细胞划痕

三、实验步骤 1．制备单层细胞：细胞密度5~10×10 /mLHep G2细胞铺于24孔 板（每孔500 uL）上，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液培养 16~24 h,使形成单层细胞 2．划痕 ：以五氟尿嘧啶（5－Fu）为例，首先配制1 μg/μL母液 (使用无菌蒸馏水配制，精密量取），取45 μL该母液用PBS稀释至 1.1 mL，得浓度40 μg/mL5－Fu溶液 ，用10 uL移液枪枪头（或者 无菌牙签）在单层细胞上呈一字划痕，用PBS清洗3次，然后加入 上面配好5－Fu溶液，平行两个样本，孵育24 h，换成含10％胎牛 血清的DMEM培养液孵育24 h 3．观察并拍照：吸去培养液，用PBS清洗3次，倒置荧光显微镜下 观察并拍照
特点： 1. 在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2. 价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外 围环境简单单纯，容易控制。 3. 与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分 析细胞间的相互作用。 4. 研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。
举例：抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）
一、实验原理：细胞划痕法是测定肿瘤细胞运动
特性方法之一，其借鉴体外细胞致伤愈合实验模 型，在体外培养的单层细胞上划痕致伤，加入药 物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力
二、实验材料：1） 细胞系及其培养：肝肿瘤细 胞HepG2 2） 24孔板 移液器 倒置显微镜 3） 主要试剂：PBS DMEM培养液 0.25% 胰酶胎牛血清 5-氟尿嘧啶溶液（1ug/ml）
三、实验结果 统计方法：使用Image J软件打开图片后，随机划取6至 8条水平线，计算细胞间距离的均值，测量划痕区域的像素 定量比较细胞迁移的速度。 其他结果分析工具：Wound Healing Image Analysis – WimScratch
http://dxy.me/UfYzii Image Pro Plus
5
四、注意事项： 1． 实验时应注意细胞生长状况，选择适当细胞 接种浓度，对不同细胞要观察细胞贴 壁率等，确 定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养 终止时密度适当。 2． 用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入， 免冲散单层贴壁细胞影响实验拍照结果。 3． 药物筛选过程，其对细胞迁移能力影响也是重 要的一方面，实验设计过程需 要选择适当阳性对 照组和阴性对照组。
culture Insert 方法（保证划痕的均一度） 1. 准备细胞，培养液。
2. 如图，将细胞接种于Dish中间的Insert，细胞长满Insert 区域后用镊子 移除Insert即可产生500 μm宽度的划痕。 3. 每隔4-6小时拍照记录。 4. 根据收集图片数据分析实验结果。 细 胞 定 位 格 子 培 养 皿
二、实验步骤 准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker 笔在操作前紫外照射30min（超净台内） 1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀 得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每 孔至少穿过5条线。 5 2.在孔中加入约5×10 个细胞，具体数量因细胞不 同而不同，掌握为过夜能铺满。 3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线 划痕，枪头要垂直，不能倾斜，不同孔之间最好使 用同一枪头。 4.用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加入无血清 或低血清培养基。 5.放入37度5% CO2培养箱，培养。按0，6，12， 24小时取样，拍照。
划痕结果图
0h
6h
小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3
12h
24h
• 四、注意事项： • 1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入， 以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。 • 2.一般做划痕实验，都是无血清或者低血清 （<2%）否则细胞增殖就不能忽略。（也可用丝 裂霉素处理一小时） • 3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形 成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前 后观察时位置不固定的问题。
细胞划痕实验
Biblioteka Baidu
一、基本原理 细胞划痕（Wound Healing ）法是简捷测定细胞迁移运 动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体 外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头 或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部 分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例 如24h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否迁移 （修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能 力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是 加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通 过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同， 可以判断各组细胞的迁移与修复能力