第五章分子生物学研究法--DNARNA及蛋白质操作技术
分子生物学研究法上DNARNA及蛋白质操作技术分子生物精选全文
可编辑修改精选全文完整版第五章分子生物学研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。
本章将在回顾重组DNA技术发展史的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆、表达分析技术及蛋白质组学、单核苷酸多态性分析等现代生物学领域里最广泛应用的实验技术和方法。
5. 1 重组DNA技术史话近半个多世纪来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。
事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。
因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件（表5-1）。
分子生物学第五章分子生物学研究法(上)
分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
分子生物学5 分子生物学研究方法(上)——DNA RNA 蛋白质操作技术综述
第五章分子生物学研究方法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术重点：1. DNA操作技术2. 基因克隆的主要载体系统难点：1. DNA操作技术2. 基因克隆的主要载体系统课时分配：8学时第一节重组DNA技术史上话一、二十世纪分子生物学的三大成就（1）20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；（2）50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了自我复制和世代交替问题；（3）50年代至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
二、基因工程1、基因操作gene manipulation主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。
2、基因工程genetic engineering将外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。
是核酸操作技术的一部分。
3 工具基因的剪刀——限制性内切酶基因的针线——DNA连接酶基因的运输工具——载体4 基本步骤提取目的基因目的基因与载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达三、DNA 重组技术recombinant DNA technique其核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。
四、重组DNA技术史上的主要事件1973 Cohen第一例成功的克隆实验1978 Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼1993 基因工程西红柿在美国上市1997 英国爱丁堡罗斯林研究所多莉羊1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11 公布人类基因组基本信息五、生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程第二节DNA操作技术一、DNA的分离，提取1. 材料的选择：物种、组织的选择2. 组织匀浆：细胞分散、破碎(EDTA:乙二胺四乙酸；Tris-Hcl:三羟甲基氨基甲烷)3. 破碎细胞：SDS表面活性剂4. 除蛋白：蛋白酶K、酚、氯仿抽提5. 除RNA：RNA酶6. DNA回收：乙醇、异丙醇沉淀7. 质量鉴定：（1）琼脂糖凝胶电泳，常用溴化乙锭（EB）染色，紫外灯下观察和照相。
医学免疫学实验：DNA、RNA及蛋白质操作技术
液氮研磨，匀浆，加Trizol试剂，进一步破碎 细胞并溶解细胞成分
氯仿抽提，离心，分离水相和有机相
收集水相
异丙醇沉淀，得到比较纯的RNA
RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD 260 和OD280 来判断
• OD 为1时， 相当于浓度为40μg/mL 260
• OD 260 /OD280 如果在1.8-2.0，表示所提制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 3. 双链cDNA 的合成
1）单链cDNA 的合成：反转录法 2）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解
（RNaseH）法除去RNA分子
4. ds- cDNA与载体DNA 相连
1）人工接头：要求具平端ds- cDNA，酶切时 可能导致某些cDNA链断裂
3. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达 亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分子的数 目是大不相同的，尽管它们获得表达（一般选用的载体都是表达 型的）
• 细菌转化常用方法： CaCl2 法和电击法
Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法
➢ 培养生命活动旺盛的菌体 菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长后期
➢ 沉淀菌体 冰水浴中预冷10分钟，4℃离心
➢ 化合物处理 含CaCl2 无菌预冷缓冲液处理
➢ DNA分子转化感受态细胞
电穿孔转化法
基本原理：
利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进 行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的 有效吸收。
• 再用低盐溶液会蒸馏水洗脱mRNA。 • 经过两次寡聚（dT）-纤维素柱后可得到较高纯度
的mRNA.
