培养目的选定合适的材料，拟定培养方法，设计培养基配方；掌握无菌操作方法，找到防止污染的措施及对污染原因的分析；培养在实验过程中发现问题、分析问题、解决问题的能力；培养团队协作及与实验指导教师交流、合作的能力；为从事生物细胞学领域的相关研究及与细胞工程有关的生物技术奠定良好的技术基础和实验能力。

二、总体方案的拟定

（一）. 实验原理

原理：采用胰蛋白酶消化法。常用的胰蛋白酶的浓度的pH7.2左右，一旦细胞分散后可加入一些含血清的培养液来终止消化，胰蛋白酶是目前最广泛使用的消化剂。适于细胞间质较少的软组织及传代细胞的消化，但对于纤维性组织，或较硬的癌组织，则效果较差。最适温度为：37℃。消化时间依据不同情况而定，温度低、组织块大、胰蛋白酶低者，消化时间长；反之，则相应减少时间。25%的胰蛋白酶浓度在37℃下消化5cm3大小的胚胎类软组织，需要20-30分钟。酶浓度过大或消化时间过长，细胞可被消化掉；但消化不充分也达不到细胞分散的目的。使用胰蛋白酶时可改变不同参数以确定出最佳消化效果。有些组织和细胞对胰蛋白酶的耐受性差，因而，要分次消化，并及时把已消化下来的细胞与组织分开放入含有血清的培养液中，分散后继续消化。Ca2+Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定的抑制作用，故不用加含这些离子的溶液。

（二）. 技术路线

(一）实验准备阶段

清洗：新玻璃器皿用自来水刷洗，再侵泡5%HCL中和碱性物质和其他有害物质，使用过的玻璃器皿,侵入清水中避免干涸难洗，用洗涤剂清洗，倒置干燥，侵酸性洗液过夜，捞出用自来水清洗，烘干，用纸包装。高压蒸汽灭菌，储存备用。胶塞处理：用清水清洗，再用0.2%NaOH煮沸10—20min,自来水清洗10次，用1%Hcl侵泡30min，自来水清洗10次，蒸馏水刷洗3次晾干，高压灭菌。旧的胶塞直接用洗涤剂煮沸清洗，晾干，包装，高压灭菌。

消毒：物理消毒1）紫外线消毒：用于消毒空气，操作台和不能用干湿热灭菌的培养器皿。2）干热灭菌：用于玻璃器皿的灭菌，将用器皿放在干燥箱加热至160c,保温90-120min 3）湿热灭菌：高压蒸汽灭菌，是最有效的灭菌方法，用于布类，橡胶制品，金属器械，玻璃器皿，某些塑料制品及加热后不产生沉淀的无机溶液。4滤过除菌：用于培养液和各种不能高压蒸汽灭菌的溶液，采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上合适的滤膜。化学消毒：1）70%或75%酒精，用于一些金属器械，台面的消毒2）0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂及台面的消毒。3）来苏尔水：用于无菌室桌椅，墙壁，地面的消毒。4）0.5%过氧乙酸：10min可将芽孢杀死，用于物品的表面消毒，用喷洒和擦拭的方法。

注意事项：

1.清洗玻璃制品时，侵酸之后一定要用清水冲洗10-15次，残留液体对细胞粘附有极大影响，清洗塑料制品时用棉花或揉软纱布，千万不要用硬毛刷，以免损坏表面。试管用超声清洗处理后逐个清洗，没有洗净会有影响。

2.干热灭菌，应在白天用烘箱，避免发生意外，当温度超过100c时不能打开烘箱门。金属制品，橡胶，塑料制品不用此法。

3.高压蒸汽灭菌后，器皿务必晾干，烘干，以免发霉

4.牛血清，大部分培养基，胰酶和一些生物制剂是有机溶剂，不用高压蒸汽法灭

5.过滤灭菌时，过滤器使用前包好过滤膜，高压灭菌后才可使用，过滤酶制剂时将温度降到室温下，压力不宜过大，过大会使过滤膜破裂，过滤膜包装时，螺丝不宜过紧，以防蒸汽不能进入，灭菌后拧紧使用。

