第三章 核酸的生物有机化学 第五节 2013

开发的比较特殊的酰基保护基：三氟乙酰基(CF3CO-)、苯 氧乙酰基 (PhOCH2CO-)、甲氧基乙酰基(CH3OCH2CO-)，γ酮酰基和烯酮酰基等。即保护基能在不同条件下被除去， 具有比乙酰基更容易除去特性。
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可以用肼解方法除去
某些碳酸酯基也可以用于核糖羟基的保护。如氯甲
酸异丁酯(isobutyl chloroformate)可用于保护胸腺嘧啶
第五节 多聚核苷酸的合成 1. DNA的生物合成
DNA的生物合成，是DNA的复制过程。首先是 DNA双螺旋离解成两条DNA单链，再以DNA单链为
模板，合成一个新的DNA分子。
1958年，Kornberg A从大肠杆菌中分离出一种酶：
DNA聚合酶I(DNA polymerase I)，
它能够催化DNA的合成。这种酶是一个含有103个氨基酸 残基的多肽酶。
四氢吡喃醚对碱稳定。在核酸合成中，THP基主
要用于保护核糖的2'-OH。成功的保护2'-OH基，对于
RNA的合成具有非常重要的意义。
由2,3-二氢吡喃与糖羟基形成的THP醚有一个不对 称中心，因而存在两个光学异构体：
⑤ 2‘-和3’-羟基同时保护法：核糖的2‘-和3’-羟基处于顺 式位置，可以用异丙亚甲基同时进行保护。常用丙酮进
DNA聚合酶链式反应-参数
① 变性温度与时间：一般选择：94 ℃ ，30秒
② 退火温度与时间
取决于引物长度、浓度和G+C含量，一般选
择：Tm -5℃
③ 延伸温度与时间：一般选择：70℃∼75℃
④ 循环次数
取决于模板浓度，一般循环：30次
DNA聚合酶链式反应-原理
DNA聚合酶链式反应-原理
第一轮完成
DMT)或三苯甲基(trityl)常用来保护第一醇羟基(5'-OH)。
在温和条件下，仅有极少量的第二醇羟基或碱基上
的氨基与单甲氧基三苯甲基氯作用。
用80%的乙酸或吡啶-乙酸处理，即可以除去这类保护 基。
② 酰基：酸酐或酰氯在吡啶存在下，可以使核糖的第 一和第二醇羟基酰化。若碱基上同时存在有游离氨基， 也可以发生酰化。常用的酰基主要有：甲酰基、乙酰基、 苯甲酰基和氯乙酰基等。这些酰基在碱性条件下可以方 便地被除去。
是很重要的。用于磷酸保护的基团主要有以下几类。
① 甲酯基：
磷酸甲酯基最后可以 用加入硫粉方法除去
② 2,2,2-三氯乙基：
除去保护基方法主要是用金属锌除去
③ 芳基：它的保护机制与2,2,2-三氯乙基相似。芳
基保护基可以用 F－/OH－除去。
④ β-氰乙基：
反应完成后，氰乙基可以用温和的碱或F－离子除去。

常用酰基：乙酰，苯甲酰，异丁酰基，甲氧 苯甲酰基
O CH3 C
O Ph C
O CH3O C
O (CH3)2CHC
例如：用苯甲酰基保护腺嘌呤核苷中的氨基：
用苯甲酸酐酰化胞嘧啶核苷上的氨基可以直接
得到N-苯甲酰-胞嘧啶。在此反应条件下，糖上的羟
基不受影响。
酰基保护基通常用浓氨水或NaOH溶液水解除去。
聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）
DNA聚合酶链式反应—PCR
PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特 异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技 术。
The Nobel Prize in Chemistry in 1993
DNA聚合酶链式反应—PCR
行反应。核苷和丙酮在酸和去水剂(如2,2-二甲氧基丙烷
或原甲酸酯等)存在下反应，生成缩醛，从而对2'-OH 和3'-OH保护。由于缩醛对酸敏感，因此可以在酸性条
件下方便地除去。
苯甲酮、环己甲酮以及原酸酯等也可以代替丙酮用 于上述保护反应。
⑶ 磷酸酯基的保护：多聚核苷酸是由核苷酸通过3,5-磷
酸二酯键连接而成的链状分子。
DNA已经可以应用DNA自动合成仪很方便地进行合成。
DNA固相合成法的基本原理与多肽的固相合成法 相似。先将目标DNA链3'-端核苷酸的3'-OH与树脂(固
相)共价相连。然后将经过活化的单体核苷酸(不参加反
应基团必须保护)按设计的顺序依次加上去。
合成所应用的活化单体是质子化核苷3'-亚磷酰胺 (protonated phosphoramidite)：