cDNA的合成
• 主要包括第一链和第二链cDNA的合成。 • 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录成
DNARNA及蛋白质操作技术
DNARNA及蛋白质操作技术DNA操作技术DNA操作技术广泛应用于生物学研究、医学诊断、犯罪侦查等领域。
下面将介绍几种常见的DNA操作技术。
1.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种重要的DNA操作技术，可以迅速扩增目标DNA序列。
PCR的主要步骤包括：变性、退火和延伸。
首先，将DNA样本加热至95℃，使DNA双链解离为单链；然后，降温至退火温度，引物与目标DNA序列特异性结合；最后，在延伸温度下，DNA聚合酶沿DNA模板合成新的DNA链。
通过不断重复这个循环，可以将目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。
2.DNA测序DNA测序是确定DNA序列的技术。
最早的DNA测序方法是Sanger测序，它利用带有不同标记的ddNTP和dNTP，在DNA合成过程中随机终止，得到不同长度的DNA片段。
这些片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据标记的位置确定序列。
近年来，新一代测序技术的出现大大提高了测序速度和准确性，比如Illumina测序技术。
3.DNA克隆DNA克隆是将目标DNA序列插入载体DNA中的过程。
典型的DNA克隆技术包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
首先，用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，产生能相互配对的粘性末端；然后，用连接酶将两者连接起来；最后，将连接物转化到宿主细胞中，宿主细胞通过复制连接物，使其扩增。
DNA克隆广泛应用于基因工程、蛋白表达和基因治疗等领域。
RNA操作技术RNA是生物体内转录出的中间产物，包括mRNA、rRNA、tRNA等不同类型。
下面将介绍几种常见的RNA操作技术。
1.RNA提取RNA提取是从生物体中分离纯化RNA的过程。
常用的RNA提取方法包括酚-氯仿法、离心柱法和磁珠法等。
其中，酚-氯仿法是最常用的方法，通过酚等有机溶剂和氯仿共同沉淀DNA和蛋白质，使RNA在上清液中得到富集。
2.RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）RT-PCR是将RNA转录为cDNA，并利用PCR扩增cDNA的技术。
分子生物学考点整理1
分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。
四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。
根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。
这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。
二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。
2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。
3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。
5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。
重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。
5第五章现代分子生物学研究方法——DNA、RNA及蛋白质操作技术
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳 以琼脂糖凝胶电泳为例：
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小， 其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其其分辨能力 就越弱。
DNA的基本操作技术——核酸凝胶电泳
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）能插入到DNA或RNA分子的相 邻碱基之间，并在紫外灯光照射下发出荧光，所以常用EB来检测凝 胶介质中的核酸条带。
x 25 中的聚合酶可能很多正处于复制状态，
如果此时降到室温，将会影响最终产 率。所以再留出5分钟，以使正在复制 中的DNA能够复制完全，以合成更多 的目的分子。
DNA的基本操作技术——重组载体构建 PCR完成之后，需要有什么操作？
DNA的基本操作技术——重组载体构建
DNA的基本操作技术——重组载体构建
转化（transformation）：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合 进入受体细胞（一般指细菌），并在受体细胞内稳定维持与表达的 过程。
转染（transfection）：是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。（与转化类似，只是受体细胞不同）
转导（transduction）：是指通过病毒（如λ噬菌体）颗粒感染宿主细 胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
DNA的基本操作技术——聚合酶链式反应技术
常用的PCR反应体系：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板、缓冲液。
常用的PCR反应程序：
预变性 95℃ 3 min
变性 95℃ 30 s
退火 55℃ 30 s
x 25
延伸 72℃ 1 min
(NEW)朱玉贤《现代分子生物学》(第5版)笔记和课后习题(含考研真题)详解
4.3 名校考研真题详解 第5章 分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术
5.1 复习笔记 5.2 课后习题详解 5.3 名校考研真题详解 第6章 分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术 6.1 复习笔记 6.2 课后习题详解 6.3 名校考研真题详解 第7章 原核基因表达调控 7.1 复习笔记 7.2 课后习题详解 7.3 名校考研真题详解 第8章 真核基因表达调控 8.1 复习笔记 8.2 课后习题详解 8.3 名校考研真题详解
② T2噬菌体感染大肠杆菌实验
a．在分别含有35S和32P的培养基中培养大肠杆菌。
b．用上述大肠杆菌培养T2噬菌体，分别制备含35S的T2噬菌体和32P的
T2噬菌体。
c．分别用含35S的T2噬菌体和32P的T2噬菌体感染未被放射性标记的大 肠杆菌。
d．培养一段时间后，将混合液离心，检测子代噬菌体放射性。上清液 主要是噬菌体，沉淀物主要是大肠杆菌。
（4）基因组、功能基因组与生物信息学研究
基因组计划是一项国际性的研究计划，其目标是确定生物物种基因组所 携带的全部遗传信息，并确定、阐明和记录组成生物物种基因组的全部 DNA序列。
功能基因组学相对于测定DNA核苷酸序列的结构基因组学，其研究内容 是在利用结构基因组学丰富信息资源的基础上，应用大量的实验分析方 法并结合统计学和计算机分析方法来研究基因的表达、调控与功能，以 及基因间、基因与蛋白质之间和蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之间的 相互作用和生物的生长发育等规律。功能基因组学的研究目标是对所有 基因如何行使其职能从而控制各种生命现象的问题作出回答。
严格地说，重组DNA技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他
可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。
分子生物学研究法DNARNA及蛋白质操作技术PPT教案
重组DNA技术史上的主要事件
第37页/共98页
PCR的基本 原理
P件CR反应95条50℃ PCR过程 PCR的特点
引物1
引物2
DNA 引物
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PCR的基本 P件CR反应57条02℃
原理
PCR过程 PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引 物
引物2 Taq酶
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PCR的基本 原理
P件CR反应79条25℃ PCR过程 PCR的特点
