2019免疫学进展2 共49页

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疫苗效果的病例对照研究

ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｋｉｎａｓｅ１ｉｎ
２２３２.
ｈｕｍａｎｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ[ Ｊ] . ＥｕｒＲｅｖＭｅｄＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉꎬ ２０１７ꎬ
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２１(２４) : ５６２４￣５６２９.
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ＢｉｏｌＭｅｄꎬ ２０１５ꎬ ２４０(７) : ９２５￣９３５.
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免疫细胞与外泌体相互作用机制的研究进展

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2019.22.024免疫细胞与外泌体相互作用机制的研究进展①刘满宇　付　璐　张文慧　张林波　(吉林农业大学生命科学学院,长春130118) 中图分类号　R392.1 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2019)22⁃2806⁃07①本文受吉林省科技发展计划项目(No.20180101264JC)资助㊂作者简介:刘满宇,男,在读硕士,主要从事病原微生物与分子免疫学方面研究,E⁃mail:925772882@㊂通讯作者及指导教师:张林波,男,博士,教授,主要从事分子病原微生物学与免疫学方面研究,E⁃mail:cczlb @㊂[摘　要]　免疫细胞是机体免疫系统的重要组成部分,免疫细胞与免疫细胞间或免疫细胞与其他细胞间的相互作用受到精细调控,进而保证机体免疫功能正常发挥作用㊂外泌体作为一种体内信息运输载体,因其具有直接将物质传递至细胞内的特性,受到研究者们的广泛关注,其在机体免疫调控过程中的作用被逐步揭示㊂研究发现,不同细胞来源的外泌体可以作用于免疫细胞,影响其功能,而免疫细胞自身也可以产生外泌体,调节相应细胞的功能㊂但由于免疫细胞种类和外泌体来源的多样性,具体作用方式和调控机制不尽相同㊂本文拟从外泌体与免疫细胞相互作用的角度对外泌体免疫调控相关机制进行综述,以期进一步揭示外泌体的免疫调节作用并为其在疫苗㊁制药㊁生物治疗等相关领域的应用及产品开发提供参考㊂[关键词]　外泌体;巨噬细胞;T 细胞;B 细胞;树突状细胞;NK 细胞Progress in mechanism of interaction between immune cells and exosomesLIU Man⁃Yu ,FU Lu ,ZHANG Wen⁃Hui ,ZHANG Lin⁃Bo .School of Life Sciences ,Jilin Agricultural University ,Changchun 130118,China[Abstract ]　Immune cells are an important part of the immune system.The interactions between immune cells or between immune cells and other cells are carefully regulated to ensure the normal function of the immune cells.As an information transport carrier in vivo,exosomes is widely investigated by researchers due to its ability to transfer substances directly into cells.Its role in the process of immune regulation has been gradually revealed.Some researches found that exosomes from different cells can act on immune cells and affect their functions,what is more immune cells themselves can produce exosomes and regulate the function of corresponding cells.However,due to the diversity of immune cell types and differeciation of exosomes sources,the mechanisms of their action and regulation effect are different.In this review,the mechanism related to the immune regulation between exosomes and immune cells is il⁃lustrated,in order to further reveal the immune regulation effect of exosomes and provide reference for the application and product devel⁃opment in vaccine,pharmaceutics,biotherapy and other related fields.[Key words ]　Exosomes;Macrophage cell;T cell;B cell;Dendritic cell;NK cell 外泌体作为一种功能广泛的胞内囊泡,与免疫细胞的多种功能有着密切联系㊂但外泌体在免疫细胞间及免疫细胞与其他细胞间如何发挥作用,以及外泌体的作用与机体免疫应答之间存在何种联系,目前尚未完全阐明㊂探究外泌体对免疫细胞的影响及在免疫过程中的作用,对于进一步揭示免疫系统功能及其运作方式具有重要意义㊂1　外泌体的形成机制及主要作用外泌体(Exosome)是一种由磷脂双分子膜与包裹在膜中的蛋白质㊁核酸㊁脂类㊁糖类等物质构成的囊泡样结构,直径在30~100nm 之间㊂20世纪80年代首次被发现于羊网织红细胞的培养液中㊂一般认为,外泌体起源于细胞内的多囊体(Multivesicular body,MVB),在ESCRT 复合物㊁脂质和四跨膜蛋白超家族等多种分子的参与下成熟,并在RAB 蛋白家族的参与下与质膜融合,进而释放到细胞外环境中(图1),这一融合过程也可能与SNAREs 蛋白有关㊂近年来的研究表明,免疫细胞㊁肿瘤细胞㊁干细胞㊁上皮细胞等细胞均能够产生外泌体㊂这些外泌体能对巨噬细胞㊁树突状细胞(Dendritic cell,DC)㊁T 淋巴细胞㊁B 淋巴细胞㊁自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK cell)等免疫细胞进行调控㊂同时免疫细胞也能产生外泌体参与免疫应答(图2),发挥抗原递呈㊁免疫激活㊁细胞杀伤及调节代谢等众多作用㊂2　不同来源外泌体对免疫细胞的作用目前的研究表明,来自肿瘤细胞㊁干细胞以及一些受到外源刺激的免疫细胞和组织细胞分泌的外泌体能够靶向刺激免疫细胞,对免疫系统的功能进行图1　细胞内外泌体产生和分泌的机制[1]Fig.1　Mechanism of production and secretion of cell internal and external secretory bodies [1]Note:ESCRT.Endosomal sorting complex required for transport;SNAREs.Soluble NSF⁃attachment proteinreceptor.图2　外泌体与DC 的相互作用[2,3]Fig.2　Interaction between exosome and DC [2,3]Note:A.The stimulatory effect of tumor⁃derived exosomes to DC;B.Themechanism of DC regulating immune response through exosomes.调控㊂同时,不同免疫细胞之间也会通过外泌体来协调免疫过程,这些外泌体对免疫细胞所引发的免疫调控机制也是免疫应答中的重要组成部分㊂2.1　外泌体影响巨噬细胞的极化　巨噬细胞作为非特异性免疫的重要组成部分,既是非特异性免疫的执行者,也是免疫信号的重要传递者㊂一般认为,在不同细胞因子的刺激下,组织内巨噬细胞可极化为M1和M2两种亚群,分别起到介导炎症反应和抑制炎症的作用㊂随着研究的深入,人们发现外泌体对巨噬细胞的功能调控主要通过控制其极化来实现㊂而let⁃7b /tLR 4通路可能是外泌体诱导巨噬细胞极化的重要方式[4]㊂体外实验发现,来自抗原递呈细胞的外泌体通过携带的脂多糖等抗原物质诱导极化[5];肿瘤细胞释放的外泌体中则携带有血小板反应素1,能够激活巨噬细胞并使其向M1型极化[6]㊂小鼠的背根神经节感觉神经元在外周轴突损伤后,会释放miR⁃21⁃5p 过表达的外泌体,来促进巨噬细胞的M1极化[7]㊂能够促进巨噬细胞M2极化的外泌体也有许多㊂人脐带间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)能通过外泌体作用于体外培养的骨髓来源巨噬细胞,诱导其从M1型极化到M2型并下调炎症因子的释放,以利于脊髓损伤后的修复[8];受到脂多糖刺激的MSC 分泌的外泌体对大鼠巨噬细胞的调节作用更为明显,能够促进大鼠的创伤愈合[4]㊂在小鼠体内肿瘤细胞的上皮间充质转换过程中会释放含有miR⁃21的外泌体,诱导巨噬细胞的M2极化[9]㊂此外肿瘤细胞也可以通过GP130/STAT3[10]㊁PTEN /PI3Kγ[11]等信号通路来促进极化㊂另外的一些研究表明,小鼠的脂肪干细胞可能通过miR⁃30D⁃5P 在体内刺激巨噬细胞的M2极化作用[12]㊂在体外实验中,来自氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞中的外泌体可利用携带的转移相关肺腺癌转录本1促进M2巨噬细胞极化,这可能与动脉粥样硬化发生有关[13];暴露在酒精中的单核细胞释放的外泌体利用携带的miR⁃27a 与初始单核细胞沟通,诱导其极化为M2型巨噬细胞[14]㊂这些研究表明,促进巨噬细胞向M1型极化的外泌体主要来源于抗原递呈细胞㊁肿瘤细胞和神经元细胞等㊂而诱导巨噬细胞向M2方向极化的外泌体可来自MSC㊁肿瘤细胞㊁脂肪干细胞㊁上皮细胞和酒精处理过的单核细胞等㊂这些外泌体促进极化的作用与其携带的miRNA 有着密切的关系㊂2.2　外泌体对T 细胞分化与功能调控的影响　T 细胞作为免疫系统的重要组成部分,一方面是免疫信息传递的重要环节,另一方面也能直接发挥免疫杀伤效应㊂T 细胞包括众多亚群,如细胞毒性T 细胞(Cytotoxic T⁃lymphocyte,CTL)㊁抑制性T 细胞(Suppressor T cell,Ts)㊁调节性T 细胞(Regulatory T cell,Treg)和辅助性T 细胞(Helper T cell,Th)等㊂这些亚群分化自T 原细胞,其可在外泌体的刺激下分化成相应的功能性T 细胞㊂研究表明,小鼠体内MSC 来源的外泌体能诱导T 原细胞向Treg 的分化,这一过程依赖抗原呈递细胞的存在[15];DC 来源的外泌体能够刺激T 原细胞PI3K /mTOR 轴影响其分化,进而控制Treg 和Th17细胞的平衡[16];受到致病菌刺激的上皮细胞也能够通过外泌体促进Th17的增殖,进而促进结肠肿瘤生长[17]㊂从小鼠肥大细胞培养液中提取的外泌体可增强CD4+T 细胞向Th2细胞分化[18]㊂在癌症患者体内提取的肿瘤细胞中衍生的外泌体能够体外调节T 细胞产生细胞因子,并下调活化T 细胞中CD3ζ与JAK3的表达,通过Fas /FasL(Fas 配体)诱导活化的CD8+T 细胞凋亡[19];也可通过影响Th1和Th17的分化与促进Treg产生来损伤T细胞功能[20]㊂外泌体除参与T细胞分化外,也与T细胞功能调控有关㊂肿瘤细胞与DC来源的外泌体能够介导抗原特异性T细胞活化和免疫活性改变[21]㊂被肿瘤细胞激活的DC产生的外泌体,能在小鼠体内以MHCⅠ依赖的方式促进CTL活化,使CD8+T细胞分化为CTL效应细胞,产生T细胞依赖性抗肿瘤免疫[22,23];卵清白蛋白(OVA)特异性T细胞分泌的外泌体能够抑制小鼠体内OVA激活的树突状细胞,刺激CD8+CTL反应,进而抑制抗肿瘤免疫[24]㊂在一些体外实验中发现,肿瘤细胞来源外泌体还会导致Treg强烈和持续地生成肌苷[25],并通过调控TGF⁃β和IL⁃10表达,来提高Treg的增殖能力,从而增加其对细胞凋亡的抗性[26,27]㊂Treg能将miRNA转移到Th1中,抑制Th1增殖和细胞因子分泌[28]㊂此外,肿瘤来源外泌体还能够改变CD4+或CD8+T细胞的炎性因子表达[20]㊂从这些研究中我们可以看出,T细胞的分化可受到来自MSC㊁DC㊁肿瘤细胞㊁肥大细胞㊁上皮细胞等多种来源外泌体的影响㊂同时,来自肿瘤细胞㊁DC㊁Treg和被激活的T细胞能够调控受体T细胞的状态,包括调节细胞活性㊁CTL反应及改变细胞因子表达等㊂2.3　外泌体对B细胞状态与功能的影响　作为机体免疫中重要的效应细胞,B细胞的细胞膜表面带有多种类型的受体,在体液免疫过程中,B细胞能够分化为浆细胞,并分泌特异性抗体㊂有研究显示,外泌体能通过淋巴管迅速地从周边传输到淋巴结,而淋巴结中的B细胞则是外泌体的主要摄取者之一[29]㊂在体外共培养条件下,MSC细胞衍生的外泌体能够抑制B细胞的炎症作用,并影响B细胞的分化[30];骨髓基质细胞来源外泌体也可抑制慢性淋巴细胞白血病B细胞的自发凋亡,并增强其耐药性和迁移能力[31];而DC来源的外泌体也能够通过补体激活和抗原穿梭的方式参与介导T细胞和B细胞的激活,诱导抗肿瘤免疫[32]㊂肿瘤细胞来源的外泌体能够通过脂质筏/胆固醇内吞途径来刺激人B细胞[33],并增强B细胞的增殖与向浆细胞的分化[34]㊂而当B细胞受到病毒的侵染时,外泌体还会作为载体,调控B细胞的状态并参与物质运输㊂如EB 病毒感染的B细胞能够被人口腔上皮细胞分泌的富含miR⁃200家族成员的外泌体触发激活,并促进B细胞与口腔上皮细胞间的病毒交换[35]㊂通过这些研究可知,来自MSC㊁DC㊁肿瘤细胞㊁上皮细胞等细胞的外泌体能够改变B细胞的分化㊁激活㊁增殖和凋亡,并影响其耐药性和迁移能力㊂2.4　外泌体对树突状细胞调控和表达的影响　树突状细胞(DC)分为髓样DC和淋巴样DC,是一种功能强大的抗原递呈细胞,与肿瘤的产生和发展有着紧密联系㊂在这一过程中,外泌体的作用也不容忽视㊂小鼠体内的肿瘤细胞能够分泌携带肿瘤抗原㊁LAMP1㊁OVA和pMHCⅠ等分子的外泌体,并转移到DC中,引发DC的抗肿瘤免疫[22,36]㊂而DC的抗肿瘤免疫过程也是通过外泌体实现的㊂胰腺癌细胞株的体外实验发现肿瘤细胞外泌体能够将miRNA转移到DC中,改变DC的miRNA表达并抑制调节因子X相关蛋白(rFXAP)产生,这可能是导致MHCⅡ分子抑制和免疫耐受的原因[37];同来源的外泌体也能下调DC中的TLR4和下游细胞因子[38]㊂此外,DC也可以接受来自B细胞的外泌体并调控T细胞的分化;T细胞能够利用携带含有基因组或线粒体DNA的外泌体,通过cGAS/STING胞质DNA传感通路与IRF3依赖性干扰素调节基因的表达,诱导DC的抗病毒反应[39]㊂以上研究表明,DC能够被来自肿瘤细胞和其他免疫细胞的外泌体调控㊂这些外泌体能通过传递抗原㊁miRNA等多种物质,影响DC的增殖㊁活化以及细胞因子和miRNA的表达㊂2.5　外泌体对NK细胞肿瘤杀伤作用的影响　自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)是先天免疫细胞,其在机体防御的第一线尤其是肿瘤杀伤过程中起关键作用㊂而外泌体可显著影响NK细胞杀伤作用㊂众多体外实验表明,肿瘤细胞来源外泌体可通过携带的IL⁃15㊁IL⁃18等细胞因子以及4⁃1BBL蛋白类似物,促进NK细胞的活化与增殖,增强其敏感性与抗肿瘤效力[40,41];也可携带NF⁃κB⁃α激活激酶相关蛋白1(NAP⁃1),通过增加NK细胞中干扰素调节因子3(IRF⁃3)的表达及其磷酸化,来提升Ⅰ型干扰素基因和趋化因子配体基因的表达,促进NK细胞的功能[42]㊂而这些外泌体携带的TGFβ1,能够下调NK细胞NKG2D受体表达,诱导NK细胞中Smad 磷酸化[19];或利用miR210和miR⁃23α等miRNA,直接影响NK细胞中CD107a和IFNg的表达,降低其细胞毒性与抗肿瘤活性[43];肿瘤来源外泌体还能抑制NK细胞活化受体表达,来降低NK细胞的肿瘤杀伤作用[40]㊂DC则通过分泌表达白细胞介素⁃15Ra和NKG2D配体的外泌体,直接参与IL⁃15Ra与NKG2D依赖的NK细胞增殖和活化,促进分泌IFNc[44]㊂由此可见,NK细胞能够受到肿瘤细胞和DC来源的外泌体调控㊂其中肿瘤细胞来源的外泌体能起到双向调控的作用㊂一方面,这些外泌体能够激活NK细胞,促进其增殖,并提高对肿瘤细胞的杀伤;另一方面,也可通过抑制细胞毒性而逃避免疫监视㊂而DC来源的外泌体主要对NK细胞起到激活作用,并促进NK细胞的增殖㊂3　免疫细胞来源外泌体对其他细胞的功能外泌体除了能调控免疫细胞功能外,还是免疫细胞功能调控的执行者㊂免疫细胞来源的外泌体能够调控包括免疫细胞㊁上皮细胞㊁肿瘤细胞等多种受体细胞并改变微环境㊂进而对整个免疫应答造成影响㊂3.1　巨噬细胞来源外泌体在机体免疫应答及调控过程中的作用　作为非特异性免疫的重要效应细胞和抗原呈递细胞,巨噬细胞也可利用外泌体释放信号㊂这些信号随着其所在微环境和受到刺激的不同而改变,当受到结核分枝杆菌㊁沙门氏菌㊁弓形虫㊁艾滋病毒等病原体的感染和一些外来抗原的刺激时,巨噬细胞释放的外泌体能携带病原体相关的分子模式受体(PAMPs)[45],同时会导致外泌体中miRNA 的种类与含量发生变化[46]㊂一些体外实验表明,从鼠伤寒沙门氏菌感染的巨噬细胞中分泌的促炎外泌体能触发幼稚巨噬细胞和DC Toll样受体4依赖性的TNF⁃α释放,以及其他多种细胞因子的分泌,这可能与外泌体中包含的LPS有关[47];而LPS对巨噬细胞的激活也能通过影响其释放的外泌体中miRNA与蛋白表达,引起脂肪细胞基因表达的改变㊂这些变化与补体活化㊁活性氧种类调节㊁白细胞迁移与活化㊁单核细胞趋化等炎症反应有关,也对碳水化合物的分解代谢和细胞活化产生影响[48]㊂同时在利用病原菌感染小鼠的研究中发现,有的病原菌如结核分枝杆菌,其感染的巨噬细胞能够通过外泌体的途径呈递抗原,并能协同ATP促进MHC⁃Ⅱ的释放,通过外泌体向T细胞表达抗原肽,这在促进T细胞免疫的过程中起重要作用[49,50];而在病原体的刺激下,巨噬细胞产生的外泌体能够促进TNF⁃α和IL⁃12的产生以及中性粒细胞和巨噬细胞的募集,这可能是免疫激活的一部分[45]㊂关于巨噬细胞来源外泌体对上皮细胞的影响,体外实验结果表明,巨噬细胞释放的外泌体能够刺激内皮细胞中的整合素向溶酶体转运,诱导整合素蛋白降解,进而对内皮细胞的迁移起到负调节作用[51];在LPS诱导的脓毒性肺损伤小鼠模型中,被LPS激活的巨噬细胞释放的外泌体中,促炎性miRNA(miRNA⁃155㊁miRNA⁃146a)表达上调,使上皮细胞中的促炎介质TNF⁃α与IL⁃6表达增加,进而破坏支气管上皮细胞紧密连接蛋白的表达,对肺部的结构屏障造成破坏[52]㊂有研究者尝试在体外将巨噬细胞来源的外泌体作为载体承载miRNA抑制剂,发现其能够调控肿瘤细胞中的miRNA表达水平[53]㊂这可能会成为肿瘤治疗的一种新方式㊂以上结果表明,巨噬细胞来源的外泌体能作用于其他免疫细胞㊁脂肪细胞㊁上皮细胞与肿瘤细胞,发挥着抗原呈递㊁免疫调节及代谢调控等作用㊂3.2　T细胞来源外泌体的肿瘤杀伤及免疫激活作用　在T细胞中,外泌体的释放受到二酰基甘油和二酰基甘油激酶(Diacylglycerol kinaseα,DGKα)的调节,DGKα能够调控PKD1/2的亚细胞定位与激活,PKD1/2是外泌体分泌的关键调节分子,介导DGKα对外泌体分泌通道的影响[39]㊂而这些外泌体在体外能够发挥多种作用㊂大鼠体内OVA抗原特异性的T细胞外泌体能够抑制DC对CD8+T细胞的刺激,进而抑制DC介导的大鼠CD8+CTL糖尿病和抗肿瘤免疫[24]㊂而在小鼠体内,Treg来源的外泌体还能将miRNA转移到Th1细胞中,抑制Th1细胞增殖和细胞因子分泌[28]㊂体外实验表明,CTL能通过外泌体来释放TNF超家族,诱导肿瘤细胞死亡[54]㊂在脾和淋巴结部位衍生的Ts则能分泌抑制性外泌体,调节免疫炎症反应外周组织部位抗原递呈细胞和效应T细胞功能[55]㊂受到LPS刺激的Treg衍生的外泌体能携带miR1505p和miR⁃142⁃3p调控DC,使IL⁃10过表达并抑制IL⁃6表达来抑制免疫反应,这可能有助于治疗自身免疫性疾病[56]㊂而在受到腺病毒基因刺激时,Treg会分泌含有独特的miRNAs和iNOS分子的外泌体㊂其能诱导细胞凋亡,并促进T细胞向Treg的转化[57]㊂通过这些研究可知,T细胞来源外泌体能够作用于DC㊁肿瘤细胞㊁抗原递呈细胞和其他T细胞,其功能包括激活T淋巴细胞介导的细胞毒性和杀伤作用以及多种免疫调节过程㊂3.3　B细胞来源外泌体对免疫细胞的作用　与T 细胞类似,在B细胞内MVB成熟和外泌体分泌的过程中,PKD1/2蛋白扮演着关键调节因子的角色[58],能够影响细胞功能并造成微环境的改变㊂体外研究表明,这些外泌体能够传递miRNA⁃155来抑制肝细胞中丙肝病毒的活性[59],还能携带过敏原衍生肽以诱导T细胞增殖和Th2样细胞因子的产生[60]㊂而一些病毒对B细胞的感染也会改变其外泌体成分与功能,使之对细胞代谢产生影响,进而改变肿瘤微环境[61]㊂同时,B细胞外泌体能在小鼠体内激活特异性T淋巴细胞㊁诱导体内的细胞毒性反应[62]㊂B细胞淋巴瘤是一组淋巴组织的恶性肿瘤,其特征为B淋巴细胞的恶性转化㊂B细胞淋巴瘤细胞来源的外泌体在肿瘤发生过程中起双重作用㊂一方面,来自肿瘤细胞的外泌体能将肿瘤抗原和MHCⅠ类分子传递给树突状细胞,然后通过诱导CD8+T细胞依赖性的抗肿瘤免疫应答,直接抑制恶性肿瘤的发生[63];而另一方面也能诱导免疫细胞的凋亡,并通过抑制NKG2D受体介导的细胞毒性,从而损害NK细胞功能[64]㊂对外泌体在B细胞淋巴瘤中的作用研究,为淋巴瘤的抑制和治疗提供了新思路㊂通过对这些研究的总结可知,来自B细胞的外泌体可以作用于肝细胞㊁T细胞㊁DC及NK细胞,影响细胞的激活㊁代谢与凋亡㊂3.4　树突状细胞来源的外泌体及其功能　DC来源的外泌体主要通过激活其他免疫细胞来发挥功能,作为免疫调节的一种重要途径,能够在细菌㊁寄生虫㊁病毒的感染和抗肿瘤过程中发挥作用㊂通过对小鼠的研究发现,被肿瘤激活的DC释放的外泌体,在体外和体内均能刺激CD8T细胞增殖,并传递抗原物质与功能性MHC⁃肽复合物,有效地诱导特异性CTL反应㊁抗肿瘤免疫和CD8T细胞记忆[36,65];而在寄生虫感染过程中,受到抗原刺激的DC能够通过外泌体的方式抵抗炎症反应[66]㊂同时,DC来源的外泌体能利用功能性IL⁃15与NKG2D配体直接介导NK细胞的活化[45],或通过携带TNF超家族配体激活NK细胞TNF⁃γ的分泌,并能在肿瘤细胞表面表达TNF㊁FasL和TRAIL,从而触发肿瘤细胞Caspase的活化和凋亡[67]㊂体外研究则表明,DC来源的外泌体也能够促使NK细胞的增殖与分泌IFNc,抑制肿瘤的转移[68];还能与细菌Toll样受体配体结合,对未活化的DC有着强烈的激活作用[69]㊂此外,DC来源的外泌体也会帮助病原体入侵机体㊂HIV⁃1会通过刺激树突状细胞免疫受体,来抑制外泌体从DC中释放,并改变外泌体内容物的成分,使之富含促凋亡分子DAP⁃3,以增加CD4+T淋巴细胞的凋亡[70]㊂此外,DC来源的外泌体也可能与朊病毒的体内传播有关[71]㊂DC来源的外泌体能对T细胞㊁B细胞㊁NK细胞以及未激活的DC起作用,其作用包括参与免疫激活㊁免疫调控与抗肿瘤作用㊂DC来源外泌体功能的多样性也为研究者们提供了靶向给药的新思路㊂3.5　NK细胞来源外泌体的抗肿瘤作用　NK细胞的杀伤作用主要有两种机制:①释放穿孔素和颗粒酶,通过增加凋亡小体的形成和caspase⁃3激活而诱导内在凋亡途径;②涉及caspase⁃8a的外源性凋亡途径㊂NK细胞主要通过表达FasL和穿孔素等杀伤蛋白发挥细胞毒性作用,参与抗肿瘤和免疫稳态的调节㊂而NK细胞在静息和激活条件下都会释放出外泌体,能够作为FasL㊁颗粒酶B㊁穿孔素与TNF⁃α的载体,将其分泌到细胞外[72,73]㊂同时体外实验表明,这些外泌体能携带NK细胞的标记蛋白CD56,可能参与促进外泌体与靶细胞的黏附,对不同的肿瘤靶细胞和活化的免疫细胞发挥细胞毒活性[74]㊂NK细胞分泌的携带TNF⁃α的外泌体还能够在肿瘤处特异性聚集,在体外和体内均对胶质母细胞瘤细胞有靶向和抗肿瘤作用[72]㊂并且NK细胞也会利用外泌体来激活其他NK细胞的活性,并传递杀伤物质㊂根据目前的报道,NK细胞作为杀伤肿瘤的重要细胞,其分泌的外泌体主要作用包括向肿瘤细胞靶向传递杀伤物质以及免疫激活,发挥抗肿瘤功能㊂4　展望外泌体作为一种广泛存在于细胞间的信息传递方式,由于其迅速和直接跨膜的特性而受到广泛关注㊂随着研究的深入,外泌体在免疫细胞应答过程中的作用逐渐被揭示㊂外泌体在免疫细胞与肿瘤细胞㊁干细胞㊁其他免疫细胞及一些组织细胞间的信息传递中发挥作用,调控机体免疫和肿瘤抵抗过程,其中也不乏双向调控的情况出现㊂此外,这些机制也与细胞代谢和干细胞分化有关㊂深入探讨外泌体的免疫调节方式及相关机制,对进一步完善对机体免疫过程的认识具有重要意义,也能够为相关研究提供参考㊂参考文献:[1]　Kowal 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人体寄生虫分子生物学与免疫学研究进展详解演示文稿

