四光栅技术与检测技术概览

2020/7/21, p 4 新药研发与自动化
双光栅技术
光线在经过一级光栅分光后经由中间狭缝(Intermediate Slit)达到第二级光
栅进一步分光口，由出口狭缝（Exit Slit）得到高纯度的单色光
双光栅技术可以极大地抑制杂光的影响（一级光栅可将杂光抑制到10-3，
二级光栅可将杂光抑制到10-6）
帝肯的Safire采用的是加和式双光栅配置，Safire2以后的所有光栅型酶标仪则 均采用差减式双光栅配置
2020/7/21, p 6 新药研发与自动化
四光栅的基本原理
4光栅（Quad4 Chromator）光路包括双光栅激发光光路及双光
栅发射光光路。
使用双光栅光路的最大好处是可以极大的抑制杂光（Stray Light）
荧光共振能量转移模式
• Quad4 Chromator提供高速的波长切换，实现高效的比值测定（ratio measurement）
时间分辨荧光能量转移模式
• 时间分辨与能量结合技术的结合，实现更高的灵敏度
发光模式
• 检测光纤Z周自动调节与PMT动态增益技术 • 持续发光（通常指发光时间持续1分钟以上 • 瞬时发光（配合加样器选件） • 以及双色发光
及M1000在内的3款4光栅多功能酶标仪
2020/7/21, p 3 新药研发与自动化
光栅的基本原理
基于入射光照射到微小pattern上时衍射光的光干涉而实现的光色散 相比传统的平板直刻条纹光栅（ruled monochromator），曲面
Holograph蚀刻光栅（concaved holograph monochromator）由于更 容易加工，以及具有更紧凑的结构及更佳的分光能力而得到广泛的利用。
A280吸光度值用于蛋白质定量
2020/7/21, p 23 新药研发与自动化
核酸定量的酶标仪选择基准
对应波长范围
• Infinite 系列酶标仪器: 230nm-1000nm
波长准确度
• Infinite M200 Pro: < ± 0.3 nm for λ ≤ 315 nm
样本预计浓度不同，推荐的方法也不同
帝肯4光栅与带宽调节技术的结合赋予其光栅型酶标仪难以比拟的 优势：
真正的全波长应用
• Quad4 Chromator提供从紫外到红外的真正全波长应用；由于Quad4 Chromator不采用任何波长截断滤光片，在全波长范围内不会出现波长失真情 况。
更高的灵敏度
• Quad4 Chromator采用差减式双光栅设计，在极大的抑制杂光的同时，保证 达到检测物质的光强。
帝肯多功能酶标仪提供多彩的检测模式
光吸收模式
• 单或多通道光吸收测量 • M1000提供高速的“飞行”测量模式
荧光强度模式
• 顶部或底部
荧光偏振模式
• 实现高速偏振片切换
时间分辨荧光模式
• 结合可变频激发模式及无级带宽可调技术
2020/7/21, p 11 新药研发与自动化
帝肯多功能酶标仪提供多彩的检测模式（续）
吸光度范围
• 0-4 O.D.
对应微孔板格式
• 96孔还是384孔?
检测速度
• 多通道还是单通道检测？
温控能力
• 有些ELISA应用需要温度控制， • 温度均一性，避免边界效应
震荡能力 数据处理能力
• 结果简化能力 • 自动质控能力
2020/7/21, p 22 新药研发与自动化
光吸收应用例2：核酸/蛋白质定量
2020/7/21, p 30 新药研发与自动化
多功能酶标仪的常见检测手法
FP
• Invitrogen: Far-Red PolarScreenTM • Invitrogen: Glucocorticoid Receptor AssayTM
Lumi
• Flash Lumi – e.g. Ca2+ Detection • Glow Lumi – e.g. Reporter Gene Assays
使用NanoQuant对蛋白质定量应用例
2020/7/21, p 25 新药研发与自动化
蛋白质定量的其他方法
Bradford Assay
• 蛋白质与Coomassie Brilliant Blue结合
BCA™ Protein Assay
• Cu(+)螯合物
Modified Lowry Protein Assay
FIREFLY LUCIFERASE ATP, CO2, Mg2+
Oxyluciferin + light
2020/7/21, p 39 新药研发与自动化
各种检测模式的局限性（可能的影响因素）
局限性
体积/液面 背景荧光 内滤光效应 光散射 光漂白 自荧光 磷光 分子量 光猝灭
荧光强度 荧光偏振 时间分辨 能量转移 时间分辨 荧光寿命 能量转移
A260/A280 的吸光度比用于核酸的定性与定量
• OD260=1.0相当于
• 50 g/ml双链DNA • 40 g/ml单链DNA（或RNA） • 20 g/ml寡核苷酸
• 判断核酸样品的纯度
• DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 • RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
• 改进的Lowry法
2020/7/21, p 26 新药研发与自动化
Bradford Assay
2020/7/21, p 27 新药研发与自动化
BCA™ Protein Assay
2020/7/21, p 28 新药研发与自动化
Modified Lowry Protein Assay
2020/7/21, p 29 新药研发与自动化
多功能酶标仪的常见荧光/发光检测手法 FRET
• PE: BRET2TM • Invitrogen: Z’LyteTM • Invitrogen: Gene BlazerTM
TRF
• PE: Delfia ®
TR-FRET
• CisBio: HTRF ® • Invitrogen: LanthaScreenTM • PE: LanceTM
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
(x)
Thank you for your attention
