马垂体促性腺激素的提取及其生物活性测定

马垂体采集
在冬季１２月份～１月份，马
屠宰后，立即采集垂体，置一２０℃冷冻保存，共采集
３
５２６匹马的垂体。 实验动物 １８日龄同批、同源雌性（昆明
１．１．２
ｍｏｎｅ，ＦＳＨ）和促黄体素（１ｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ， ＬＨ），两者合称为垂体促性腺激素（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｅ ｈｏｒｍｏｎｅ，ＧＴＨ）。它们可促进睾丸的精子形成、卵 泡成熟及参与黄体的形成，是垂体前叶产生的糖蛋 白激素［２］。ＦＳＨ能促进卵泡的早期发育，卵泡成熟 是ＦＳＨ和ＬＨ协同作用的结果。ＦＳＨ促进颗粒细 胞的增殖，多个卵泡生长。ＦＳＨ与少量ＬＨ协同作 用促进卵泡合成和分泌雌激素。ＦＳＨ促进卵泡生 长和成熟，使颗粒细胞上的ＬＨ受体增加，标志着卵 泡已成熟。成熟卵泡在ＦＳＨ和ＬＨ的作用下发生
万方数据
１８
动物医学进展２０１０年第３１卷第８期（总第２０６期）
１．２．３
酮中，以固定组织、脱水和脱脂；②剥离脑膜：手工剥 离垂体外周脑膜，剥离后的垂体浸入适量新鲜无水 丙酮中，共更换３次丙酮，垂体经３次丙酮浸泡后， 脱水和脱脂基本完成，从丙酮浸泡液中滤出垂体放 入真空干燥器中干燥［４］，称重；③分离：干燥后的垂 体，分离垂体前叶和后叶，保留垂体前叶备用。 １．２．２马促性腺激素的提取方法和步骤 用乙醇 法提取马垂体促性腺激素。具体步骤如下：①浸泡： 取垂体前叶颗粒用提取液充分溶胀；②捣碎匀浆：用 组织捣碎机充分捣碎匀浆，转入锥形瓶中；③振摇： 于锥形瓶脑垂体匀浆中加入提取液，在恒温振荡器 振摇；④离心：４℃条件下离心４０ ｍｉｎ收集上清液， 沉淀加提取液，再次捣碎组织匀浆，振摇，离心得上 清液，合并两次的上清液；⑤沉淀：将上清液在搅拌 下慢慢加入９５０ ｍＬ／Ｌ乙醇至乙醇浓度为７６ ｍＬ／Ｌ
～８０ ｍＬ／Ｌ；放入４℃冰箱，２４ ｈ后取出，收集白色
马垂体促性腺激素提取物生物活性测定
①试验分组。取同一来源的１８日龄的雌性昆明小 鼠，体重９ ｇ～１３ ｇ，随机分成４组，每组６只。第１ 组为ｈＣＧ组，取ｈＣＧ
１ ２５
Ｕ加１ ｍＬ生理盐水溶解；
第２组为垂体提取物组，取１ ｍｇ垂体提取物溶于 ｍＬ生理盐水中（１ ｍｇ／ｍＬ）；第３组为提取物和
ｇ；提取物＋ｈＣＧ组０．０７３
照组０．０４３ ５ ｇ。溶剂试验组子宫平均重量比空白
ｇ；提取物组０．０２６ ｇ；对照组０．０１７
１Βιβλιοθήκη Baidu
５
ｇ；提取物＋ｈＣＧ组
０．０２３ ３
ｇ。试验组小鼠卵巢平均
万方数据
王志琴等：马垂体促性腺激素的提取及其生物活性测定
１９
３讨论
３．１马垂体促性腺激素提取条件与要求 本提取试验采用提取液浸泡溶胀垂体前叶，用 组织捣碎机将溶胀后垂体前叶捣碎匀浆，更有利于 充分振摇提取，比采用粉碎过筛方法更方便。为避 免常温下影响马垂体提取物中促性腺激素的生物活 性，所有提取过程尽可能在低温条件下操作，以保持 提取物中促性腺激素的生物活性［５］。 ３．２提取中乙醇的作用与要求 脑垂体促性腺激素属糖蛋白激素，经提取处理，
２
２．１
结果
马垂体促性腺激素提取结果 从马脑垂体中提取获得促性腺激素粗品见表