后进行的测定序列。
已经完成基因组测序的寄生虫包括恶性疟原虫、约氏疟原虫P. yoelii、马来布鲁线虫Brugia malayi、克氏锥虫T. cruzi、小隐孢子虫Cryptosporidium parvum及冈比亚按蚊Anopheles gambiae等的基因组全序列
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形虫、巴贝虫和艾美球虫，分类和临床诊断）等。在一些低等
的寄生原虫中,甚至没有成型的线粒体DNA,如某些阿米巴除了染色体DNA外,只有类似细菌质粒的环状 DNA和胞质DNA。
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基因组大小:寄生虫染色体基因组的大小差别较大,其中 ,微孢子虫Microsporidia基因组的大小不到10 Mb,在整个真核生物中最小;血吸虫基因组为270 Mb,相当于人
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枯氏锥虫——DNA复制和修复机器 ; 布氏锥虫——代谢的途径和一些细胞生物学 ; 硕大利什曼原虫——不寻常的基因表达等问题；
基因组都是单倍体，长度从25到55Mb大小不等；多数基因都以长且定向的聚集方式组合在一起，暗示主要是以多顺反子地形式进行转录，随后被切割成单独的mRNA分子。
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在三个基因组中很少发现表达转录因子的基
因存在，但高表达一些含有RNA结合基序的蛋白质。这些观察结果支持了先前的观点，就是锥虫基因表达的调控主要发生在转录后水平。
缺乏转录水平的精确调控带来了一个有趣的结果：
只有通过基因的复制或扩增来增加表达水平的提高。
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比较结果发现，绦虫存在特异的解毒途径，以及依赖宿主营养物质的代谢方式。确定了现有药物可能的作用靶点，为研发高效新疫苗和新药物提供理论支持，给有效预防和控制绦虫病带来新的希望。

2019年免疫学实验一抗,二抗的选择与搭配原则和方法.ppt

• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。
二抗的选择
• 1.一抗的种属来源二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，
• 2.二抗的种属来源一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。
【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】
在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择AntiIgG, F（ab’）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L）与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc 片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合。
一抗、二抗的选择
一抗的选择
• 1.分析实验应用类型 WB（Western Blot 免疫印迹） IHC （immunohistochemistry免疫组织化学） ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶联免疫吸附试验）

