实验1 特殊显微镜的原理及其使用

II.相差显微镜的原理和使用 相差显微镜的原理和使用
一、实验目的
• 了解相差显微镜观察活细胞的基本原理； 了解相差显微镜观察活细胞的基本原理； • 了解相差显微镜的特殊组件和位置； 了解相差显微镜的特殊组件和位置； • 掌握调节相差显微镜的基本步骤。 掌握调节相差显微镜的基本步骤。
二、原理和结构特点
(A) bright-field microscopy.(B) phase-contrast microscopy (C) differential-interference-contrast microscopy. (D) dark-field microscopy.
• 5.用柯勒照明法调节聚光器：①将视场光阑关到 用柯勒照明法调节聚光器： 用柯勒照明法调节聚光器 最小； 用聚光器升降调节螺旋， 最小；②用聚光器升降调节螺旋，调节聚光器的 上下位置， 上下位置，直至在目镜中观察到视场光阑像的边 缘清楚；③调节聚光器的调中螺旋，使视场光阑 缘清楚； 调节聚光器的调中螺旋， 的像移至视场中央（调中聚光器）；④ 的像移至视场中央（调中聚光器）；④打开视场 ）； 光阑，使其边缘与目镜中的视场同样大小。 光阑，使其边缘与目镜中的视场同样大小。柯勒 照明是调好相差像的关键之一。 照明是调好相差像的关键之一。
三、实验步骤 1.样品制备：在一张无划痕、 1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一 样品制备 滴生理盐水， 滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表 皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀， 皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上盖 玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，镜检。 玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，镜检。 2.将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强照明光。 2.将暗视野聚光器安装在显微镜上，调强照明光。 将暗视野聚光器安装在显微镜上 3.在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升 在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。 在聚光器透镜的上表面滴上镜头油 聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。 聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只 有在油滴与载玻片的底面相接触后， 有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射 向标本。 向标本。 4.将标本置于载物台上，插入10x物镜，用调焦螺旋 4.将标本置于载物台上，插入10x物镜， 将标本置于载物台上 10x物镜 聚焦样品。 聚焦样品。
二、原理和结构特点
1.原理 1.原理
根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观 察被检物体的显微镜。 察被检物体的显微镜。 不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经 不让直射光线进入物镜的镜头， 过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。 过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。 能观察到明视野下看不到的极其微小的物体， 能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断 物质颗粒的存在与否。最高分辨率可达 物质颗粒的存在与否。最高分辨率可达0.004微米 微米 主要用于微小粒子、细菌形态、细菌记数， 主要用于微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本 观察等。 观察等。
2 .结构特点 结构特点 使用中央遮光板或暗 视野聚光器（ 视野聚光器（常用的是抛 物面聚光器）， ），使光源的 物面聚光器），使光源的 中央光束被阻挡。 中央光束被阻挡。不能由 下而上地通过标本进入物 从而使光线改变途径， 镜。从而使光线改变途径， 倾斜地照射在观察的标本 上，标本遇光发生反射或 散射， 散射，散射的光线投入物 镜内， 镜内，因而整个视野是黑 暗的。 暗的。
细胞生物学实验
生命科学学院 生物技术与工程实验中心
实验一 特殊显微镜的原理及其使用
I 暗视野显微镜
一、实验目的
• 了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理； 了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理； • 了解暗视野显微镜的特殊组件和位置； 了解暗视野显微镜的特殊组件和位置； • 掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。 掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。
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• 二、实验步骤 • 1.样品制备：在一张清洁无痕的载玻片上滴一滴生 样品制备： 样品制备 理盐水， 理盐水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许或用镊子撕 洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀， 洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀， 盖上清洁的盖玻片， 盖上清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片周围多余的 水分，用指甲油封片（或不封片）。 水分，用指甲油封片（或不封片）。 • 2.将10x相差物镜旋入光路。 将 相差物镜旋入光路。 相差物镜旋入光路 • 3.将相应于 将相应于10x相差物镜的相差聚光器的环状光阑 将相应于 相差物镜的相差聚光器的环状光阑 移入光路中，完全打开聚光器的孔径光阑。 移入光路中，完全打开聚光器的孔径光阑。 • 4.将样品置于载物台上，用聚焦螺旋聚焦样品。 将样品置于载物台上，用聚焦螺旋聚焦样品。 将样品置于载物台上
相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并 相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位， 且利用光的衍射和干涉现象， 且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅 差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以 明暗差），同时它还吸收部分直射光线， ），同时它还吸收部分直射光线 增大其明暗的反差。 增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未 染色标本。 染色标本。
2.1环状光阑 环状光阑 具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上， 具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上， 光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的， 光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并 有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。 有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。 在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。 在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。 2.2相板 相板 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域， 位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域， 直射光通过的部分叫“共轭面” 直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部 分叫“补偿面” 带有相板的物镜叫相差物镜， 分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常 字样标在物镜外壳上。 以“Ph”字样标在物镜外壳上。 字样标在物镜外壳上
1 原理 • 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位( ）、波长 上光的波动所能达到的位置)的不同。 上光的波动所能达到的位置)的不同。 • 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化， 能观察到， 能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道 理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结 而活细胞和未经染色的生物标本， 构的折射率和厚度略有不同，光波通过时， 构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并 不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相位差) 不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相位差)， 而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的， 而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显 微镜下难以观察到。 微镜下难以观察到。
2.结构特点 2.结构特点 • 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是： 环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜( 环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜(通 常标有PH的标记)代替普通物镜， PH的标记 常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合 轴调节用的望远镜。 轴调节用的望远镜。 • 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑， 们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。 们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。 • 相位板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光 相位板安装在物镜的后焦面处， 线的吸收膜和推迟相位的相位膜。 线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直 射光线或衍射光的相位以外， 射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度 发生变化的作用。 发生变化的作用。
• 6.观察物镜后焦面，调节仪器使聚光器中环状光阑的像和 观察物镜后焦面， 观察物镜后焦面 相差物镜中相板的圆环互相吻合， 相差物镜中相板的圆环互相吻合，这一步是调好相差最重 要的步骤。具体方法是：取下一个目镜， 要的步骤。具体方法是：取下一个目镜，插入一个聚焦望 远镜，转动望远镜的接目镜， 远镜，转动望远镜的接目镜，直到在望远镜中观察到清晰 的环状光阑（在聚光器中）和相板（在相差物镜中）的像。 的环状光阑（在聚光器中）和相板（在相差物镜中）的像。 如果环状光阑的明亮光圈与圆形相板不吻合，可以通过调 如果环状光阑的明亮光圈与圆形相板不吻合， 节聚光器上的调中螺旋使之吻合。调节吻合后， 节聚光器上的调中螺旋使之吻合。调节吻合后，取出聚焦 望远镜，插入目镜， 望远镜，插入目镜，就可在目镜中观察到一个清晰的口腔 上皮细胞的相差像。 上皮细胞的相差像。 • 7.如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍相差 如果换用高倍相差物镜观察， 如果换用高倍相差物镜观察 物镜的聚光器环状光阑进行观察。 物镜的聚光器环状光阑进行观察。