沉淀物；⑥洗涤脱水：沉淀物用离心法分别加入无水 乙醇、乙醚洗涤脱水；⑦干燥：沉淀物连同离心管一 起，放入真空干燥器中干燥，得到白色垂体粗提物干 粉。⑧分装：无菌分装于灭菌小瓶中，冷冻保存，使 用时用生理盐水溶解即可。
表１
Ｔａｂｌｅ
文献标识码：Ａ
文章编号：１００７—５０３８（２０１０）０８一００１７—０４
中图分类号：Ｑ５７５．１２
家畜胚胎移植技术在畜牧业生产中应用日益广 泛，马的胚胎移植可挖掘优秀母马品种和个体的繁 殖潜力。试验证明，母马卵巢对其他种属来源的促 性腺激素不敏感，仅对马属动物来源的促性腺激素 有反应。由于马促性腺激素在国内外无商品出售， 使马的胚胎移植超数排卵研究和应用受到限制。提 取马垂体促性腺激素成为生产和科研中的紧迫任 务。 马的垂体位于脑的基底部，蝶骨体的脑垂体窝 内［１］。脑垂体分为腺垂体（前叶）和神经垂体（后叶） 两部分，腺垂体分泌７种激素，其中维持性腺机能的 两种激素是促卵泡素（ｆｏｌｌｉｃｌｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇ
ｎｕｍ个ｂｅｒｓ
Ｂａｔｃｈ批ｗ次ｅｉｇ垂ｈｔ俐ｏｆ
ｐｉｇｔｕｉｔａｒｙ
Ｅ提ｘｔｒ取ａｃ恻ｔ ｗｅｉｇｇｈｔ垂鬻∞。１¨憋黧葛∥’ ’∑：ｉ：：：二：：１。＝：Ｉ∑．Ｚ＝‘
Ｏ．５１１ ０．５８２ ０．５６９ ５．４８９
１３９
６３８
９３９ １８１０
５．４６４
５．３２２
０．５６４
５．４１０
合计Ｔｏｔａｌ 平均
摘
要：为了优化ＰＫ－１５细胞在微载体上的生长条件，在微载体浓度５ ｍｇ／ｍＬ、低糖ＤＭＥＭ＋ ＮＢＳ培养液条件下，观察４．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ和８．７×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ的细胞接种密度对细胞生长的
１００ ｍＬ／Ｌ
影响；在低糖ＤＭＥＭ＋１００ ｍＬ／Ｌ ＮＢＳ培养液、接种密度５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｇ条件下，观察３、５、１０ ｍｇ／ｍＬ微栽 体浓度对细胞生长的影响；在３ ｍｇ／ｍＬ微载体浓度条件下、接种密度２５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，观察ＭＥＭ、高糖 ＤＭＥＭ和低糖ＤＭＥＭ培养基对细胞生长的影响。结果表明，以微载体接种细胞密度４．５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｇ、 微载体浓度５ ｍｇ／ｍＬ在低糖ＤＭＥＭ培养基中培养方式效果最为理想。优化的培养工艺适用于ＰＫ一１５细胞
１．２方法
排孵副。
目前从猪脑垂体提取的ＦＳＨ和ＬＨ已在牛、羊 繁殖中广泛应用，主要用于提早家畜的性成熟，诱导 母畜发情，超数排卵处理，治疗母畜繁殖疾病和提高
１．２．１垂体预处理①固定：将冷冻保存的垂体解 冻后，在室温条件下，连脑膜一起放入适量的无水丙
－
收稿日期：２０１０—０４－２１
基金项目：新疆维吾尔自治区科技厅科技攻关项目（２００７４１１１８） 作者简介：王志琴（１９５７一），女，陕西西安人，副教授，主要从事畜产品检验检疫教学与科研工作。＊通讯作者
ｍｇ ｈＣＧ
ｈＣＧ组，取垂体提取物１ ｍｇ，加１ ｍＬ含２５