cxcr2基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定

基金项目:国家自然科学基金项目(８１８７１６９７)作者简介:张莉(１９９１－)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要研究重症机制及防治研究ꎮ通信作者:雷迎峰ꎬ副教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｌｅｉ＠ｆｍｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ侯立朝ꎬ博士生导师ꎬ教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:４５２７８４３６＠ｑｑ.ｃｏｍ论㊀著ｃｘｃｒ２基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定张莉１ꎬ刘永飞２ꎬ叶传涛３ꎬ边培育３ꎬ雷迎峰４ꎬ侯立朝１１.空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科ꎬ陕西西安７１００３２２.空军军医大学唐都医院麻醉科ꎬ陕西西安７１００３８３.空军军医大学唐都医院传染科ꎬ陕西西安７１００３８４.空军军医大学微生物学教研室ꎬ陕西西安７１００３２摘要:目的㊀构建小鼠ＣＸＣ型趋化因子受体２(ＣＸＣＲ２)基因ｃｘｃｒ２过表达的骨髓间充质干细胞(Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓ￣ｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌꎬＢＭＳＣ)并进行鉴定ꎮ方法㊀全骨髓贴壁法分离培养小鼠ＢＭＳＣꎬ采用流式细胞术检测干细胞抗原１(ｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ￣１ꎬＳＣＡ￣１)㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４３㊁ＣＤ４５㊁ＩＡ/ＩＥ表达率ꎬ并诱导成骨分化ꎮ以含有小鼠ｃｘｃｒ２的质粒为模版进行ＰＣＲ扩增ꎬ将获得的ｃｘｃｒ２克隆到慢病毒载体ꎬ命名为ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎻ将其与慢病毒包装质粒共转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎬ收获慢病毒后ꎬ通过离心法感染ＢＭＳＣꎬ经过１μｇ/ｍＬｚｅｏｃｉｎ压力选择建立了稳定表达ＣＸＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)ꎮ采用流式细胞术和ＲＴ￣ＰＣＲ分别检测其ＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平ꎬＴｒａｎｓｗｅｌｌ趋化实验检测其迁移能力ꎮ结果㊀９０％以上的第３代ＢＭＳＣ表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬ且成功诱导成骨分化ꎮ菌液ＰＣＲ㊁质粒双酶切后ꎬ琼脂糖凝胶电泳鉴定结果得到特异㊁大小正确的条带及测序鉴定正确ꎬ表明成功构建了ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ表达质粒ꎮ流式细胞术和ＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ的ＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平均明显高于对照组ＢＭＳＣꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮＴｒａｎｓｗｅｌｌ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ迁移能力高于对照组ＢＭＳＣꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ结论㊀利用慢病毒系统成功构建了稳定表达ＣＸＣＲ２的ＢＭ￣ＳＣꎬｃｘｃｒ２基因修饰ＢＭＳＣ后可明显增加ＢＭＳＣ的迁移能力ꎮ关键字:ＣＸＣ型趋化因子受体２ꎻ小鼠ꎻ骨髓间充质干细胞ꎻ细胞迁移中图分类号:Ｒ７８文献标志码:Ａ文章编号:１００５￣５６７３(２０１９)０１￣００１９￣０７ＤＯＩ:１０.１３３０９/ｊ.ｃｎｋｉ.ｐｍｉ.２０１９.０１.００４Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｇｅｎｅｉｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＺＨＡＮＧＬｉ∗ꎬＬＩＵＹｏｎｇ￣ｆｅｉꎬＹＥＣｈｕａｎ￣ｔａｏꎬＢｉａｎＰｅｉ￣ｙｕꎬＬＥＩＹｉｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＨＯＵＬｉ￣ｃｈａｏ∗ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙꎬＸｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌꎬＡｉｒＦｏｒｃｅＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＸｉ'ａｎ７１００３２ꎬＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ:ＬＥＩＹｉｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｌｅｉ＠ｆｍｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻＨＯＵＬｉ￣ｃｈａｏꎬＥ￣ｍａｉｌ:４５２７８４３６＠ｑｑ.ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣ)ｗｉｔｈｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｃｘｃｒ２ｇｅｎｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＢＭＳＣｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｗｈｏｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈ￣ｏｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ１(ＳＣＡ￣１)ꎬＣＤ４４ꎬＣＤ４３ꎬＣＤ４５ꎬＩＡ/ＩＥｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅ￣ｔｒｙꎬａｎｄｔｈｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄ.Ｔｈｅｃｘｃｒ２ｃＤＮＡｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｏｆｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｏｕｓｅｃｘｃｒ２ｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬａｎｄｎａｍｅｄａｓｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ.ＨＥＫ￣２９３Ｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｐａｃｋａｇｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｓａｎｄｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ.ＴｈｅＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＢＭＳＣｗｉｔｈｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺｖｉｒｕｓ.ＣＸＣＲ２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＴ￣ＰＣＲ.Ｔｈｅｍｉ￣ｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙＴｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉ￣ｍｅｎｔ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＣＤ４４ａｎｄＳＣＡ￣１ｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｏｖｅｒ９０％ｏｆｔｈｅｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＢＭＳＣｃｅｌｌｓꎬｂｕｔＩＡ/ＩＥꎬＣＤ３４ａｎｄＣＤ４５ｈａｒｄｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄꎬａｎｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｄｕｃｅｄ.ＡｆｔｅｒＰＣＲａｎｄｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｔｈｅａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｎｄｓｗｅｒｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｃｏｒｒｅｃｔ.ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓｉｄｅｎｔｉｃａｌꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺｐｌａｓｍｉｄｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃ￣ｔｅｄ.ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＴ￣ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣＸＣＲ２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌＢＭＳＣ.ＴｈｅｔｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗａｓａｐｐａｒｅｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌＢＭＳＣ(Ｐ<０.００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅＢＭＳＣｓｓｔａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＸＣＲ２ｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｓｙｓｔｅｍ.Ｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉ￣ｔｙｏｆＢＭＳＣ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２(ＣＸＣＲ２)ꎻＭｏｕｓｅꎻＢｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣ)ꎻＣｅｌｌｍｉｇｒａ￣ｔｉｏｎ㊀㊀间充质干细胞(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌꎬＭＳＣ)是一类具有自我增殖㊁多向分化潜能的成体干细胞[１]ꎮＭＳＣ具有很强的免疫调节功能ꎬ在免疫和炎症性疾病的治疗中具有良好的潜力[２－４]ꎮ鉴于ＭＳＣ移植后归巢靶组织的数量有限㊁产生的治疗性和抗炎分子效力不够强ꎬ最近多项研究对ＭＳＣ进行基因修饰ꎬ从而增加了ＭＳＣ的治疗效能[５－７]ꎮＣＸＣ型趋化因子受体２(ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２ꎬＣＸＣＲ２)属于Ｇ蛋白是偶联受体家族ꎬ是趋化因子ＣＸＣＬ１㊁ＣＸＣＬ２㊁ＣＸＣＬ３㊁ＣＸＣＬ５㊁ＣＸＣＬ６㊁ＣＸＣＬ７和ＣＸＣＬ８的配体[８]ꎮ趋化因子在炎症性疾病中广泛表达ꎬ趋化因子与趋化因子受体结合能调节中性粒细胞㊁单核细胞的迁移ꎬ将它们募集到炎症部位发挥相应的作用ꎮ研究通过构建ｃｘｃｒ２基因修饰的ＢＭＳＣꎬ并观察修饰后ＢＭＳＣ到达炎症部位的迁徙能力ꎬ为后续炎症性疾病的ＢＭＳＣ治疗策略奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀细胞与质粒㊀ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞株㊁Ｓｔｂｌ３感受态细胞㊁ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ㊁ｐＬｅｎｔｉ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ㊁ｐＣＭＶ３￣ＧＦＰＳｐａｒｋ￣ＣＸＣＲ２载体质粒㊁辅助包装质粒ｐｓＰＡＸ２和ｐＭＤ２.Ｇ均由空军军医大学微生物实验室保存并提供ꎮ１.２㊀实验动物㊀ＳＰＦ级４~６周Ｃ５７ＢＬ/６小鼠４只ꎬ１６~１８ｇꎬ均购自空军军医大学动物实验中心ꎮ１.３㊀主要试剂及仪器㊀ＤＭＥＭ培养基㊁青霉素㊁链霉素均购自ｈｙｃｌｏｎｅ公司ꎻ胎牛血清购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ成骨诱导分化培养基试剂盒购自广州赛业公司ꎻＰＥ标记抗小鼠ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１㊁ＩＡ/Ｅ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５抗体均购自ＢＤ公司ꎻＰＥ标记ＣＸＣＲ２抗体购自Ｂｉｏ￣ｌｅｇｅｎｄ公司ꎻ质粒大量提取ＤＮＡ试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司ꎻ先锋ＲＮＡ快速提取试剂盒㊁ＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁质粒小量提取ＤＮＡ试剂盒均购自Ａｘｙｇｅｎ公司ꎻＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡ聚合酶㊁限制性内切酶ＮｈｅＩ㊁ＭｌｕＩ㊁ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁逆转录试剂盒㊁ＴａｋａｒａＳＹＢＲｇｒｅｅｎ试剂盒均购自Ｔａｋａｒａ公司ꎻ转染试剂ＭＡＸ由本室配制ꎻｍＣＸＣＬ２蛋白购自亿翘神州公司ꎮＣＯ２培养箱㊁Ｔ２５细胞培养瓶均购自Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司ꎻＩＸ７１倒置荧光显微镜购自Ｏｌｙｍｐｕｓ公司ꎻ流式细胞仪购自于美国ＢＤ公司ꎻ４ħ离心机购自德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司ꎻ超速离心机购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲ仪购自罗氏公司ꎮ１.４㊀ＢＭＳＣ的分离、鉴定㊀采用全骨髓贴壁法培养小鼠ＢＭＳＣ[９]ꎮ将小鼠颈椎脱臼法处死ꎬ置于７５％乙醇中浸泡消毒５ｍｉｎꎻ于超净台中剪开皮肤ꎬ剥开肌肉ꎬ分离小鼠双侧股骨ꎬ剪去两端软骨ꎻ用１ｍＬ注射器吸取含１０％血清㊁１％双抗的ＤＭＥＭ培养基反复冲洗骨髓腔ꎬ直至骨髓腔发白ꎻ收集细胞悬液于Ｔ２５培养瓶中ꎮ将其放入３７ħ５％ＣＯ２培养箱中培养ꎬ首次４８ｈ后换液ꎬ以后视细胞状态而定ꎬ约２ｄ换液１次ꎮ传至第３代ꎬ常规消化细胞ꎻ按流式抗体说明书通过流式细胞术检测干细胞表面标志分子ＣＤ４５㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１㊁ＩＡ/ＩＥꎬ并按诱导分化培养基试剂盒说明书诱导ＢＭＳＣ成骨分化ꎬ茜素红染色鉴定ꎮ１.５㊀ｃｘｃｒ２过表达的慢病毒载体构建及慢病毒包装１.５.１㊀ｃｘｃｒ２基因片段的制备㊀根据Ｇｅｎｂａｎｋ中的ｃｘｃｒ２设计引物ꎬ以质粒(ｐＣＭＶ３￣ＧＦＰＳｐａｒｋ￣ＣＸＣＲ２)为模板进行ＰＣＲ扩增ꎮ引物序列如下:Ｆ:ＧＡＣＧＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡ(含ＮｈｅＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点)ꎻＲ:ＧＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧ(含ＭｌｕＩ酶切位点)ꎮ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮＰＣＲ反应体系为模板ＤＮＡ２μＬꎬ上㊁下游引物各１.５μＬꎬ５ˑＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μＬꎬＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡ聚合酶０.５μＬꎬ加超纯水至５０μＬꎮＰＣＲ反应条件为:９８ħ变性１０ｓꎬ５５ħ退火５ｓꎬ７２ħ延伸７５ｓꎬ３０个循环ꎮＰＣＲ产物进行１.０％琼脂糖凝胶电泳鉴定后ꎬ按照ＤＮＡ凝胶回收试剂盒说明书回收ＤＮＡ片段ꎮ１.５.２㊀重组质粒ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ的构建及鉴定㊀用ＮｈｅＩ和ＭｌｕＩ分别对ｃｘｃｒ２ＰＣＲ产物和ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ进行双酶切ꎬ并分别进行胶回收ｃｘｃｒ２基因片段和ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＧＺꎬ用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后ꎬ用Ｓｔｂｌ３感受态细菌转化ꎬ涂布含有氨苄抗性的琼脂培养基ꎬ过夜培养后挑出单克隆并接种ꎬ３７ħ培养１２~１６ｈ后ꎬＰＣＲ鉴定得到阳性克隆保存甘油菌ꎬ并收集菌体沉淀ꎬ按质粒小量提取ＤＮＡ试剂盒说明书提取质粒ꎬ命名为ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎮ之后ꎬ将其与ｐＬｅｎｔｉ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ酶切ꎬ分别获得目的片段ｃｘｃｒ２￣ＧＺ和ｐＬｅｎｔｉ载体ꎬ连接后将连接产物转化Ｓｔｂｌ３感受态细菌ꎬ操作同前法ꎬ菌液ＰＣＲ鉴定单克隆菌落ꎬ鉴定正确菌落委托擎科泽西生物技术公司进行双向测序ꎬ测序结果于ＮＣＢＩ￣ＢＬＡＳＴ网站(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)进行比对ꎬ序列正确菌落命名为ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎮ１.５.３㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ慢病毒的包装㊀将重组质粒ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ１２μｇ与ｐｓＰＡＸ２９μｇ㊁ｐＭＤ２.Ｇ６μｇ混合后ꎬ加入转染试剂(ＭＡＸ溶液)８１μＬꎬ轻柔混匀ꎬ待其形成ＤＮＡ￣脂质体复合物后ꎬ转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎮ将细胞放置于３７ħ５％ＣＯ２培养箱孵育４８ｈꎬ收集上清后加入ＤＭＥＭ培养液ꎬ７２ｈ后再次收集上清液ꎬ使用０.４５μｍ滤器过滤细胞碎片ꎬ收集病毒上清液ꎬ２０％蔗糖作为垫子ꎬ以１０００００ˑｇ离心４ｈꎬ超速离心法沉淀浓缩和纯化慢病毒ꎬ收集并分装ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ病毒液ꎬ于－８０ħ保存ꎮ１.６㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ的构建及筛选㊀将第３代的小鼠ＢＭＳＣ铺于６孔板中ꎬ培养至细胞汇合度达到６０％~７０％时ꎬ每孔加入２ｍＬｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ病毒液和ＤＭＥＭ培养基的混合液(按１ʒ１比例)３７ħꎬ１０００ˑｇ离心感染２ｈꎬ弃去病毒液ꎬ加入含有１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基于３７ħ５％ＣＯ２培养箱中继续培养ꎬ４８ｈ后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)的表达ꎮ然后加入含有１μｇ/ｍＬｚｅｏｃｉｎ的培养液２ｍＬ进行筛选ꎬ每３~４ｄ更换该培养液ꎬ直至不表达绿色荧光的细胞全部死亡ꎮ经过１４~２１ｄ的筛选后ꎬ获得了稳定表达ＣＸ￣ＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)ꎬ同时设置未处理的ＢＭＳＣ作为对照组ꎮ１.７㊀稳定转染细胞系鉴定１.７.１㊀流式细胞术检测ＣＸＣＲ２蛋白表达㊀常规消化ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣꎬ加入预冷的缓冲液(ＰＢＳ加入１％胎牛血清)洗涤２次后ꎬ调整细胞浓度为１ˑ１０５个/孔后加入１μＬＰＥ标记ＣＸＣＲ２抗体ꎬ避光冰浴３０ｍｉｎꎻ洗涤２次后ꎬ用２００μＬＰＢＳ重悬ꎬ用流式细胞仪检测ＣＸＣＲ２蛋白的表达ꎮ１.７.