1. 保护基
核苷酸的保护问题比氨基酸更为复杂。特别是 核糖中有两个化学性质几乎等价的基团(2'-OH和3'OH)的选择性保护，是一个非常困难的问题。

核糖核酸合成的保护基问题：必须区分化学 性质类似的2位羟基和3位羟基。
需要保护的基团包括：碱基中游离的氨基，糖
的羟基(2'-OH, 3'-OH, 5'-OH), 以及核苷酸的磷酰基 （磷酰基中的游离羟基 ) 。
核苷的5'-OH。
形成的酯在酸性条件下稳定，但可以在碱性条件被除去。
如果核糖的5'-OH基已经被保护，则这类碳酸酯基 也可用于2'-OH和3'-OH的保护。
③ 叔丁基二甲基硅烷基：用叔丁基二甲基硅烷基(tbutyl dimethylsilyl)保护核糖羟基具有很好的选择性， 并且不易发生异构化。胸腺嘧啶核苷和硅烷化试剂反应 及选择性如表3-3。
（3） 多聚核苷酸合成： 核苷酸在进一步反应之前，将磷酸酯中的一个游离羟基 加以保护。这样在核苷酸之间形成的磷酯桥实际上是一
个磷酸三酯。待全部聚合反应完成后，再除去磷酸根保
护基。这种方法解决了磷酸酯带负电荷的问题。此法常 用于合成相对分子质量大的多聚核苷酸。用于磷酸三酯
途径的偶联剂主要是TPS和MS。
A 82%
B 2%
C 4%
A 35%
B 6%
C 46%
A 73%
B 1%
C 15%
在适当的反应条件下，硅烷化反应主要发生在第一 醇羟基上。过量硅烷化试剂存在时，第二醇羟基也能发 生硅烷基化。对碱基上的氨基无明显作用。硅醚对碱和 肼稳定，对酸比较敏感。
5'-OH和2'-OH或 3'-OH的硅烷基化产物对酸的敏
碱基保护
碱基中游离氨基的保护：腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶
中含有游离的环外氨基。在磷酸化反应中可能生成 不需要的磷酰胺，必须事先进行保护。主要使用的 保护基有酰基、N, N-二甲氨亚甲基等。
酰基：氨基经酰化后降低了它的亲核性能，是保护
氨基最常用的一种方法。
两步法 :在氨基酰化过程中，除了氨基被酰化外，核苷 酸中核糖上的游离羟基也同时被酰化。因此在酰化后， 还必须选择性地脱去糖上的酰基。 A: 整个核苷的酰化（碱基上的氨基，糖上的羟基） B: 糖的脱酰（糖上的羟基） 一步法: 在适当的反应条件下只有碱基上的氨基酰化
感程度也不相同。叔丁基二甲基硅烷基与第一醇羟基形
成的硅醚在酸性条件下最容易除去。因此控制条件，可 以制备3'-或5'-硅醚。
5'-硅醚
3'-硅醚
80% CH3COOH 6h. 20 C
④ 四氢吡喃基：用四氢吡喃(tetrahydropyranyl,THP)保 护醇羟基是一个在有机合成中广泛应用的方法。该保护 基的引入和除去均在酸性条件下进行。
3 多聚核苷酸的化学合成 多聚核苷酸的化学合成，在理论上和实际应用上 都具有重要意义。例如，DNA遗传信息解析，DNA和
RNA结构特性研究，引子DNA的合成，基因工程的研
究，新的蛋白质合成等，都离不开应用人工合成的多 聚核苷酸。
多聚核苷酸的合成要面临的问题： 有序的连接 接保护基以防止副反应的发生 反应的高产率（保护，偶联，脱保护）
2,4,6-三甲基苯磺酰氯(mesity1enesu1fony1 chloride,
MS)、 2,4,6-三异丙基苯磺酰氯(triisopropyl benzene su1fonyl chloride, TPS)
应用磷酸三酯途径合成T-(3'→5')-T的反应过程如下：