的生理盐水溶解；第４组为溶剂对照组；②注射方 法。每日上午ｌｏ：ｏＯ时，分别自小鼠颈部皮下注射 各组的试验药品溶液０．２ ｍＬ，每天１次，连续注射
３
ｄ。③测定。最后１次注射后２４ ｈ，将小鼠颈椎脱
臼处死，解剖。取出子宫和卵巢，剥离脂肪和周围组 织，在滤纸上吸干后，称取湿重，并计算子宫和卵巢 的平均重量。
动物医学进展。２０１０，３Ｉ（８）：１７—２０ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
马垂体促性腺激素的提取及其生物活性测定
王志琴１，陈静波“，董 红２，张国庭２，孙金权１
（１．新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐８３００５２；２．新疆畜牧科学院畜牧科学研究所，新疆乌鲁木齐８３００００）
用７６０ ｍＬ／Ｌ～８００ ｍＬ／Ｌ乙醇作为沉淀剂使糖蛋白
３．４马垂体提取物生物活性测定效果判断 本试验用小鼠测定马脑垂体提取物的生物活 性，结果表明从马脑垂体中提取出的提取物含有促 性腺激素，能对小鼠卵巢和子宫产生作用，使小鼠的 卵巢颜色出现红色的变化（有卵泡发育），卵巢表面 有红色排卵点，与对照组有明显区别，可以确定马脑 垂体提取激素具有生物活性。随后在母马使用的结 果也证明了本试验提取物具有较高的生物活性，本 试验的垂体提取方法可行。 综上所述，本试验用马脑垂体提取获得的促性 腺激素提取物，用小鼠做生物活性测定，结果表明本 试验提取的马垂体促性腺激素提取物具有生物活 性。 参考文献：
系）小鼠，体重９ ｇ～１３ ｇ，购自新疆医科大学实验动 物中心。 １．１．３试荆与仪器设备
９５０ １００
ｇ／Ｌ乙酸铵、乙酸、
ｍＬ／Ｌ乙醇、乙醚和丙酮，均为国产分析纯试剂；
人绒毛膜促性腺激素，宁波激素厂生产。Ｊ一２５ ＡＶＡＮＰＩ低温离心机（ＢＥＣＫＭＡＮ
ＣＯＵＬＴＥＢ），
ＰＬ２０３电子分析天平（梅特勒一托利多仪器公司）， ＤＳ－１组织捣碎机（上海标本模型厂），ＦＥ２０ ｐＨ计 （梅特勒一托利多仪器公司），ＳＷ－ＣＪ－２ＦＤ超净工作台 （苏州安泰空气技术有限公司），ＬＤＺＸ一５０ＫＢ立式压 力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。
１
１。将３ ５２６个马脑垂体分４批进行提取，真空干燥 后，共得到脑垂体提取物１９．０３９ ｇ，按０．１ ｇ／瓶和
０．２
ｇ／瓶分装于灭菌小瓶中，储存于－－２０℃冰箱。
马脑垂体促性腺激素提取结果
ｅｑｕｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
ＧＴＨ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｂ批ａｔ次ｃｈ
Ｐｉｔｕ垂ｉｔａ删ｒｙ
２９０】一２９０１．
万方数据
动物医学进展．２０１０，３１（８）：２０－２３ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
微载体培养ＰＫ一１５细胞试验条件的优化
何锡忠１，李春华１，倪建平２，蒋风英１，邹 勇¨
（１．上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海２０１１０６；２．上海佳牧生物制 品有限公司，上海２０１１０６）
Ａｖｅｒａｇｅ
３
５２６ ０．５５７ ５．４２１