２㊀Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ检测ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ的表达㊀按照先锋ＲＮＡ快速提取试剂盒说明书分别提取未感染正常ＢＭＳＣ和ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ的总ＲＮＡꎬ并用微黑子核酸测定仪定量ꎮ取５００ｎｇ总ＲＮＡ用逆转录试剂盒制备ｃＤＮＡꎬ然后按照ＴａｋａｒａＳＹＢＲｇｒｅｅｎ试剂盒说明书用Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲ仪进行荧光定量ＰＣＲꎮ根据目的基因设计Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ引物ꎬ序列如下:ｃｘｃｒ２:Ｆ:ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴꎻＲ:ＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣ￣３ꎻβ￣ａｃｔｉｎ:Ｆ:ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧꎻＲ:ＡＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴꎮ以β￣ａｃｔｉｎ为内参基因ꎬ检测试验组(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)及对照组(ＢＭＳＣ)细胞中上述目的基因ｍＲ￣ＮＡ的相对表达量ꎮＰＣＲ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮ１.８㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验㊀在２４孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ的上室中接种ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ或ＢＭＳＣꎬ接种密度为１ˑ１０５个/孔ꎬ下室加入６００μＬ趋化缓冲液或正常缓冲液ꎮ实验分为４组:①小室上室加入培养的ＣＸＣＲ２￣ＢＭ￣ＳＣꎬ下室加入含１００ｎｇ/ｍＬｍＣＸＣＬ２正常培养液ꎬ命名为ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻ②小室上室加入培养的ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣正常组ꎻ③小室上室加入培养的ＢＭ￣ＳＣꎬ下室加入含１００ｎｇ/ｍＬｍＣＸＣＬ２正常培养液ꎬ命名为ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻ④小室上室加入培养的ＢＭＳＣꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为ＢＭＳＣ￣正常组ꎮ每组均放置于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱孵育１２ｈ后用棉签擦去上室内细胞ꎬ用４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎꎬ倒置风干后用０.１％的结晶紫染色２０ｍｉｎꎬ在显微镜下对上室底部反面的细胞进行计数ꎬ每组设３个复孔ꎬ每孔随机计数５个视野(２００ˑ)下迁移至膜背面的细胞数ꎮ１.９㊀统计学方法㊀应用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５和ＳＰＳＳ１７软件进行统计分析ꎮ基因ｍＲＮＡ的相对表达量采用ｔ检验进行比较ꎻ各组迁移的细胞数采用单因素方差分析进行比较ꎬ两两比较采用ＳＮＫ检验ꎬＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结㊀果２.１㊀ＢＭＳＣ分离及鉴定２.１.１㊀小鼠ＢＭＳＣ形态㊀在显微镜下可以看到ꎬ刚分离的骨髓细胞大多悬浮并呈圆形ꎬ２４ｈ后见大量贴壁细胞ꎬ７２ｈ后贴壁细胞大多呈纺锤型㊁梭形和圆形ꎬ大约１２ｄ细胞长满ꎮ随着培养时间和传代次数的增加ꎬ细胞形态逐渐形似呈梭形ꎬ见图１ꎮ㊀注:Ａ.培养３ｄ的细胞形态ꎻＢ.培养１２ｄ的细胞形态ꎮ图１㊀小鼠ＢＭＳＣ形态(２００ˑ)Ｆｉｇ.１㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(２００ˑ)２.１.２㊀ＢＭＳＣ表面标志分子流式鉴定㊀流式结果显示ꎬ超过９０％的细胞表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ但几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬＢＭＳＣ表面标志分子鉴定ꎬ见图２ꎮ㊀注:Ａ.ＣＤ４４ꎻＢ.ＳＣＡ￣１ꎻＣ.ＣＤ４５ꎻＤ.ＣＤ３４ꎻＥ.ＩＡ/ＩＥꎮ图２㊀ＢＭＳＣ表面标志分子鉴定Ｆｉｇ.２㊀Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ２.１.３㊀诱导ＢＭＳＣ成骨分化㊀成骨诱导２１ｄ后ꎬ细胞呈结节状ꎬ茜素红染色呈红色ꎬ见图３ꎮ表明成骨分化诱导成功ꎮ提示分离获得的小鼠ＢＭＳＣ符合国际细胞治疗协会制定的间充质干细胞标准ꎮ图３㊀ＢＭＳＣ成骨诱导分化(２００ˑ)Ｆｉｇ.３㊀Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｏｒｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(２００ˑ)２.２㊀ｃｘｃｒ２慢病毒载体的构建㊀琼脂糖电泳结果显示ꎬ扩增的目的条带单一㊁特异ꎬ之后菌液ＰＣＲ鉴定㊁酶切鉴定㊁测序分析结果均表明成功构建了慢病毒载体ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎬ见图４ꎮ２.３㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ的构建及筛选㊀将ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ质粒与慢病毒包装质粒共同转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎬ获得慢病毒后浓缩感染ＢＭ￣ＳＣꎬＢＭＳＣ经过Ｚｅｏｃｉｎ压力选择３周后ꎬ可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光ꎬ对照组未见绿色荧光ꎬ见图５ꎮ２.４㊀稳定转染细胞系鉴定㊀流式鉴定大约７８.５％的细胞表达ＧＦＰꎬ７５.７％的细胞表达ＣＸＣＲ２ꎮＲｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ结果显示ꎬ试验组的ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ表达水平明显高于对照组ꎬ差异具有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮ提示ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ构建成功ꎬ见图６ꎮ㊀注:Ａ.ｃｘｃｒ２基因片段的制备ꎻＢ.ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ菌液ＰＣＲ鉴定ꎻＣ.ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ质粒双酶切鉴定ꎻＤ.测序结果在ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ比对ꎮ图４㊀ｃｘｃｒ２真核表达载体的构建Ｆｉｇ.４㊀Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ㊀注:Ａ.过表达ＣＸＣＲ２的ＢＭＳＣ的荧光图片ꎻＢ.未感染正常对照ＢＭＳＣ的荧光图片ꎮ图５㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ荧光表达(４００ˑ)Ｆｉｇ.５㊀ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＳＣｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ(４００ˑ)㊀注:Ａ.流式细胞仪检测ＧＦＰ表达ꎻＢ.流式细胞仪检测ＣＸＣＲ２表达ꎻＣ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ检测过表达ＣＸＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ中ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ表达ꎮ∗∗∗.Ｐ<０.００１ꎮ图６㊀ＣＸＣＲ２修饰的ＢＭＳＣ的鉴定结果Ｆｉｇ.６㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＸＣＲ２ｍｏｄｉｆｉｅｄＢＭＳＣ２.５㊀ｃｘｃｒ２基因修饰的ＢＭＳＣ迁移能力增强㊀Ｔｒａｎ￣ｓｗｅｌｌ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组在含有１００ｎｇ/ｍＬ的ｍＣＸＣＬ２的趋化液中穿过小室的数目明显高于ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎬＴｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移ꎬ见图７ꎮ表明ｃｘｃｒ２基因修饰ＢＭＳＣ可增强其趋化潜能ꎮ㊀注:Ａ.ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻＢ.ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣正常组ꎻＣ.ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻＤ.ＢＭＳＣ￣正常组ꎻＥ.２４ｈ后不同组别穿过膜下的细胞数ꎮ∗∗.Ｐ<０.０１ꎮ图７㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移(２００ˑ)Ｆｉｇ.７㊀Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙ(２００ˑ)３㊀讨㊀论２０世纪７０年代ꎬＦＲＩＥＤＥＮＳＴＥＩＮ等[１０]首次利用贴壁法从骨髓分离得到ＢＭＳＣꎮ由于其来源方便ꎬ易于分离培养ꎬ且具有多向分化㊁免疫调节㊁输送治疗剂的能力ꎬ是较好的组织工程细胞和基因载体细胞ꎬ常被用于免疫与炎症性疾病的基础和临床研究[１１－１２]ꎮ通过静脉或腹腔移植的ＭＳＣ会沿着趋化梯度向受损组织迁移ꎬ在靶组织中检出率有限(只有不到１％)ꎬ大大降低了其治疗效应ꎮ可能的原因是ＭＳＣ表面趋化因子受体的表达较低ꎮ研究发现ꎬ趋化因子及其受体在ＢＭＳＣ的归巢中起着重要作用ꎬＢＭＳＣ表面的趋化因子受体通常支配着血管内循环细胞的黏附和滚动[１３－１４]ꎮＣＨＥＮ等[１５]研究发现ꎬｃｘｃｒ４过表达的ＢＭＳＣ在小鼠结肠炎模型中可增强ＢＭＳＣ向受损肠黏膜的归巢ꎬ对治疗结肠炎有较好的疗效ꎮＨＯＥＧＬ等[１６]研究发现ꎬ在内毒素所致的肺损伤中趋化因子ＣＸＣＬ１㊁ＣＸＣＬ２高表达ꎬＮＫ细胞通过ＣＸＣＲ２介导参与中性粒细胞向肺部炎症部位的募集ꎮ因此ꎬ对ＢＭＳＣ基因修饰趋化因子受体成为提高归巢能力的新策略[１７－１８]ꎮ研究通过全骨髓贴壁法分离培养ＢＭＳＣꎬ使用ＤＭＥＭ培养基进行培养ꎬ经过换液㊁传代去除了杂细胞ꎬ从而获得了纯度较高的ＢＭＳＣꎮ为了检测其是否符合干细胞标准ꎬ通过流式检测干细胞表面标志ＳＣＡ￣１㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４３㊁ＣＤ４５㊁ＩＡ/ＩＥꎬ结果显示ꎬ其高表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬ通过诱导成骨分化观察到茜素红染色阳性的钙结节沉积ꎮ上述结果表明通过全骨髓贴壁法培养出符合细胞表型㊁具有分化潜能的ＢＭＳＣꎮ由于小鼠的ＢＭＳＣ具有感染率低的特点ꎬ研究通过慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染至ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞获得慢病毒ꎬ经超速离心沉淀法浓缩纯化ꎬ获得ｃｘｃｒ２过表达的慢病毒ꎮ通过离心法进行感染ꎬ利用抗性筛选提高阳性细胞的比例ꎬ从而使得ＣＸＣＲ２能稳定表达ꎮ荧光显微镜可以观察到稳定表达ＣＸＣＲ２的ＢＭＳＣ具有绿色荧光ꎻ流式细胞和ＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平均明显高于正常ＢＭＳＣꎬ证实成功构建稳定表达ＣＸ￣ＣＲ２的ＢＭＳＣꎮ通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验比较了ｃｘｃｒ２修饰的ＢＭＳＣ与普通ＢＭＳＣ的迁移和归巢ꎮ结果表明ꎬｃｘ￣ｃｒ２修饰的ＢＭＳＣ更容易迁移ꎬ提示ＣＸＣＲ２参与了ＢＭＳＣ的迁移与归巢ꎮ综上所述ꎬ研究成功构建了ｃｘｃｒ２修饰的ＢＭ￣ＳＣꎬ为进一步研究其直接移植治疗临床疾病及其作用机制奠定了基础ꎮ参考文献[１]㊀ＵＬＬＡＨＩꎬＳＵＢＢＡＲＡＯＲＢꎬＲＨＯＧＪ.Ｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ￣ｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅｎｄｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｐꎬ２０１５ꎬ３５(２):１￣１８.[２]㊀ＲＯＳＴＡＭＩＭꎬＨＡＩＤＡＲＩＫꎬＳＨＡＨＢＡＺＩＭ.Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉ￣ｎｅｅｒｅｄａｄｉｐｏｓｅｍｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇＨＩＶ￣ｂａｓｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｓｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｐｒｏ￣ｇｒａｍꎬ２０１８.ＤＯＩ:１０.１０８９/ｃｅｌｌ.２０１８.０００６.[３]㊀ＳＨＡＨＫꎬＺＨＡＯＡＧꎬＳＵＭＥＲＨ.Ｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｔｒｅａｔｏｓｔｅｏ￣ａｒｔｈｒｉｔｉｓｗｉｔｈｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＩｎｔꎬ２０１８ꎬ２０１８:５３７３２９４.[４]㊀ＬＥＢＬＡＮＣＫꎬＭＯＵＧＩＡＫＡＫＯＳＤ.Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕ￣ｎｏｌꎬ２０１２ꎬ１２(５):３８３￣３９６.[５]㊀ＣＨＥＮＸꎬＺＨＡＮＧＹꎬＷＡＮＧＷꎬｅｔａｌ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ￣１ｈａｖｅｅｎｈａｎｃｅｄｐａｒａｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄｏｘｉｄａ￣ｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ２０１８ꎬ４９(１):１０１￣１２２.[６]㊀ＸＵＸＰꎬＨＵＡＮＧＬＬꎬＨＵＳＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩｔｙｐｅ２ｒｅｃｅｐ￣ｔｏｒｉｎｃｒｅａｓｅｓｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｏｉｎｊｕｒｅｄｌｕｎｇｉｎＬＰＳ￣ｉｎｄｕｃｅｄａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙｍｉｃｅ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌＭｅｄꎬ２０１８ꎬ７(１０):７２１￣７３０.[７]㊀ＳＴＥＷＡＲＴＡＮꎬＭＡＴＹＡＳＪＪꎬＷＥＬＣＨＫＯＲＭꎬｅｔａｌ.ＳＤＦ￣１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｎｈａｎｃｅｓＧＡＰ￣４３￣ｐｏｓｉ￣ｔｉｖｅａｘｏｎａｌｇｒｏｗｔｈｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＲｅｓｔｏｒＮｅｕｒｏｌＮｅｕｒｏｓｃｉꎬ２０１７ꎬ３５(４):３９５￣４１１.[８]㊀ＨＥＲＴＺＥＲＫＭꎬＤＯＮＡＬＤＧＷꎬＨＩＮＥＳＯＪ.ＣＸＣＲ２:ａｔａｒｇｅｔｆｏｒｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ?[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＴｈｅｒＴａｒｇｅｔｓꎬ２０１３ꎬ１７(６):６６７￣６８０.[９]㊀ＳＯＬＥＩＭＡＮＩＭꎬＮＡＤＲＩＳ.Ａｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｔｏｃꎬ２００９ꎬ４(１):１０２￣１０６.[１０]㊀ＦＲＩＥＤＥＮＳＴＥＩＮＡＪꎬＣＨＡＩＬＡＫＨＪＡＮＲＫꎬＬＡＬＹＫＩＮＡＫＳ.Ｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｂｒｏｂｌａｓｔｃｏｌｏｎｉｅｓｉｎｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｇｕｉｎｅａ￣ｐｉｇｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄｓｐｌｅｅｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉ￣ｎｅｔｉｃｓꎬ１９７０ꎬ３:３９５￣４０３.[１１]㊀ＦＲＥＮＥＴＴＥＰＳꎬＰＩＮＨＯＳꎬＬＵＣＡＳＤꎬｅｔａｌ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ:ｋｅｙｓｔｏｎｅｏｆｔｈｅｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｎｉｃｈｅａｎｄａｓｔｅｐ￣ｐｉｎｇ￣ｓｔｏｎｅｆｏｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｅｄｉｃｉｎｅ[Ｊ].ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１３ꎬ３１:２８５￣３１６.[１２]㊀ＬＩＸꎬＷＡＮＧＭꎬＪＩＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ:ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎꎬａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＣｒｉｔＲｅｖＥｕｋａｒｙｏｔＧｅｎｅＥｘｐｒꎬ２０１８ꎬ２８(４):２８５￣３１０.[１３]㊀ＩＤＯＲＮＭꎬＴＨＯＲＳＰ.Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｅｘｅｒｃｉｓｅｔｏｔａｃｋ￣ｌｅｔｈｅｉｎａｄｅｑｕａｃｙｏｆＴｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇｔｏｔｈｅｔｕｍｏｒｓｉｔｅ[Ｊ].Ｃｅｌｌｓꎬ２０１８ꎬ７(８):Ｅ１０８.[１４]㊀ＺＨＡＮＧＸꎬＨＵＡＮＧＷꎬＣＨＥＮＸꎬｅｔａｌ.ＣＸＣＲ５￣ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓｅｘｈｉｂｉｔｅｎｈａｎｃｅｄｈｏｍｉｎｇａｎｄｃａｎｄｅ￣ｃｒｅａｓｅｃｏｎｔａｃｔｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].ＭｏｌＴｈｅｒꎬ２０１７ꎬ２５(６):１４３４￣１４４７.[１５]㊀ＣＨＥＮＺꎬＣＨＥＮＱꎬＤＵＨꎬｅｔａｌ.ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕ￣ｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎｃｏｌｉｔｉｓｖｉａｍｕｃｏｓａｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＥｘｐＴｈｅｒＭｅｄꎬ２０１８ꎬ１６(２):８２１￣８２９.[１６]㊀ＨＯＥＧＬＳꎬＥＨＲＥＮＴＲＡＵＴＨꎬＢＲＯＤＳＫＹＫＳꎬｅｔａｌ.ＮＫｃｅｌｌｓｒｅｇｕｌａｔｅＣＸＣＲ２＋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｄｕｒｉｎｇａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＪＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌꎬ２０１７ꎬ１０１(２):４７１￣４８０.[１７]㊀ＧＯＬＣＨＩＮＡꎬＲＥＫＡＢＧＡＲＤＡＮＭꎬＴＡＨＥＲＩＲＡꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏ￣ｍｏｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌ￣ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｙ:ｓｐｅｃｉａｌｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙａｎｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓｔｕｄｉｅｓ[Ｊ].ＡｄｖＥｘｐＭｅｄＢｉｏｌꎬ２０１８.ＤＯＩ:１０.１００７/５５８４＿２０１８＿２５６.[１８]㊀ＫＡＲＰＪＭꎬＬＥＮＧＴＧ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇ:ｔｈｅｄｅｖｉｌｉｓｉｎｔｈｅｄｅｔａｉｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌꎬ２００９ꎬ４(３):２０６￣２１６.收稿日期:２０１８￣１０￣１６㊀修回日期:２０１８￣１２￣１２编辑:陈凌云。

