第八章 核酸分子杂交技术

第八章核酸分子杂交技术主要用途：①核酸定性或定量检测；②基因克隆、突变及其表达研究；③疾病的临床诊断。

第一节核酸杂交概述及基本原理一、核酸杂交概述•1961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体；•60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素(NC)膜上的DNA序列奠定了基础；•70年代末期到80年代早期，分子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富；•80年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高；•90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。

核酸的结构：一级结构：核苷酸的排列循序，稳定键为磷酸二酯键；二级结构：双螺旋结构，稳定键为氢键、碱基堆积力、疏水键；高级结构：染色体二、核酸变性核酸变性(nucleic acid denaturation)：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。

•化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。

•化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。

DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。

如加热；极端的pH；有机试剂(甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等)变性DNA的性质：变性能导致DNA的一些理化性质及生物学性质发生改变①溶液黏度降低---DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性结构，DNA黏度明显下降。

②溶液旋光性发生改变---变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。

③紫外吸收增加---DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强，双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸。

变性DNA的增色效应增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。

•DNA分子在250-280nm 波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。

•增色效应可以作为DNA变性的指标。

•不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20-30%之间。

解链曲线：通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度(A260)的增加来监测DNA变性的过程。

如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。

典型DNA变性曲线呈S型。

融解温度(Tm)：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。

Tm的特点：①爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时的融化现象，故名融解温度。

②狭窄性：变性温度范围很小。

Tm的影响因素：DNA分子大小和碱基的组成；溶液的离子强度；pH值；变性剂。

⑴DNA分子大小和碱基的组成：不同来源DNA间的Tm存在差别，在溶剂相同的前提下，这种差别主要是由DNA本身下列两方面的性质所造成的：DNA的均一性；DNA的(G+C)含量。

DNA的均一性有2种含义：①DNA分子中碱基组成的均一性：如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天然DNA比较，其Tm值范围就较窄。

因前者变性时氢键断裂几乎可“齐同”进行。

②待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其Tm值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。

DNA的(G+C)含量：在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量，(G+C)含量越高，G-C碱基对越多，Tm值越高。

因为G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对只有2对氢键，DNA中(G+C)含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量。

Tm与(G+C)含量的关系：Tm与DNA中(G+C)含量存在着密切相关性Tm值与碱基对组成的经验公式：Tm = 69.3 +0.41(G+C)%小于20bp的寡核苷酸的Tm计算公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)⑵溶液的离子强度：离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽。

这是由于溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性。

⑶pH值：pH值影响氢键的形成。

pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。

当溶液pH值小于4时或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性。

⑷变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。

常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等。

三、核酸复性核酸复性(nucleic acid renaturation)：指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。

退火(annealing)：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。

核酸复性的影响因素：温度和时间；DNA浓度；DNA分子大小和复杂度；离子强度。

⑴温度和时间：一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。

复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的。

⑵DNA浓度：DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”，“成核”速度与DNA浓度的平方成正比，溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。

⑶DNA分子大小和复杂度：DNA分子越大，复性速率越慢；DNA分子越复杂，复性速率也越慢。

⑷离子强度：增加盐浓度可加快互补链合成双链的速度，因为盐能中和DNA单链中磷酸基团的负电荷，减少互补链静电排斥作用。

四、核酸分子杂交核酸分子杂交(molecular hybridization)：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。

•杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性•利用探针(probe)与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列第二节核酸探针一、核酸探针的类型核酸探针(nucleic acid probe)：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。

选择探针的最基本的原则：①高度特异性；②探针的来源是否方便；③制备探针的难易程度。

核酸探针的类型：基因组DNA探针；cDNA探针；RNA探针；人工合成的寡核苷酸探针。

⑴基因组DNA探针：来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列制备方法：基因克隆的方法；聚合酶链反应(PCR)。

特点：①多克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽；②PCR制备探针简便和省时；③相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟。

⑵cDNA探针：是指与mRNA互补的DNA分子。

特点：不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。

⑶RNA探针：因为RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合，所以RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高。

另外RNA分子中不存在高度重复序列，因此会减少非特异性杂交少，杂交后可用RNA酶将未杂交的探针分子水解去除，降低本底的干扰。

但RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。

⑷寡核苷酸探针：特点：①根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点；②探针长度一般为10-50bp；③尤其适合点突变的检测④由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱，但经过精心设计仍可设计出非常特异的寡核苷酸探针。

设计原则：①探针长度，一般要求在10-50bp；②G/C含量为40％-60％；③探针分子中应避免互补序列；④避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或-CCCC-；⑤借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较；二、核酸探针的标记理想的探针标记物应具有以下特点：①检测物要灵敏、特异、稳定、简便；②标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值；③标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉；④标记物对检测方法无干扰。

根据标记物的特性，核酸的标记探针可分为放射性同位素标记和非放射性标记两大类。

⑴放射性同位素标记：常用标记探针的同位素有32P、35S、3H、125I。

32P：半衰期短(14.3d)，常用标记物为核苷三磷酸，释放的β粒子能量高，灵敏度很高，但分辨率不高。

35S：标记蛋氨酸及其取代核苷三磷酸的α位磷酸基中的氧，释放β粒子，灵敏度高，分辨率较高，核酸序列测定和原位杂交。

3H：半衰期长(4417d)，释放的β粒子能量低，使用较少。

125I：释放γ粒子，分辨率高，操作简单，安全防护要求较高，原位杂交。

同位素标记探针的优缺点：优点：检测灵敏度极高，10-14-10-18g，特异性强，对各种酶促反应几乎无影响，不影响碱基配对。

缺点：放射性污染，半衰期限制，高活性对核酸的破坏。

同位素标记探针的方法：①缺口平移法(双链)；②随机引物法(单链)；③DNA探针的末端标记法；④PCR标记DNA探针；⑤单向体外转录制备RNA探针。

DNA探针的末端标记---利用T4 DNA聚合酶标记3′- 端DNA探针PCR标记DNA探针---标记率高，重复性好，简便快速，可大量制备。

⑵非放射性标记：非放射性标记核酸探针的方法分为化学修饰标记法和酶促反应标记法。

•化学修饰法：简单、成本低、较通用。

•酶促反应标记法：灵敏度高，过程较复杂，成本较高。

常用的非放射标记物有辣根过氧化物酶、荧光素、生物素、光敏生物素、地高辛等。

①酶标记核酸探针：将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶(ALP)与变性后的DNA结合，生成酶标DNA分子。

其中辣根过氧化物酶(HRP)易进入细胞内部，便宜，易观察，应用最广泛。

常用标记方法是戊二醛交联法和过碘酸钠法。

②荧光素(fluorescein)：标记方法有直接法和间接法。

③生物素(biotin)标记核酸探针应用广泛，可替代同位素标记。

用链亲和素系统检测。

酶促标记法操作复杂，价格昂贵。

光敏生物素(photobiotin)标记方法简单，价格适宜。

④地高辛(DIG)：标记于dUTP上，通过随机引物或缺口平移法引入DNA分子中。

可长期保存，不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高，检测产物反差好，背景染色低。

广泛应用于Southern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交尤其是原位杂交。

三、标记探针的纯化和检测探针制备和标记时加入的dNTP是过量，除去游离标记物及其dNTP。