6.化学消毒时，配制75%酒精用卫生级，来苏尔水不能消毒皮肤

四、实验仪器的确定

保温箱、显微镜、水浴箱、离心机、离心管高压灭菌锅、电热超净工作台、CO

2

干燥箱、酒精灯、纱布、解剖剪、解剖镊、培养瓶、培养皿、研磨玻片、滤网、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器，酒精棉球,废液缸, 镊子,火柴, 喷壶。血细胞计数板、盖片、滴管或移液器、枪头。

五、实验试剂的选择及制备方法

1.75%乙醇(99.7%*V=75%*100)

2. RPIM1640培养液（小牛血清和青霉素、链霉素）

关于RPMI 1640细胞培养液的配制

1) 配制培养基最好使用新制备的三蒸水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节pH 值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。

2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。

3) 溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。

4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。

5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。无链霉素的情况下，用庆大霉素代

替，终浓度调为50～200U/ml。

6) 调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％NaHCO3调节pH到7.2。

7) 过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。

8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。临用前将加入小牛血清(10%~20%)。

【注意事项】

每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。

市售小牛血清使用前多应该灭活（56℃，30min），以消除补体活性。动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。生化检测总蛋白含量 3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。选定一个效果较好的批号后，可一次多购该批号的血清，保证试验条件的稳定。

由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。试验中加入小牛血清后，培养基的pH可能还会变化，故亦可先加入小牛血清后调pH值。但此种方法过滤较困难，只适于正压过滤。

培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48hr，以检测培养液是否有污染。

每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分（主要为谷氨酰胺）损失，造成实验繁琐或者污染。

3.0.25%胰酶

一般细胞 0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)

配方：100ml PBS,0.25g胰酶

步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O

/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)

2 称胰酶0.25g

3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜

低速搅拌0.5h冰浴中

4 调PH7.4

5 仍在冰浴中

6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完

tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，

酶就变性了。低温，防止酶失活

对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)

tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力

4．D-Hanks液及配制

NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na2HPO4·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35，酚

红0.02g，加入双蒸水1000ml溶解调PH值6.8-7.0，分装在250ml输液瓶中，高压消毒，冷却后放于4度冰箱中保存备用。

注意：酚红对细胞有一定毒性，目前实验中的用量除0.02克外，还有0.01克和

0.005克，也有BSS液中不加酚红的。酚红量不同，BSS颜色也不同。5．DMEM培养液

取1000ml消毒过的锥形瓶，注入一定量的消毒过的双蒸水，首先加DMEM培养基，溶解后，再加3.7g碳酸氢钠，定容后调PH值 6.8-7.0，在无菌台上抽滤除菌，并分装至100ml输液瓶中，盖好瓶塞，用牛皮纸扎口，放在冰箱中4度保存备用。

6 .0.4%台盼蓝染液

称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤4c 保存。

使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。

三、原料选取说明

选取2～4周龄小鼠的肝细胞为实验所用，雌雄不限。

六、实验过程设计

（二）. 实验步骤

1.将小鼠引颈处死后于含有75%酒精中的大烧杯中浸洗10秒钟，沥干。

2.用剪刀剪开小鼠腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜,打开腹腔,迅速取出肝脏。将其放入装有4℃的含双抗的.D-hank's液中进行漂洗2次，如此反复3次，最后一次清洗后，

将试管放入离心机800rp/min离心4min。

3.将离心后的试管取出后弃上清液，加入5-6倍肝组织体积的含0.25%胰酶和EDTA于37℃消化细胞40 min。消化完全者可用吸管吹打散开。

4.将消化完全的悬液经200目不锈钢网过滤到培养皿中，之后将过滤后的悬液装到一个5ml离心管中，之后向过滤后的悬液中加入含10%新生牛血清的DMEM 培养基到5ml，于4℃冰箱中静置20min。

5.用吸管弃除悬液，加入DMEM培养基至5ml，以1000rp/min离心4min，弃上清液，如此反复3次。

6.最后离心完后加入2ml含10%新生牛血清的DMEM完全培养基，收集肝细胞于培养瓶中，进行台盼蓝活细胞计数。

条件7.最后加入相同的完全培养基，调整细胞密度至5×105/ml，于37℃ 5%CO

2

下培养。

8.10h后首次换液，换以含50ml/L的新生牛血清的DMEM培养液。细胞纯化

细胞纯化采用酶消化法与机械刮除法相结合的方法，集体操作：

酶消化法：

1）先用0.5%胰蛋白酶和0.02 %的EDTA（1:1）混合液漂洗培养细胞，让后再换新的混合液继续消化，之后再倒置显微镜下观察并不时摇动培养瓶，等到半数细胞脱落下来以后，便立即停止消化。