4.1免疫系统的组成和功能课件-2024年高二上学期生物人教版(2019)选择性必修1

表面有Y型结构（细胞表面受体）
➢ 来源：造血干细胞在骨髓中发育成熟 ➢ 分布：位于淋巴液、血液和淋巴结中 ➢ 功能：识别、呈递抗原，分化成为浆细胞和
记忆细胞
T淋巴细胞
表面有许多突起
➢ 来源：造血干细胞迁移到胸腺中成熟 ➢ 分布：位于淋巴液、血液和淋巴结中（同上） ➢ 功能：在免疫反应中起非常重要作用，又可以
造血干细胞（骨髓中）
分裂
分化
造血干细胞红细胞白细胞血小板
吞噬细胞
淋巴细胞其它白细胞
问题二：免疫细胞有哪些呢？分布在什么位置？具有什么功能？
一. 免疫系统的组成 P68
2、免疫细胞 ——“士兵”
(1)概念：执行免疫功能的细胞。 (2)起源：免疫细胞来自_骨__髓____的_造__血__干__细__胞_____。 (3)类型：包括各种类型的细胞，如淋__巴__细__胞___、树__突__状__细__胞__和_巨__噬__细__胞__等
扁桃体肿大意味着扁桃体有炎症，患者可能被病菌感染了。
2. 扁桃体肿大对机体的健康是有利还是有害的？
一方面，肿大后可以起到指示机体是否被病原体感染的作用，能用于判断疾病状况；
另一方面，扁桃体充血肿大后易形成脓肿，表现出吞咽食物时有疼痛感等症状，同时引发其他并发症状。
一、免疫系统的组成 P66
免疫器官
一种能水解细菌细胞壁的分布：唾液、泪液等
溶菌酶：酶，导致细菌细胞壁破裂，内容物逸出，使细菌溶解。
分泌细胞：唾液腺细胞、泪腺细胞等
一. 免疫系统的组成 P68
3、免疫活性物质(补充）—溶菌酶
溶菌酶
来源作用
多种细胞如唾液腺细胞、泪腺细胞、巨噬细胞可溶解细菌的细胞壁，有抗菌消炎的作用

Th2与ILC2细胞在哮喘模型中的数量及产生细胞因子的比较研究

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ: ＷＡＮＧＷｅｉꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｙ＿ｒｏｂｉｎ＠ｃｃｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎＡｂｓｔｒａｃｔ: ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＴｈ２ａｎｄＩＬＣ２ｃｅｌｌｓｉｎｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｓｆｏｒａｌｌｅｒｇｅｎ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄｎｏｎ￣ａｌｌｅｒｇｅｎ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｓｔｈｍａ. ＭｅｔｈｏｄＭｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｓｆｏｒａｌｌｅｒｇｅｎ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｓｔｈｍａｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｕｓｉｎｇｉｎｔｒａ￣ｎａｓａｌｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｃｈａｌｌｅｎｇｅｗｉｔｈｏｖａｌｂｕｍｉｎ ( ＯＶＡ) ａｎｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｙｔｏｋｉｎｅｓＩＬ￣２５ / ＩＬ￣３３ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｈｉｓ￣ｔｏｌｏｇｙｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｉｎｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄ ( ＢＡＬＦ) ａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｌｕｎｇｓｔｉｓｓｕｅｓ. ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｉｎｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｒａｔｉｏｏｆｔｈｅＴｈ２ａｎｄＩＬＣ２ｃｅｌｌｓａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＴｈ２￣ｔｙｐｅｃｙｔｏ￣
首都医科大学基础医学院免疫学系ꎬ北京１０００６９
摘要: 目的比较过敏原依赖和非依赖性哮喘模型中２型辅助性Ｔ细胞( Ｔｈ２ｃｅｌｌ) 和固有淋巴样２型细胞( ｔｙｐｅ２
ｉｎｎａｔｅｌｙｍｐｈｏｉｄｃｅｌｌꎬ ＩＬＣ２) 的功能ꎮ 方法滴鼻法制备过敏原卵清蛋白( ｏｖａｌｂｕｍｉｎꎬ ＯＶＡ) 学进展２０１９年２月第４７卷第１期ＰｒｏｇｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌꎬＦｅｂ. ２０１９ꎬ Ｖｏｌ.４７Ｎｏ.１

免疫组学的研究进展

免疫组学的研究进展唐康侯永利王亚珍陈丽华（中国人民解放军空军军医大学基础医学院免疫学教研室，西安 710032）中图分类号R392.9 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2024）01-0185-07［摘要］随着高通量测序技术、生物信息学等相关领域进展以及人类对免疫系统功能认识的逐步深入，免疫组学从最初解析B细胞受体（BCR）、T细胞受体（TCR）基因序列逐渐发展为解析和绘制宿主免疫系统和抗原的互作关系以及宿主免疫系统应答机制的全景图谱，主要包括抗原表位组学、免疫基因组学、免疫蛋白质组学、抗体组学和免疫信息学等方面的研究，并基于大量免疫学研究数据建立了ImmPort、VDJdb和IEDB等免疫学数据库，加速了新抗原表位的发现和免疫应答机制等研究。