２．２提取物生物活性测定结果 各组小鼠子宫平均湿重为ｈＣＧ组０．０８０ 取物组０．０９９ 组高近１倍。 各组小鼠卵巢平均湿重见表２。ｈＣＧ组
０．０２２ １９ ３ ９
重量明显比对照组高。 ｇ，提 ｇ，对 各组小鼠卵巢解剖学变化情况，ｈＣＧ组和溶剂 对照组小鼠的卵巢均呈现白色，没有明显变化；单纯 提取物组小鼠卵巢均发红色（有卵泡发育）；提取物 ＋ｈＣＧ组小鼠的卵巢颜色都出现红色的变化，同时 有２只鼠的卵巢上有红色排卵点。卵巢重与子宫重 与溶剂对照组比较略有增加。
［３］王建辰，章孝荣．动物生殖调控［Ｍ］．安徽合肥：安徽科学技术 出版社，１９９８：１９０－１９５． ［４］陈来同，唐运．４１种生物化学产品生产技术［Ｍ］．北京。金盾 出版社，１９９４：５８—６３． ［５］李津。俞泳霆，董德祥．生物制药设备和分离纯化技术［Ｍ］． 北京ｔ化学工业出版社，２００３：１６６—１７０． ［６］杨廷富．人绒毛膜促性腺激素的临床意义及检测进展ｒＪ］．检验 医学与临床，２００７，４（１０）：９７６—９７６． Ｆ７］潘琼，宋小白，秦 津．等．哺乳动物促性腺激素细胞研究进 展［Ｊ］．动物医学进展，２００８．２９（７），６３—６６． ［８］高志花，周虚，刘立文，等．促性腺激素（ＦＳＨ、Ｌ Ｈ）对牛腔前卵 泡体外发育及Ｅ２分泌的影响［Ｊ］．中国兽医学报，２００８，２８（９）ｔ
３．３
ＦＳＨ和ＬＨ协同作用的关系 ＦＳＨ能促进卵泡的早期发育，卵泡成熟则是ＦＳ
Ｈ和ＬＨ协同作用的结果。ＦＳＨ促进颗粒细胞的 增殖，卵泡生长和成熟，成熟卵泡在ＦＳＨ和ＬＨ协 同作用下发生排卵ｒ引。有研究表明，高纯度的ＦＳＨ 制剂能引起动物卵泡生长，但不引起排卵。当血液 中ＦＳＨ和ＬＨ达到一定浓度且成一定比例时，才引 起排卵。垂体中ＦＳＨ和ＬＨ的含量和比例，因畜种 不同而异，并与发情活动有密切关系【８］。因此，本试 验提取物为ＦＳＨ和ＬＨ的混合物，且比例是马垂体 的自然比例，促马卵泡发育最为合适，不需要进行分 离即可使用。
ｈｏｒ－
公畜的精液品质［１］。然而，马脑垂体激素提取与应 用在国内未见报道，而且马对猪源ＦＳＨ不敏感。马 胚胎移植的超数排卵技术的推广应用，需要用促性 腺激素处理供体马。为了开展马胚胎移植科研工 作，本试验采集马脑垂体，用生物化学方法提取促性 腺激素，并用小鼠测定其生物活性。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１
［１３郑亦辉．动物激素及其应用［Ｍ］．江苏南京。江苏科学技术出版 社，１９９６：２０２—２０４． ［２］王建辰．家畜生殖内分泌学［Ｍ］．北京：农业出版社，１９９３：５８－
６１．
激素沉淀［５］。加入乙醇受温度的影响，用一１０℃～ 一１５℃乙醇边加边搅拌，用酒精比重计测量乙醇浓 度，可见到白色沉淀，静置２４ ｈ～４８ ｈ，分离出沉淀 物，上清液含乙醇，可回收利用［６］。
摘
要：家畜胚胎移植技术在畜牧业生产中应用日益广泛，由于马促性腺激素在国内外无商品出售，使
马的胚胎移植超数排卵研究和应用受到限制。本试验用马脑垂体提取促性腺激素，将从屠宰场采集的新鲜 马脑垂体冷冻保存，经固定、去膜、浸泡、捣碎、匀浆、振摇提取、离心、沉淀、洗涤、脱水、干燥等步骤，得到促性 腺激素提取物干粉，用小鼠做生物活性测定。结果表明，建立的马脑垂体促性腺激素提取方法可行，提取物 具有生物活性。 关键词：垂体；提取物；促性腺激素；马