菌体理化性质鉴定试验

菌体理化性质鉴定试验

1 V-P试验

原理：菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

培养基配制方法：

蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl(K2PO4):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.0～7.2，分装试管，毎管装约4～5cm，115℃灭菌20min。

试剂：40%NaOH(或KOH)，a-萘酚。

试验方法：

将试验菌接种于上述培养基，于36±1°C培养4天、培养液 2.5ml先加入a萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

结果记录：阳性：+，阴性：- 。

2甲基红（Methyl Red）试验

原理：有些细菌能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

培养基配制方法：

与V-P试验培养基一致。

试剂：甲基红:0.1g，95%乙醇：300mL，蒸馏水：200mL。

试验方法：

挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3～5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1～2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阳性、即可判定结果。

结果记录：阳性：+，阴性：- 。

3 糖、醇发酵试验

原理：不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。

培养基配制：

一般细菌常用休和李夫森二氏培养基：

蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。

芽孢杆菌培养基配制：

(NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH 后再加指示剂。

将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm ，115℃灭菌20min。

测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、

D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。

注意：以上亦可用液体培养基。

接种和观察结果：

用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。

结果记录：

产酸：+，产气：○，不产酸长气：- 。

4.明胶（Gelatin）液化试验

原理：有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。

培养基配制方法：蛋白胨：5g，明胶：120g，蒸馏水：1000mL。PH:7.2～7.4，分装试管，毎管装约4～5cm，115℃灭菌20min。

试验方法：

挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。否则为阴性。

5尿酶（Urease）试验

原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。

培养基配制方法：

蛋白胨：1 g ；NaCl：5 g ；KH2PO4 ：2 g ；葡萄糖1 g ；琼脂：15 g；酚红：0.012g；蒸馏水1000 ml。

除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6.8～6.9，然后加入酚红指示剂，使培养基呈橙黄色，分装，115℃灭菌20min。待培养基冷至50℃左右，加入预先过滤除菌的20%尿素水溶液，使其终浓度为2%。

试验方法：

挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色为阳性。

6七叶苷试验（七叶灵试验）：

培养基：

牛肉膏：10g

七叶灵：5g

琼脂：20g

H2O：1000mL

pH: 自然

分装三角瓶，121℃灭菌30min。

另配5%FeCl3水溶液，单独灭菌。培养基融化后，先将每个平板加上FeCl3溶液二滴，然后倒培养基混匀，凝固后点接菌种，30℃培养2-3d观察。菌苔周围出现深褐色区者为阳性反应。

7苯丙氨酸脱氨酶试验培养基（/L):酵母膏3g,Na

2HPO

4

1g,DL一苯丙氨酸2g,

NaCl 5g,琼脂12g"

8鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶:蛋白胨5g,牛肉膏5g,D-葡萄糖0.5g维生素