免疫组学能够揭示免疫系统与疾病的关联，促进新型疫苗和免疫治疗策略开发，将有效推动个体化医疗和精准药物治疗。

近年免疫组与暴露组等的整合以及与人工智能的融合将对全面理解免疫系统对环境因素的响应和调节机制、解析疾病发生和发展的分子机制产生重大影响。

［关键词］免疫组；免疫组学；免疫信息学；人工智能Advances in immunomics researchTANG Kang， HOU Yongli， WANG Yazhen， CHEN Lihua. Department of Immunology， School of Basic Medicine，Air Force Medical University， Xi'an 710032， China［Abstract］With the progress of high-throughput sequencing technologies and bioinformatics， and deepening understanding of immune system，immunomics has evolved from initially deciphering gene sequences of B cell receptor （BCR）and T cell receptor （TCR） to unraveling and mapping interactions between host immune system and antigens， as well as panorama of host immune system response mechanisms， which now encompasses various research areas， such as antigen epitopeomics， immunogenomics， immunopro‐teomics， antibodyomics and immunoinformatics. Based on a large amount of immunological research data， immunological databases such as ImmPort， VDJdb and IEDB have been established to accelerate discovery of new antigen epitopes and study of immune response mechanisms. Immunomics has revealed the association between immune system and diseases， promoted the development of novel vac‐cines and immunotherapeutic strategies， and effectively drove the development of personalized medicine and precision medicine. In recent years， integration of immunome with exposome and fusion it with artificial intelligence will have a significant impact on compre‐hensively understanding immune system's response and regulatory mechanisms to environmental factors， as well as deciphering molecular mechanisms underlying disease occurrence and progression.［Key words］Immunome；Immunomics；Immunoinformatics；Artificial intelligence免疫组（immunome）是宿主免疫系统与抗原的互作关系以及宿主免疫系统应答机制的全景图谱，包括免疫系统的识别对象、识别受体以及参与免疫应答过程的其他分子［1-3］。

【课件】免疫学的应用课件 -2022-2023学年高二上学期生物人教版(2019)选择性必修1

英国牛痘接种法
法国科学家巴斯德有关疫苗的研制，开创了科学地进行免疫接种的新时期。巴斯德主要成就——巴氏消毒法、研制狂犬疫苗等。
巴斯德将感染了狂犬病的兔的神经组织制成匀浆，每天取样给家兔注射。开始几天被注射的家兔都会发病，但随着匀浆放置时间的延长，家兔发病的反应越来越弱：放置10~14天的匀浆失去使家兔患病的作用。这时，如果再给这些没有发病的、被注射了 “过期病兔神经组织匀浆” 的家兔注射新鲜病兔的神经组织匀浆，家兔也不会发病了。
例如：卡介苗、牛痘疫苗、麻疹疫苗。
一疫苗
3.疫苗种类：
(3)核酸疫苗： ①RNA疫苗：以现代基因工程的方法，将编码抗原决定簇的mRNA导入细胞，翻译产生相应的蛋白质，进而引起机体产生免疫应答。 ②DNA疫苗：以现代基因工程的方法，利用病毒DNA的一段无毒序列与载体连接制成。导入细胞后DNA先转录产生相应mRNA，再翻译产生相应的蛋白质，进而引起机体产生免疫应答。例如：新型乙肝疫苗、禽流感疫苗等。
1885年，巴斯德将匀浆注射给一个9岁的被疯狗咬伤的小男孩，连续注射十几天后，小男孩活了下来。这位小男孩就是世界上第一位狂犬病疫苗的注射者。后来，巴斯德制成了狂犬病疫苗，即过期病兔的神经组织匀浆。
巴斯德
一疫苗
1.概念: 疫苗通常是用灭活的或减毒的病原体制成的生物制品。
2.机理：接种疫苗后，人体内可产生相应的抗体，从而对特定传染病具有抵抗力。
➢ 白细胞能够识别HLA，区分自己和非己，正常情况下，白细胞不攻击自身细胞。
同种异型抗原的直接识别及其效应
二器官移植
思考.讨论
在进行器官移植或骨髓移植时，为什么都要先进行配型，即检查供体和受体之间的组织相容性呢？
因为受体和供体的组织相容性抗原越一致，在进行移植时发生免疫排斥的可能性就越低，移植的器官就越容易存活。如果配型不合适，发生排斥的可能性就大，就不适合移植。

病原生物与免疫学基础第五章常见病原菌第一节化脓性球菌

▪ 对热和酸敏感
第34页，共49页。
侵袭性酶类
▪ 透明质酸酶(扩散因子)
▪ 能分解细胞间质的透明质酸，有利于细菌扩散
▪ 链激酶(溶纤维蛋白酶)SK
▪ 能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，能溶解血块或阻止血浆凝固，有助于细菌扩散
▪ 链道酶(DNA酶)SD
▪ 能分解脓汁中具有高黏稠性的DNA，使脓汁稀薄 ▪ 故链球菌引起的化脓性感染病灶与周围界限不清
局部感染
▪ 皮肤软组织感染如疖、痈、脓肿及创伤感染内脏器官感染如支气管炎、肺炎、中耳炎等
痈
疖
第15页，共49页。
全身感染
败血症脓毒血症
败血症
第16页，共49页。
食物中毒
▪ 食入含肠毒素食物后1～6h出现胃肠炎症
状 ▪ 呕吐最为突出
▪ 1～2d内可恢复
第17页，共49页。
假膜性肠炎
第3页，共49页。
主要生物学特性-形态与染色
▪ 菌体呈球形
▪ 典型排列葡萄串状 ▪ 无芽胞、无鞭毛
▪ 致病菌有荚膜 ▪ 革兰染色呈阳性
第4页，共49页。
主要生物学特性-培养特性
▪ 需氧或兼性厌氧
▪ 营养要求不高
▪ 在液体培养基中均匀混浊生长
▪ 在普通琼脂平板上形成圆形、光滑的有色菌落
▪ 在血平板上，致病菌株可形成透明溶血环
猩红热
▪ 儿童急性呼吸道传染病
▪ 主要症状为发热、咽炎、全身弥漫性鲜红色皮疹、杨梅舌、脱屑
▪ 病后获持久免疫
第38页，共49页。
超敏反应性疾病
▪ 风湿性关节炎 ▪ 链球菌感染后肾小球
肾炎
第39页，共49页。
甲型溶血性链球菌所致疾病

免疫学的基本研究内容及研究进展-免疫学论文-基础医学论文-医学论文

免疫学的基本研究内容及研究进展-免疫学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——免疫学是研究人体免疫系统结构和功能的科学，主要探讨免疫系统识别抗原后发生免疫应答及清除抗原的规律，并致力于阐明免疫功能异常所致疾病的病理过程及其机制。

