第八章 核酸分子杂交技术

第八章核酸分子杂交技术

主要用途：①核酸定性或定量检测；②基因克隆、突变及其表达研究；③疾病的临床诊断。

第一节核酸杂交概述及基本原理

一、核酸杂交概述

•1961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体；

•60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素(NC)膜上的DNA序列奠定了基础；

•70年代末期到80年代早期，分子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富；

•80年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高；

•90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、

检测效率低等不足。

核酸的结构：一级结构：核苷酸的排列循序，稳定键为磷酸二酯键；

二级结构：双螺旋结构，稳定键为氢键、碱基堆积力、疏水键；

高级结构：染色体

二、核酸变性

核酸变性(nucleic acid denaturation)：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构

的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。

•化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。

•化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。

DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。

如加热；极端的pH；有机试剂(甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等)

变性DNA的性质：变性能导致DNA的一些理化性质及生物学性质发生改变

①溶液黏度降低---DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性

结构，DNA黏度明显下降。

②溶液旋光性发生改变---变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。

③紫外吸收增加---DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强，双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸。变性DNA的增色效应

增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。

•DNA分子在250-280nm 波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。

•增色效应可以作为DNA变性的指标。

•不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20-30%之间。

解链曲线：通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度(A260)的增加来监测DNA变性的过程。如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型DNA变性曲线呈S型。

融解温度(Tm)：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。

Tm的特点：①爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时

的融化现象，故名融解温度。②狭窄性：变性温度范围很小。

Tm的影响因素：DNA分子大小和碱基的组成；溶液的离子强度；pH值；变性剂。

⑴DNA分子大小和碱基的组成：

不同来源DNA间的Tm存在差别，在溶剂相同的前提下，这种差别主要是由DNA本身

下列两方面的性质所造成的：DNA的均一性；DNA的(G+C)含量。

DNA的均一性有2种含义：

①DNA分子中碱基组成的均一性：如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天

然DNA比较，其Tm值范围就较窄。因前者变性时氢键断裂几乎可“齐同”进行。

②待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其Tm值范围较窄，若混

有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。

DNA的(G+C)含量：在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量，(G+C)含量越高，G-C碱基对越多，Tm值越高。因为G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱

基对只有2对氢键，DNA中(G+C)含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏G-C间氢键需

比A-T氢键付出更多的能量。

Tm与(G+C)含量的关系：Tm与DNA中(G+C)含量存在着密切相关性

Tm值与碱基对组成的经验公式：Tm = 69.3 +0.41(G+C)%

小于20bp的寡核苷酸的Tm计算公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)

⑵溶液的离子强度：离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽。这是由于

溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性。

⑶pH值：pH值影响氢键的形成。pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。

当溶液pH值小于4时或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性。

⑷变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。

常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等。

三、核酸复性

核酸复性(nucleic acid renaturation)：指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。

退火(annealing)：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。

核酸复性的影响因素：温度和时间；DNA浓度；DNA分子大小和复杂度；离子强度。

⑴温度和时间：一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复

性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低

温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的。

⑵DNA浓度：DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”，“成核”速度与DNA

浓度的平方成正比，溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。

⑶DNA分子大小和复杂度：DNA分子越大，复性速率越慢；DNA分子越复杂，复性速率也越慢。

⑷离子强度：增加盐浓度可加快互补链合成双链的速度，因为盐能中和DNA单链中磷酸基

团的负电荷，减少互补链静电排斥作用。

四、核酸分子杂交

核酸分子杂交(molecular hybridization)：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条

RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。

•杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性

•利用探针(probe)与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列