质粒大规模提取方法

E.Z.N.A. Plasmid Maxi Kit (D6922-01)质粒大规模提取试剂盒

注意：

1．使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液Ⅰ. 4℃保存

2．加84ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中.室温保存

除试剂盒外还需准备：配有浮桶式转头(吊桶式转头)的离心机

可达到12000×g的高速离心机

50ml无菌离心管

高速离心管

无菌去离子水或TE缓冲液

纯乙醇

操作规程：(提取过程在室温下进行)

1．将带有目的质粒的大肠杆菌接种到200－500ml LB（含氨苄青霉素50μg/ml），1－4升培养瓶中37℃震荡培养过夜（12-16h）

需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.

2．取500ml菌液装入适当管子(推荐用250ml离心瓶)中，室温下3500-5000×g离心10min

3．小心去上清，用洁净纸巾吸干管壁残留液体。加7.0ml溶液Ⅰ，吹打数次，用旋涡振荡仪充分悬浮沉淀

4．移入50ml至少可承受12000×g的离心管，加7.0ml溶液Ⅱ，轻轻来回翻转混合7－10次，至澄清裂解液

注意：必须室温下孵育5－10min

避免大力混合，以减少对染色体DNA的机械力切割，提高质粒纯度

5．加10ml溶液Ⅲ，温和倒转数次，至有絮状沉淀形成

室温孵育5min并不时混合

室温离心10min得到致密的基因组DNA和碎屑团块

6．特别小心地吸取上清，加到装配好容积50ml离心管的大型吸收柱，上盖，装入吊桶式转头，室温3000-4000×g离心5min

注意：确保没有搅动沉淀以保证质粒回收率

有必要牺牲2－4ml溶菌产物

单次最多加25ml溶菌产物，如果较多，分2次加入

可用此管直接重复步骤6

注意：接下来的步骤都会用到浮桶式转头(吊桶式转头)离心机（用固定角转头会使提供的50ml离心管变形或破裂）

7．加50ml HB缓冲液到吸收柱，上盖，室温3000-4000×g离心5min（此步为确保除尽剩余蛋白，同时使后面的操作得到的是高纯度DNA）

8．加10ml用乙醇稀释的DNA Wash Buffer，上盖，室温3000-4000×g离心5min，弃掉滤过液

注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签

如果经过冷冻，用前必须恢复室温

9．此步可选：重复步骤8

10. 加10ml纯乙醇，室温3000-4000×g离心5min，弃掉滤过液

11. 将空管上盖3000-4000×g离心10min甩干（用移液器去掉甩到离心管中的乙醇）

注意：此步必做！残留的乙醇会影响接下来的步骤

12. 洗脱DNA之前可用以下方法进行干燥，以得到更干燥的吸收柱（如果没有真空箱/室，可直接执行步骤13）

方法A：取出吸收柱，将吸收柱在真室箱/室中15min，执行步骤13

方法B：取出吸收柱，在65℃真空干燥箱或恒温箱中干燥10-15min，执行步骤13

13. 将吸收柱放入干净50ml离心管，加1-2ml(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，3500×g离心5min，一次可洗脱70%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）

建议：洗脱前，如果将吸收柱放入70℃热水中浸泡2min，会明显提高回收率同时得到高浓度DNA

注意：清除在吸收柱内部O形圈边缘的DNA Wash Buffer残留非常重要

如果在洗脱前没有真空干燥吸收柱，最后需对质粒DNA进行净化，方法如下：

加氯化钠到洗脱液至终浓度200mM，再加0.8体积的异丙醇，旋涡振荡混合，10000×g离心10min，用70%乙醇清洗沉淀，10000×g离心10min，轻轻倒出上清，短暂风干，用200-500μl无菌去离子水或TE 缓冲液再悬浮DNA

14. 检测：

方法A：分别在260nm和280nm波长下测定20-50倍稀释液的吸光度

DNA浓度＝260nm吸光度×50×稀释因子μg/ml

高质粒拷贝数能达到500ml培养液得到1mg DNA，如果260nm吸光度/280nm吸光度大于1.8，说明核酸大于90%。

方法B：和预知浓度DNA样品（Marker）一起做琼脂糖凝胶/嗅乙啶电泳，对比结果

（通常情况得到的DNA是单体超螺旋，也有少量多联体）