3. DNA的固相合成法 在磷酸三酯途径合成法基础上发展了一种新的合成 法：DNA固相合成法(DNA solid phase synthesis)。现在
DNA聚合酶链式反应-原理
第二轮完成
第三轮完成
DNA聚合酶链式反应-原理
PCR技术的应用
遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的 产前检查 病原体的检查 法医和刑侦鉴定 癌基因的检查 基因探针的制备 基因组的测序、染色体巡视 cDNA库的构建 基因突变的分析和定位诱变 DNA重组 基因的分离和克隆
它能将脱氧核糖核苷酸单位一个一个地连接成DNA链。
从大肠杆菌中还发现了另外两种DNA聚合酶， 分别称为DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ。它们在功能上与Ⅰ略
有差别。
2. RNA的生物合成
RNA的基本功能是传递和表达DNA遗传信息。 所有RNA都是以DNA链为模板，在RNA聚合酶作用 下合成的，RNA 合成过程又称为转录 (transcription)。 从大肠杆菌分离得到的RNA聚合酶(RNA polymerase)，可以在一定的条件下，催化合成RNA链。 DNA除了作为模板指导RNA的合成外，还存在 一些特殊区域（一定的碱基顺序），作为RNA转录 的起始或终结指令。
磷酸是一个三元酸，因此在多聚核苷酸的磷酸酯基 中，仍然存在一个游离的酸性羟基。在核酸化学合成的
条件下，这种酸性的羟基通常以离解方式存在，形成带
负电荷的亲核中心。 这种亲核中心可能导致副反应的发生，并使合成的核酸 分子极性增大，给产品的分离和纯化带来许多困难。因
此，在核酸合成过程中，对游离的磷酸羟基进行保护也
苯甲酰基也可以用肼水解除去。而在此条件下，核 糖上的酰基仍可保留。
另一种常用的保护基是异丁氧羰基(isobutyloxycarbonyl)
应用此保护基的优点是形成的酰胺键比较耐肼解，而 容易被浓氨水除去。
⑵ 糖羟基的保护：脱氧核糖上有两个羟基(3'-OH和5'-
OH)，而核糖则有三个羟基(2'-OH, 3'-OH和5'-OH), 在
核糖5'-OH的保护基为双甲氧基三苯甲基DMT。
亚磷酸
合成过程：
合成过程：
合成反应中，链增长反应的第一步是将保护基
DMT脱去，使5'-OH基游离出来，作为循环加成反应的
起点。第二步，加入活化的单体protonated phospho ramidite, 通过偶联形成一个磷酸三酯。活化的单体中，
多聚核苷酸合成过程中，必须选择性地引进或脱去保护 基。因此对核糖羟基保护基的选择性就显得特别重要。
区分：核糖上的羟基 2‘－OH与3’－OH； 伯羟基与仲羟基5‘－OH与2’,3’-OH

① 甲氧基三苯甲基：单甲氧基三苯甲基(p-methoxytri-
ty1，MMT)、双甲氧基三苯甲基(di-p-methoxytrityl,
不参加反应的5'-OH和碱基上的氨基必须事先进行保护。
偶联反应必须在无水条件下进行，因为水可以和磷酰亚 氨基作用。反应的第三步是将亚磷酸三酯氧化，转变成
磷酸三酯。每一步反应后，过量的试剂和副产物可以很
容易被洗去。不断重复上述三步反应，直至反应完成
合成反应完成后，先除去磷酸的保护基(-OCH3), 脱 去所有碱基保护基，最后将DNA链从树脂上解脱下来。 由于链增长反应不可能100%完全，所以得到的产 物实际上是一种链长不等的混合物。其中最长的一种是 目标DNA链。用高效液相色谱可以将不同长度的DNA 链分开。 目前这种合成方法只适用于DNA的合成