2）把消化液吸入离心管中，离心上清，然后移入另一培养瓶中，加培养液置温箱中培养，再向原瓶内也补加新的培养液继续纯化。经过几次反复处理，可把纤维细胞除净。

机械刮除法：

1）标记镜下观察，用记号笔在培养瓶的背面圈下上皮细胞生长部位。

2）刮除弃掉培养液，把无菌胶刮刀伸入瓶中，肉眼或显微镜下，刮除无标记空间。

3）冲洗用Hank’s冲洗液冲洗1或2次，洗除被刮掉的细胞。

4）培养然后注入培养液继续培养，发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除刮除至完全除掉为止。

细胞冷冻：

将对数期的细胞以等体20%DMOS培养液重悬，并分装于冷冻管中，降温至4oC 30 min ，

冰盒10 min 液氮罐气相2h ，最后投入液氮中保存。

冻存细胞的复苏：

取出储存细胞，37oC 水浴中快速融化，移入完全培养基中进行活细胞计数，细胞接种密度为3×105个/ml，培养12-24h 更新新鲜的完全生长培养基，以去除冻存剂。

传代培养

操作步骤

倒出旧培养液，用pbs洗涤2次

从无细胞面加入消化液，使消化液侵没细胞层

倒置显微镜下观察细胞的变化，当细胞收缩变圆时取回细胞，将消化液倒出。加入生长液后用吸管吹打数次，使细胞分散。

计数调整细胞密度（2*10-5).

封装，培养

细胞计数

细胞计数原理细胞密度（个/ml）=n/4×1000×稀释倍数n=四大格内的细胞总数

（二）台盼蓝染色原理台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。

（三）四实验内容死活细胞鉴别细胞计数及活细胞百分率计算 1. 血细胞计数板及盖片备好；2. 9滴细胞悬液+1滴台盼蓝，混匀，置2-3min; 3. 悬液滴至计数板和盖片空隙中；4. 计数。五、注意事项：1. 细胞悬液应充分混匀；2. 吹打混匀细胞时不要产生气泡；3. 计数中，不要漏记，不要重复，每个细胞悬液至少滴样两次求平均值；4. 细胞计数板不可放干，需用完即冲。

（二）. 操作要点

1.接种工作需要在超净工作台内进行。接种前，用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。在操作过程中，为防止污染，每一步都需要在酒精灯附近进行。将肝细胞植入培养瓶前，要将瓶口用酒精灯稍烘烤一下。盖上盖前，也应在酒精灯上烘烤一下，防止污染。

2.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液，以后每48h换液一次并依次降低胎牛血清量至1%

（三）. 注意事项

1．根据组织类型选择适当的消化液。

2．控制消化时间，尽量减少细胞损伤。

3．尽快促进细胞贴壁，必要使用生长基质涂抹瓶壁，或先少量细胞悬液接种，培养3～5 h后，补足培养液。

4．适当提高细胞接种密度。

七、设计心得

在实验设计的整个实施过程中，我学会了怎样根据培养目的选定合适的材料，拟定培养方法，设计培养基。知道了如何在实验过程中发现问题、分析问题、解决问题。通过与同组人员的交流、合作，不仅顺利完成了课程设计，还培养了团队协作的能力。

通过此次课程设计，把所学过的动物细胞培养原理的知识强化，能够熟练地把课堂上的理论知识通过自己的设计在实验中表现出来，使模糊地概念具体化。

在本次设计中熟悉并掌握了用消化法进行小鼠肝细胞的培养和在接种时应注意的事项，无菌操作对生物实验的重要性！

八、参考资料

[1] 陈志南，细胞工程.科学出版社，2005

[2] 周欢敏，动物细胞工程学.中国农业出版社，2009

[3] 李志勇，细胞工程学.高等教育出版社，2008

[4] 安利国，细胞工程.科学出版社，2005