2020/7/21, p 8 新药研发与自动化
帝肯光栅型多功能酶标仪的更多专利技术
无级可调带宽技术（Stepless Adjustable Bandwidth Setting）
支持激发光与发射光光栅系统的带宽无级调节，从而实现对不同的 代测荧光体测定条件的最优化。
来自百度文库
2020/7/21, p 9 新药研发与自动化
B
Eu, Tb = DONOR
Allophycocyanine (XL-665),
Fluorescein, Rhodamine =
ACCEPTOR
选用长寿命荧光体作为给体（通常为稀土类元素）
2020/7/21, p 36 新药研发与自动化
TR-FRET原理
2020/7/21, p 37 新药研发与自动化
时间分辨测定原理
代测荧光团荧光寿命介于微 秒到毫秒之间
适当的延迟时间以消除背景
荧光的影响
优选积分时间获得最大信号 优点：低背景及高信噪比
荧光
400
800
激发光托尾 积分时间
time (s)
2020/7/21, p 35 新药研发与自动化
TR-FRET
X nm
TR-FRET
Y nm
Z nm
A
2020/7/21, p 5 新药研发与自动化
Additive/Subtractive双光栅
双光栅可选择采用加和式（Additive）或差减式(Subtractive)配置 差减式配置采用特别的光轴配置，在有效抑制杂光及高次分光的同时，二级光
栅通过可实现光线的位相均一化，相当于一个Bandpass Filter。差减式双光栅 被广泛应用于荧光/发光光度计中
2020/7/21, p 12 新药研发与自动化
光吸收模式
2020/7/21, p 13 新药研发与自动化
荧光模式
2020/7/21, p 14 新药研发与自动化
发光模式
2020/7/21, p 15 新药研发与自动化
内容提要
帝肯公司简介 帝肯Detection事业部简介 “4光栅”技术与Infinite系列多功能酶标仪 多功能酶标仪的常见应用 新产品介绍
Acceptor
TAMRA Cy5 Fluorescein DABCYL EYFP Fluorescein Allophycocyanine, Cy5 Fluorescein, Rhodamine
2020/7/21, p 33 新药研发与自动化
BRET原理（给体及受体为发光蛋白）
2020/7/21, p 34 新药研发与自动化
• 无级可调带宽技术可实现对特定荧光物质的最佳检测条件
• M1000在提供全波长应用的同时，也提供惊异的比美滤光片型酶标仪的敏感度。
更快的扫描速度
• Quad4 Chromator技术极大的提高荧光光谱扫描，实现高速3D荧光光谱；这 对未知荧光物质的特定与特性剖析极为有用。
2020/7/21, p 10 新药研发与自动化
荧光偏振原理
荧光体（小分子）受激发后高速自转，几乎无荧光偏振 同大分子结合后荧光体自转变慢，实现荧光偏振测量
2020/7/21, p 38 新药研发与自动化
发光检测（持续发光或瞬间发光）
钙离子流测定:瞬间发光
AEQUORIN
Ca2+
LUMINESCENCE SIGNAL
持续发光
Luciferin
2020/7/21, p 16 新药研发与自动化
多点测量 A
16
2020/7/21, p 17 新药研发与自动化
多点测量 B
17
2020/7/21, p 18 新药研发与自动化
检测器自动/手动Z轴聚焦（高度调整） 寻找微量样品的信号检测焦点，减少试剂使用 减少检测器与检测板间隙，使孔间干扰降到最低
抗体
抗原
固态基质（微孔板）
E
偶联物
S
底物
ES
PP
2020/7/21, p 21 新药研发与自动化
ELISA为主酶标仪的选择基准
对应波长
• 波长范围（F50:400-700nm, Sunrise:340-750nm)
• 常见应用波长 • 滤光片：405/450/492/620nm （F50/Sunrise) • Rainbow滤光片：Sunrise
• 中高浓度核酸（2ug-3700ug/ml）/微量体积（1-2ul）：吸收光
• NanoQuant
• 中等浓度核酸（2ug-200ug/ml）/普通体积（100ul）：吸收光
• UV透明微孔板
• 低浓度核酸（1ng/ml-20ug/ml）：荧光
• PicoGreen，黑色微孔板
2020/7/21, p 24 新药研发与自动化
2020/7/21, p 31 新药研发与自动化
FRET原理
X
nm
D
给体
Ex1 / Em1
Y
nm
10-100 Å
能量转移
Z nm
A
受体
Ex2 / Em2
Em1 ~ Ex2
2020/7/21, p 32 新药研发与自动化
常见FRET染料对
Donor
Fluorescein Cy3 IAEDANS EDANS ECFP Coumarin Europium Terbium
2020/7/21
帝肯四光栅和检测技术概览
帝肯（上海）贸易有限公司
2020/7/21, p 2 新药研发与自动化
帝肯4光栅酶标仪研发十年
帝肯从1999年研发第一台4光栅多功能酶标仪（Safire）开始，一
直致力于为科研及药物研发提供最先进的检测设备。
目前帝肯提供包括Infinite M200 Pro, Infinite Nanoquant Pro,以
对检测结果的影响; 好的双光栅可以将杂光抑制到入射光强的10-6 以下
帝肯最新一代Premium Quad4 Chromator更是将杂光率降低至 2x10-7的极低水平。
2020/7/21, p 7 新药研发与自动化
帝肯4光栅动画 VI_INF200_Quad4 small 102006.wmv
18
2020/7/21, p 19 新药研发与自动化
多功能酶标仪的常见检测手法
光吸收
• 吸光度（定量） • 光谱学特征（吸光光谱）
荧光
• 荧光强度及其衍生方法 • 荧光光谱学研究（激发/发射/3D）
发光
• 单色/双色发光 • 稳态/瞬时发光
2020/7/21, p 20 新药研发与自动化
光吸收应用例1：ELISA:Enzyme linked immuno sorbant assay