免疫学的基本理论和技术是诊断、预防和治疗某些免疫相关疾病的基础。

免疫学在生命科学和医学中有着重要的地位。

由于细胞生物学、分子生物学和遗传学等学科与免疫学的交叉和渗透，免疫学已成为当今生命科学的前沿学科和现代医学的支撑学科之一。

机体通过完善的免疫系统来执行免疫功能。

免疫系统包括免疫器官、免疫细胞和免疫分子。

免疫系统除了能够识别和清除外来入侵的抗原(如病原生物)外，还可识别和清除体内发生突变的肿瘤细胞、衰老的细胞或其他有害的成分。

机体的免疫功能可以概括为免疫防御、免疫监视和自身稳定三个部分。

(1)免疫防御免疫防御是指机体防止外界病原体的入侵，清除已入侵的病原体和其他有害物质的功能。

免疫防御功能过低或缺乏，可发生免疫缺陷病。

但若应答过强或持续时间过长，则在清除病原体的同时，也可导致机体的组织损伤或功能异常，发生超敏反应。

(2)免疫监视免疫监视是指随时发现和清除体内出现的非己成分的功能，如清除由基因突变而发生的肿瘤细胞以及衰老、凋亡细胞等。

免疫监视功能低下，可能导致肿瘤发生和持续性病毒感染。

(3)自身稳定自身稳定是指通过自身免疫耐受和免疫调节两种主要的机制来达到免疫系统内环境稳定的功能。

一般情况下，免疫系统对自身组织细胞不产生免疫应答，称为免疫耐受。

这赋予了免疫系统区别自身和非己的能力。

一旦免疫耐受被打破，免疫调节功能紊乱，就会导致自身免疫病和过敏性疾病的发生。

免疫学的基本研究内容可概括为以下几个方面。

(1)基础免疫学基础免疫学研究免疫应答的基本过程、特性和分子与细胞机制。

免疫应答分为三个阶段，即识别阶段、活化增殖阶段和效应阶段。

大量已知和未知的免疫细胞亚群和免疫分子参与到免疫应答的各个阶段，并形成立体调控网络。

免疫学研究的新方向和进展

免疫学研究的新方向和进展第一章：免疫学研究的基本概念免疫学是研究机体抵抗病原微生物和肿瘤等异物侵入的科学。

免疫反应是由介导免疫细胞和免疫分子参与的复杂生理过程，主要包括先天免疫和获得性免疫两个部分。

过去几十年，免疫学研究集中在细胞免疫、体液免疫以及免疫记忆等方面，取得了许多重要的成果。

第二章：新的研究方向在过去的几年中，免疫学研究的重点逐渐向着新的方向发展。

其中，以下几个方面值得重点关注：1. 肿瘤免疫治疗：免疫刺激剂物质，如检查点抑制剂以及CAR-T细胞疗法等肿瘤免疫治疗手段近年来得到了广泛研究和应用。

这些新的治疗方法通过促进机体免疫系统的活性，有效增强对肿瘤细胞的杀伤能力，为肿瘤的治疗带来了新的希望。

2. 免疫遗传学：免疫遗传学研究了基因与免疫系统之间的关联。

通过比较疾病易感基因和免疫反应基因的差异，可以更好地理解疾病与免疫功能之间的关系，为疾病的预防、诊断和治疗提供新的途径。

3. 免疫调节：研究免疫系统如何调节和平衡免疫反应是目前热门的研究方向之一。

免疫调节的研究可以揭示免疫系统调节炎症、治疗自身免疫病和抗肿瘤的机制，为新的治疗策略的开发提供理论基础。

4. 生物信息学和免疫计算生物学：随着高通量测序技术的广泛应用，大规模免疫学数据的处理和分析成为一个迫切的问题。

生物信息学和免疫计算生物学的发展，为研究者提供了更多探索免疫系统的方法和工具，使得我们能够更深入地了解免疫系统的复杂性。

第三章：新进展的研究成果在新的研究方向的推动下，免疫学研究取得了许多重要的进展。

以下是其中一些有代表性的研究成果：1. 检查点抑制剂的应用：检查点抑制剂已被证明是一种有效的抗癌药物，尤其是在黑色素瘤和肺癌的治疗中表现出了显著的临床效果。

通过抑制免疫检查点的作用，这些药物能够重启被肿瘤细胞抑制的免疫反应，使机体的免疫系统能够更好地攻击和清除肿瘤。

2. CAR-T细胞疗法的突破：CAR-T细胞疗法是一种基于人工修饰的T细胞疗法，通过将特异性抗体和共刺激信号与T细胞表面受体结合，在体外激活和增殖改造后再输注给患者，达到靶向肿瘤细胞的目的。

围产期孕妇生殖道B族链球菌感染高危因素分析及母婴结局探讨

基金项目:辽宁省自然科学基金(２０１７０５４０８３７)作者简介:王晓娜(１９８２－)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事临床微生物学研究ꎮ通信作者:王晓娜ꎬ副主任检验师ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｎａｘｉａｏｗａｎｇ＠１２６.ｃｏｍ论㊀著围产期孕妇生殖道Ｂ族链球菌感染高危因素分析及母婴结局探讨王晓娜ꎬ丛桂敏ꎬ冯小静ꎬ杨静ꎬ卓英梅ꎬ李文杰ꎬ曹作伟ꎬ佟成龙ꎬ武家淳辽宁省沈阳市妇婴医院检验科ꎬ辽宁沈阳１１００１４摘要:目的㊀调查沈阳地区围产期孕妇生殖道Ｂ族链球菌(ｇｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓꎬＧＢＳ)定植率和感染高危因素及对母婴结局的影响ꎬ以便预防和控制围产期妇女ＧＢＳ感染ꎬ优化母婴结局ꎮ方法㊀对２０１７年９１１月在医院作孕期检查的３１~４０周孕晚期孕妇６９１例取阴道拭子及直肠拭子进行ＧＢＳ培养㊁分离鉴定ꎬ分析ＧＢＳ定植率ꎻ采用卡方检验进行ＧＢＳ感染的单因素分析ꎬ采用多因素二元Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归进行ＧＢＳ感染的高危因素分析ꎻ对比两组孕妇及新生儿结局ꎮ结果㊀沈阳地区孕晚期孕妇生殖道ＧＢＳ定植率为７.６７％(５３/６９１)ꎬ其中阴道试子阳性率为４.６３％(３２/６９１)ꎬ直肠试子阳性率为６.２２％(４３/６９１)ꎻ孕妇ＧＢＳ感染的危险因素显示ꎬ在教育程度㊁生产史㊁分娩方式㊁甲状腺异常㊁妊娠期高血压㊁妊娠期贫血和妊娠期糖尿病ꎬ组间差异均无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎻ孕妇ＧＢＳ感染危险因素ꎬ年龄㊁体质量㊁流产史和生殖道感染ꎬ组间比较ꎬ差异均有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎻ经多因素二元Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析结果显示ꎬ年龄㊁体重㊁流产史和生殖道感染为影响ＧＢＳ感染发生的独立危险因素ꎬ两组比较差异均有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎻ感染组孕妇胎膜早破㊁早产发生率高于对照组ꎬ经比较差异有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎻ产后出血发生率经比较差异无统计学意义(χ２＝０.６２４ꎬＰ>０.０５)ꎻ感染组新生儿胎儿窘迫㊁绒毛膜羊膜炎㊁新生儿黄疸发生率高于对照组ꎬ经比较差异有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎮ结论㊀沈阳市孕妇生殖道ＧＢＳ定植率较高ꎬ建议对孕晚期孕妇开展ＧＢＳ常规筛查ꎮ年龄㊁体重㊁流产史和生殖道感染为ＧＢＳ感染发生的独立危险因素ꎬ有必要对本地区的围产期孕妇进行健康宣教ꎬ减少ＧＢＳ感染的发生ꎬ进而改善母婴结局ꎮ关键词:围产期ꎻＢ族链球菌ꎻ危险因素中图分类号:Ｒ７１４.７文献标志码:Ａ文章编号:１００５￣５６７３(２０１９)０１￣００４４￣０５ＤＯＩ:１０.１３３０９/ｊ.ｃｎｋｉ.ｐｍｉ.２０１９.０１.００８ＨｉｇｈｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｏｆｇｒｏｕｐＢＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｄｕｒｉｎｇｐｅｒｉｎａｔａｌｐｅｒｉｏｄａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｍａｔｅｒｎａｌａｎｄｃｈｉｌｄｏｕｔｃｏｍｅｓＷＡＮＧＸｉａｏ￣ｎａꎬＣＯＮＧＧｕｉ￣ｍｉｎꎬＦＥＮＧＸｉａｏ￣ｊｉｎｇꎬＹＡＮＧＪｉｎｇꎬＺＨＵＯＹｉｎｇ￣ｍｅｉꎬＬＩＷｅｎ￣ｊｉｅꎬＣＡＯＺｕｏ￣ｗｅｉꎬＴＯＮＧＣｈｅｎｇ￣ｌｏｎｇꎬＷＵＪｉａ￣ｃｈｕｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙꎬＳｈｅｎｙａｎｇＷｏｍｅｎａｎｄＣｈｉｌｄｒｅｎＨｏｓｐｉｔａｌꎬＳｈｅｎｙａｎｇ１１００１４ꎬＬｉａｏｎｉｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ:ＷＡＮＧＸｉａｏ￣ｎａꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｎａｘｉａｏｗａｎｇ＠１２６.ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ￣ｔｒａｃｔꎬａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｐｅｒｉｎａｔａｌｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｉｎＳｈｅｎｙａｎｇꎬｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｐｅｒｉｎａｔａｌｗｏｍｅｎＧＢＳ(ｇｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐ￣ｔｏｃｏｃｃｕｓ)ｉｎｆｅｃｔｉｏｎꎬａｎｄｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｍａｔｅｒｎａｌａｎｄｃｈｉｌｄｏｕｔｃｏｍｅｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＣｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＧＢＳｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃ￣ｔｅｄｉｎ６９１ｃａｓｅｓｏｆｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｉｎｔｈｅｌａｔｅｓｔａｇｅｆｏｒｐｒｅｇｎａｎｃｙｏｆ３１４０ｗｅｅｋｓꎬｗｈｏｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｉｎｈｏｓｐｉｔａｌｆｒｏｍＳｅｐｔｅｍｂｅｒｔｏＮｏｖｅｍｂｅｒ２０１７ꎬａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＧＢＳｃｏｌｏｎａｚａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｃｈｉ￣ｓｑｕａｒｅｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒꎬａｎｄｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｂｉｎａｒｙｌｏｇｉｓｔｉｃｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｕｓｅｄｈｉｇｈｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｉｎＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｔｈｅｍａｔｅｒｎａｌａｎｄｎｅｏｎａｔａｌｏｕｔｃｏｍｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｇｒｏｕｐｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｔｅｓｔｅｄｆｅｒｔｉｌｉｔｙｒａｔｅꎬｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆｖａｇｉｎａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎꎬａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆｒｅｃｔｕｍｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｗｅｒｅ７.６７％(５３/６９１)ꎬ４.６３％(３２/６９１)ꎬａｎｄ６.２２％(４３/６９１)ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏａｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｅｄｕｃａｔｉｏｎꎬｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｈｉｓｔｏｒｙꎬｄｅｌｉｖｅｒｙｍｏｄｅꎬｔｈｙｒｏｉｄａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｉｎｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎꎬａｎｅｍｉａꎬａｎｄｄｉａｂｅｔｅｓ(ａｌｌＰ>０.０５)ꎻａｎｄａｇｅꎬｗｅｉｇｈｔꎬｈｉｓｔｏｒｙｏｆａｂｏｒｔｉｏｎꎬａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｒａｃｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｆａｃｔｏｒｓｆｏｒＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｐｒｅｇｎａｎｃｙ.Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｓｉｎｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ(ａｌｌＰ<０.０５)ꎻｍｕｌｔｉ￣ｆａｃｔｏｒｌｏｇｉｓｔｉｃｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｇｅꎬｗｅｉｇｈｔꎬｈｉｓｔｏｒｙｏｆａｂｏｒｔｉｏｎꎬａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｒａｃｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅｏｃｃｕｒ￣ｒｅｎｃｅｏｆＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅｓｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｅｒｕｐｔｕｒｅｏｆｆｅｔａｌｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｐｒｅｍａｔｕｒｅｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｉｎｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｉｎｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ(ｂｏｔｈＰ<０.０５).Ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏａｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｐｏｓｔｐａｒｔｕｍｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ(ｗｉｔｈχ２ｖａｌｕｅ０.６２４ꎬＰ>０.０５).Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅｓｏｆｆｅｔａｌｄｉｓｔｒｅｓｓꎬｃｈｏｒｉｏａｍｎｉｏｎｉｔｉｓａｎｄｎｅｏｎａｔａｌｊａｕｎｄｉｃｅｉｎｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈ￣ｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｓｉｎｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅＧＢＳｃｏｌｉｎ￣ｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓｈｉｇｈｅｒｉｎｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｒａｃｔｉｎＳｈｅｎｙａｎｇａｒｅａ.ＴｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＧＢＳｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓｈｏｕｌｄｂｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎｔｈｅｌａｔｅｓｔａｇｅｏｆｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎ.ＴｈｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｇｅꎬｗｅｉｇｈｔꎬｈｉｓｔｏｒｙｏｆａｂｏｒｔｉｏｎꎬａｎｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｒａｃｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.Ｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｔｈｅｈｅａｌｔｈｅｄｕｃａ￣ｔｉｏｎｆｏｒｐｅｒｉｎａｔａｌｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓꎬａｎｄｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｍａｔｅｒｎａｌａｎｄｃｈｉｌｄｏｕｔｃｏｍｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＭａｔｅｒｎａｌｐｅｒｉｎａｔａｌｐｅｒｉｏｄꎻＧｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓꎻＲｉｓｋｆａｃｔｏｒ㊀㊀Ｂ族链球菌(ｇｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓꎬＧＢＳ)是革兰阳性㊁β溶血的兼性厌氧菌ꎬ定植于人体直肠和阴道ꎬ是一种条件致病菌[１]ꎮＧＢＳ是导致孕产妇围产期感染的一种主要致病菌ꎮ孕晚期感染ＧＢＳ可导致孕妇早产㊁绒毛膜羊膜炎㊁胎膜早破和产褥感染等一系列不良妊娠结局[２]ꎮ新生儿感染ＧＢＳ可引起新生儿肺炎㊁脑膜炎和败血症等严重疾病ꎬ甚至死亡[３]ꎮ在欧洲㊁美洲及非洲等地孕妇ＧＢＳ定植率为６.５％~３６.０％[４]ꎮ目前ꎬ中国因ＧＢＳ取材部位㊁检测方法和地域等因素ꎬ定植率差异很大ꎮ北京地区为７.１％ꎬ台湾地区则可达到２０.０％[５－６]ꎮ对沈阳地区孕晚期孕妇采集阴道拭子及直肠拭子ꎬ使用美国ＣＤＣ推荐的在培养前先增菌后培养的方法[２]ꎬ对标本进行培养及鉴定ꎬ以了解本地区围产期孕妇ＧＢＳ定植率㊁感染高危因素及对母婴结局的影响ꎬ旨在为防治ＧＢＳ感染ꎬ优化母婴结局提供参考依据ꎮ１㊀资料与方法１.１㊀资料来源㊀选取２０１７年９１１月在沈阳市妇婴医院进行ＧＢＳ检测的孕妇７３２例ꎬ后期失访４１例ꎬ纳入研究６９１例ꎮ纳入标准:孕妇同意参与此研究ꎬ自愿签署知情同意书者ꎻ单胎者ꎮ孕妇排除标准:①近期有抗生素使用史者ꎻ②患严重肺㊁心功能疾病或者全身疾病者ꎻ③患急性感染及生殖器存在畸形者ꎻ④知情拒绝者ꎻ⑤拟终止妊娠者ꎮ研究经本医院伦理委员会研究同意ꎬ孕妇及家属均签署知情同意书ꎮ所有孕妇的孕周均经末次月经确认及Ｂ超检查核对ꎮ详细收集产妇的年龄㊁文化程度㊁流产史㊁血压㊁血糖㊁生产史㊁妊娠期合并症㊁妊娠期并发症㊁分娩方式㊁生殖道感染病史等资料ꎬ并详细记录产妇的母婴结局ꎮ１.２㊀菌株㊀金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２５９２３标准菌株购自杭州天和微生物试剂有限公司ꎮ１.３㊀主要试剂及仪器㊀成品血琼脂培养基购自郑州安图生物工程股份有限公司ꎻ增菌培养基干粉购自杭州天和微生物试剂有限公司ꎮＣＯ２孵育箱购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司ꎻＤＬ￣９６Ⅱ细菌测定系统购自珠海迪尔生物工程有限公司ꎮ１.４㊀取样方法㊀参照２０１０年美国ＣＤＣ推荐的ＧＢＳ培养取材方法ꎬ对妊娠３１~４０周孕妇分别采集阴道下１/３和直肠拭子进行细菌培养ꎬ任何一个部位阳性即认为存在ＧＢＳ的定植[１]ꎮ具体方法为:先擦去外阴分泌物ꎬ使用无菌棉拭子放入阴道下１/３内ꎬ轻轻旋转采集阴道分泌物ꎻ再将另外一根无菌棉拭子插人肛门ꎬ在肛门括约肌上２~３ｃｍ处沿肠壁轻轻旋转ꎬ取得直肠分泌物ꎮ取材时不需要使用阴道窥器ꎮ１.５㊀样本处理㊀将培养标本在增菌培养基内增菌１８~２４ｈꎬ然后取增菌后的液体用无菌接种环三区划线接种于血琼脂平板培养基ꎬ置于３５ħ㊁５％ＣＯ２孵育箱中孵育１８~２４ｈꎬ挑选灰白㊁圆形㊁半透明㊁中等大小㊁β溶血的单个菌落制成浊度为２.０的菌悬液ꎬ上机鉴定ꎬ并做ＣＡＭＰ试验辅助判定ꎮ跟踪查阅统计受试孕妇相关信息ꎮ１.６㊀统计学分析㊀统计分析采用ＳＰＳＳ１９.０统计软件进行ꎮ受试者相关信息完整作为质控标准ꎬ若信息不完全则排除ꎬ不纳入统计ꎮ计量资料以ｘʃＳＤ表示ꎬ计数资料以百分率表示ꎮ同种感染因素不同组间比较采用卡方检验ꎬＰ<０.０５为差异具有统计学意义ꎮ回归系数以Ｂ表示ꎬ标准误以ＳＥ表示ꎬ相对危险度以ＯＲ值表示ꎬ９５％可信区间以９５％ＣＩ表示ꎮ将单因素分析中有统计学意义的危险因素纳入Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归方程ꎬ进行ＧＢＳ感染相关危险因素的多因素Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析ꎬＰ<０.０５为差异具有统计学意义ꎮ２㊀结㊀果２.１㊀概况㊀６９１例孕妇年龄２０~４２(２７.４６ʃ１.０９)岁ꎬ其中高龄(>３５~４２岁)孕妇２００例ꎻ孕周３１~４０(３５.７８ｍʃ１.０２)周ꎻ体重６５~８０(６９.４５ʃ２.４０)ｋｇꎻ经产妇１５６例ꎬ初产妇５３５例ꎻ流产史者１７４例ꎬ其中多次流产史(ȡ３次)孕妇３２例ꎮ６９１例孕妇中共检测出ＧＢＳ感染５３例ꎬ未感染者６３８例ꎬＧＢＳ感染率为７.６７％(５３/６９１)ꎬ其中阴道拭子阳性率为４.６３％(３２/６９１)ꎬ直肠拭子阳性率为６.２２％(４３/６９１)ꎮ经单因素分析孕妇ＧＢＳ感染的危险因素ꎬ比较不同教育程度㊁生产史㊁分娩方式㊁甲状腺异常㊁妊娠期高血压㊁妊娠期贫血和妊娠期糖尿病ꎬ组间差异均无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎬ见表１ꎮ表１㊀比较感染与未感染组孕妇围产期生殖道ＧＢＳ感染危险因素Ｔａｂ.１㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｐｅｒｉｎａｔａｌｐｅｒｉｏｄ感染因素感染组样本数(例)构成比(％)未感染组样本数(例)构成比(％)χ２Ｐ教育程度高中以下１２２２.６４１６３２５.５５０.２１９０.６４０大专以上４１７７.３６４７５７４.４５生产史初产妇４５８４.９１４９０７６.８０１.８３８０.１７５经产妇８１５.０９１４８２３.２０分娩方式顺产２０３７.７４３２３５０.６３０.２４８０.６１９剖宫产２６４９.０６３１５４９.３７甲状腺异常有１１.８９１９２.９８０.２０７０.６４９无５２９８.１１６１９９７.０２妊娠期高血压有１０１８.８７７７１２.０７２.０５５０.１５２无４３８１.１３５６１８７.９３妊娠期贫血有１５２８.３０２３５３６.８３１.５４３０.２１４无３８７１.７０４０３６３.１７妊娠期糖尿病有２１３９.６２２３９３７.４６０.０９７０.７５５无３２６０.３８３９９６２.５４２.２㊀围产期ＧＢＳ感染危险因素的单因素分析㊀单因素分析结果显示ꎬ孕妇ＧＢＳ感染相关危险因素可能有年龄㊁体重㊁流产史和生殖道感染ꎬ组间差异均有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎬ见表２ꎮ２.３㊀围产期ＧＢＳ感染危险因素的多因素Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析㊀将ＧＢＳ感染作为因变量ꎬ单因素分析中与ＧＢＳ感染相关的危险因素作为自变量进行多因素Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析ꎬ结果显示ꎬ年龄㊁体重㊁流产史和生殖道感染均为影响ＧＢＳ感染发生的独立危险因素ꎬ组间差异均有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎬ见表３ꎮ２.４㊀两组孕妇妊娠结局比较㊀两组孕妇胎膜早破㊁早产发生率比较ꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎻ产后出血发生率比较ꎬ差异无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎬ见表４ꎮ２.５㊀两组新生儿结局比较㊀两组新生儿胎儿窘迫㊁绒毛膜羊膜炎㊁新生儿黄疸发生率比较ꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.０５)ꎬ见表５ꎮ表２㊀比较感染与未感染组孕妇围产期生殖道ＧＢＳ感染危险单因素分析Ｔａｂ.２㊀ＵｎｉｖａｒｉａｔｅａｎａｌｙｓｉｓｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｐｅｒｉｎａｔａｌｐｅｒｉｏｄ感染因素感染组样本数(例)构成比(％)未感染组样本数(例)构成比(％)χ２Ｐ年龄(岁)２０~<３５４４８３.０２４４７７０.０６３.９９４０.０４６３５~４２９１６.９８１９１２９.９４体质量(ｋｇ)<７０７１３.２１１７９２８.０６５.４８５０.０１９ȡ７０４６８６.７９４５９７１.９４流产史有６１１.３２１６８２６.３３５.８５３０.０１６无４７８８.６８４７０７３.６７生殖道感染有１５２８.３０１０１１５.８３５.４４８０.０２０无３８７１.７０５３７８４.１７表３㊀孕妇ＧＢＳ感染危险因素Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析Ｔａｂ.３㊀ＬｏｇｉｓｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎ自变量ΒＳＥχ２ＰＯＲ９５％ＣＩ年龄０.８８１０.３８１９.４４６０.０２４２.４５３１.２１５~３.４７６体质量０.５２８０.３２５３.３４７０.０３２２.４３６１.１３５~４.１２６流产史０.３３４０.３１６４.８７６０.０１４２.１２７１.１７３~３.２９１生殖道感染０.２５７０.３７４１８.２４２０.０２５３.２７４１.５２８~５.４１９表４㊀比较感染与未感染组孕妇妊娠结局Ｔａｂ.４㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎ孕妇结局感染组样本数(例)构成比(％)未感染组样本数(例)构成比(％)χ２Ｐ胎膜早破２１３９.６２１５１２.３６６.６６３０.０１０产后出血１１.８８２６４.０７０.６２４０.４２９早产３５.６６１０１.５６４.１５６０.０４１表５㊀ＧＢＳ两组新生儿结局对比Ｔａｂ.５㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆｎｅｏｎａｔａｌｏｕｔｃｏｍｅｓｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔＧＢＳｉｎｆｅｃｔｉｏｎ新生儿结局感染组样本数(例)构成比(％)未感染组样本数(例)构成比(％)χ２Ｐ胎儿窘迫４７.５４１２１.８８６.９４６０.００８绒毛膜羊膜炎４７.５４１４２.１９５.５２７０.０１９新生儿黄疸５０.５３２０３.１３５.３６３０.０２１３㊀讨㊀论研究认为ꎬＧＢＳ在健康人群中带菌率为１５.０％~３５.０％ꎬ孕妇群体则占１０％~３０％ꎬ是一种条件致病菌ꎬ可能导致新生儿感染ꎬ死亡率较高[７]ꎮ研究发现ꎬ沈阳地区孕妇生殖道ＧＢＳ定植率较高ꎬ年龄㊁体重㊁流产史和生殖道感染均为ＧＢＳ感染发生的独立危险因素ꎬ且妊娠期ＧＢＳ感染使不良妊娠结局的危险性增加ꎮ在６９１例孕妇中ꎬ共检测出ＧＢＳ感染５３例ꎬ未感染者６３８例ꎬＧＢＳ感染率为７.６７％(５３/６９１)ꎬ其中阴道拭子阳性率为４.６３％(３２/６９１)ꎬ直肠拭子阳性率为６.２２％(４３/６９１)ꎮ这与黄晓玲等[８]的研究报道基本一致ꎬ直肠试子的阳性率高于阴道拭子ꎮ因此ꎬＧＢＳ筛查时有必要同时采集阴道及直肠拭子ꎬ不能仅选用阴道拭子ꎬ这会造成漏检及阳性率的降低ꎮ有研究认为ꎬ南方的ＧＢＳ定植率略高于北方ꎮ研究发现ꎬ在规范取材及规范培养的前提下ꎬ沈阳地区的ＧＢＳ定植率并未如想象中的那样低ꎬ故需对本地区孕妇进行常规筛查ꎮ孕妇ＧＢＳ感染的危险因素ꎬ如教育程度㊁生产史㊁分娩方式㊁甲状腺异常㊁妊娠期高血压㊁妊娠期贫血和妊娠期糖尿病等比较ꎬ差异均无统计学意义(Ｐ>０.０５)ꎮ这提示上述因素对孕妇围产期ＧＢＳ感染无明显影响ꎬ与刘永连[９]报道基本一致ꎮ曾白华等[１０]研究认为ꎬ妊娠期甲状腺异常是ＧＢＳ感染的独立高危因素ꎬ与本研究不同ꎬ可能与地域差异因素有关ꎮ感染组孕妇年龄㊁体重㊁流产史和生殖道感染比例均高于未感染组ꎬ提示年龄㊁体重㊁流产史及生殖道感染可能是影响孕妇围产期ＧＢＳ感染的重要因素ꎮ使用Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析也发现ꎬ年龄㊁生殖道感染为影响ＧＢＳ感染发生的独立危险因素ꎬ与廖宗琳[７]等报道一致ꎬ可能随着年龄增加体质可能变弱有关ꎮ随着中国二胎政策的全面放开ꎬ高龄孕妇增加ꎬ应加强ＧＢＳ的筛查力度ꎮ体重是影响ＧＢＳ定植的一个高危因素ꎬ体重的增加ꎬ会造成体内激素水平变化ꎬ导致生殖道微生态的改变ꎬ进而导致ＧＢＳ感染的发生[１０]ꎬ但具体原因有待进一步证实ꎮ多次流产造成阴道抵抗力降低㊁生殖道感染发生ꎬ导致乳酸杆菌菌群失衡ꎬ易导致ＧＢＳ感染[１１]ꎮ感染组的孕妇胎膜早破㊁早产发生高于未感染组ꎬ提示ＧＢＳ感染增加孕妇不良妊娠结局风险ꎬ与廖宗琳[７]等报道基本一致ꎮ产后出血的发生与ＧＢＳ感染的分析ꎬ差异无统计学意义ꎬ这与刘永连[９]报道基本一致ꎮ感染组新生儿胎儿窘迫㊁绒毛膜羊膜炎㊁新生儿黄疸发生率高于未感染组ꎬ这与张兰等[１１]报道基本相同ꎮ妊娠期ＧＢＳ感染可能导致新生儿发生不良结局危险增加ꎮ由于客观条件限制ꎬ研究存在局限性ꎮ样本采集时ꎬ放宽了对于孕周数的限制ꎻ对有早产风险<３５周孕妇及对>３７周孕妇均进行样本采集ꎮ所得数据与美国ＣＤＣ推荐的对３５~３７周孕妇开展ＧＢＳ筛查ꎬ可能存在差异ꎬ造成ＧＢＳ感染对母婴结局可能有影响ꎮ综上所述ꎬＧＢＳ作为围产期孕妇和新生儿感染的重要致病菌ꎬ在沈阳市孕晚期孕妇中具有一定的定植率ꎬ故应对本地区的孕妇于孕晚期进行ＧＢＳ普遍筛查ꎮ应加强对高龄孕妇ＧＢＳ的筛查力度ꎮ加强对本地区围产期孕妇的健康宣教ꎬ以降低ＧＢＳ感染ꎬ改善母婴结局ꎮ参考文献[１]㊀ＶＥＲＡＮＩＪＲꎬＭＣＧＥＥＬꎬＳＣＨＲＡＧＳＪꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉ￣ｎａｔａｌｇｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｄｉｓｅａｓｅ.ＲｅｖｉｓｅｄｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｒｏｍＣＤＣꎬ２０１０[Ｊ].ＭＭＷＲＲｅｃｏｍｍＲｅｐꎬ２０１０ꎬ５９(ＲＲ￣１０):１￣３６. [２]㊀ＳＣＨＮＡＲＲＪꎬＳＭＡＩＬＬＦ.Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｒｉａａｎｄｓｙｍｐｔｏｍ￣ａｔｉｃｕｒｉｎａｒｙｔｒａｃｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎｐｒｅｇｎａｎｃｙ[Ｊ].ＥｕｒＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔꎬ２００８ꎬ３８(２):５０￣５７.[３]㊀ＮＩＥＬＳＥＮＭꎬＳＨＥＩＫＨＮꎬＦＩＴＺＧＥＲＡＬＤＥꎬｅｔａｌ.Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｅａｒｌｙ￣ｏｎｓｅｔｉｎｖａｓｉｖｅｇｒｏｕｐＢＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｄｉｓｅａｓｅｉｎｎｅｏｎａｔｅｓｉｎａｎＩｒｉｓｈｈｏｓｐｉｔａｌ(２００１￣２０１４):ａｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅａｕｄｉｔ[Ｊ].ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ(Ｌｏｎｄ)ꎬ２０１７ꎬ４９(６):４６６￣４７０.[４]㊀ＢＡＲＣＡＩＴＥＥꎬＢＡＲＴＵＳＥＶＩＣＩＵＳＡꎬＴＡＭＥＬＩＥＮＥＲꎬｅｔａｌ.ＰｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｍａｔｅｒｎａｌｇｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎｉｎＥｕｒｏ￣ｐｅａｎｃｏｕｎｔｒｉｅｓ[Ｊ]ꎬＡｃｔａＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌＳｃａｎｄꎬ２００８ꎬ８７(３):２６０￣２７１.[５]㊀ＬＵＢꎬＬＩＤꎬＣＵＩＹꎬｅｔａｌ.ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆＧｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｉｎＢｅｉｊｉｎｇꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉ￣ｏｌＩｎｆｅｃｔꎬ２０１４ꎬ２０(６):３７０￣３７３.[６]㊀ＣＨＡＮＧＬＹ.ＭａｔｅｒｎａｌｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｎｅｏｎａｔａｌｇｒｏｕｐＢｓｔｒｅｐｔｏ￣ｃｏｃｃａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎ:ｔｉｍｅｔｏｕｎｉｖｅｒｓａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｉｎｔｒａｐａｒｔｕｍｃｈｅｍｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓｉｎＴａｉｗａｎ?[Ｊ].ＰｅｄｉａｔｒＮｅｏｎａｔｏｌꎬ２０１１ꎬ５２(４):１８１￣１８２.[７]㊀廖宗琳ꎬ陈丽霞ꎬ沈宏志ꎬ等.围产期孕妇生殖道Ｂ族链球菌感染的影响因素分析及对妊娠结局的影响[Ｊ].中华医院感染学杂志ꎬ２０１８ꎬ２８(２):２４７￣２４９.[８]㊀黄晓玲ꎬ何艳君ꎬ林云霞.中山市妊娠晚期妇女Ｂ族链球菌带菌情况调查[Ｊ].实用医学杂志ꎬ２０１５ꎬ３１(１７):２９０５￣２９０６. [９]㊀刘永连.孕妇围产期Ｂ族链球菌感染危险因素的Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析[Ｊ].中国实用期刊ꎬ２０１８ꎬ４５(１):８６￣８８.[１０]㊀曾白华ꎬ吕禄平ꎬ王豫川ꎬ等.孕晚期妇女Ｂ族链球菌定植情况与高危因素分析[Ｊ].徐州医科大学学报ꎬ２０１７ꎬ３７(１０):６５８￣６６０.[１１]㊀张兰ꎬ朱樱梅ꎬ李敏许ꎬ等.妊娠期Ｂ族链球菌感染的高危因素及其对新生儿预后影响分析[Ｊ].中国妇幼健康研究ꎬ２０１７ꎬ２８(６):７３１￣７３３.收稿日期:２０１８￣０７￣１０㊀修回日期:２０１８￣１２￣１７编辑:王浩。