重组DNA实验中常见的主要工 具酶
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5. 2 DNA操作技术
核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯 酰胺（polyacrylamide）凝胶被 引入核酸研究以来，按分子量大 小分离DNA的凝胶电泳技术，已 经发展成为一种分析鉴定重组 DNA分子及研究蛋白质与核酸相 互作用的重要实验手段。
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双酶 切
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在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切 割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接 到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进 行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（ vector）。如：病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都 可以作为基因导入的载体。
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λ噬菌体作 为克隆载体 构建基因文 库流程图
最新2019-分子生物学(中文)5 分子生物学基本研究法-PPT课件
扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放
下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁 点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受 影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可 能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能 走在别人的前面。
基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞 转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定 点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技 术。
• 松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主 细 胞 中 ColE1 质 粒 的 拷 贝 数 达 到 1000~3000 个 ， 占细胞总DNA的50%左右。
3、pBR322质粒载体
由三个不同来源的部分组成的：
第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨 苄青霉素抗性基因（AmpR）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基 因（tetr）；
RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在 DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱 基数目按照4n 来计算，如一个6碱基切割酶平 均每4096 bp核DNA有一个酶切位点（46）， 而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就 有一个酶切位点（44）。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶
类
功
能
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的 双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同 样的速度向正电极方向迁移。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间。
聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之 间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高， 孔隙越小，其分辨能力就越强。
(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因， 作为转化子克隆的选择标记；
分子生物学第五章---DNA分子基本操作技术课件
阴极
DNA加样孔
阳极
大分子量的DNA 移动的慢
小分子量的DNA
移动的快
电泳缓冲液
在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子 化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子
（polyanions），把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正
电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数 量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度 向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移 速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这 就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。
溴化乙锭染 料的化学结构及 其 对 DNA 分 子 的插入作用。由 于插入了溴化乙 锭分子，在紫外 光照射下，琼脂 糖凝胶电泳中 DNA 的 条 带 便 呈现出橘黄色荧 光，易于鉴定。
25
在凝胶电泳中，加入适 量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染 料对核酸分子进行染色 ，然后将电泳标本放置 在紫外光下观察，可十 分灵敏而快捷地检测出 凝胶介质中DNA的谱带 部位，即使每条DNA带
31
Agarose gel electrophoresis
32
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的 DNA片段和DNA序列分析
• 其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长 度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸 分子即能分离
33
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间
3
• 膜融合的发现表明蛋白质和其他物质可以在细胞 内和细胞间进行传递，细胞可以用这一过程来阻 止它们的活动并且避免混乱。这一突破性发现解 释了为什么胰岛素释入血液时会有变化、神经细 胞之间的信息传达，以及病毒感染细胞的方式。
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![[课件]第五章.分子生物学的研究方法-DNA-蛋白质相互作用PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/e449bd400b1c59eef8c7b48d.png)
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
甲基化干扰试验的具体操作
先用硫酸二甲脂（DMS）处理靶DNA，控制反应条件，使平均每条DNA分
第五章 分子生物学研究的主要方法
凝胶阻滞试验用途
鉴定特殊细胞提取物中，是否存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白 质分子（比如特异的转录因子等）
研究发生此种结合作用之精确的 DNA 序列的特异性：其办法是在 DNA 一 蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争DNA。如果竞争同一种蛋 白，由于竞争 DNA 与探针 DNA 相比是极大超量的，绝大部分蛋白质都会 被其竞争结合掉而使探针DNA处于自由状态，自显影图片上不出现阻滞的 条带，相反，如果不竞争同一蛋白，探针DNA仍与特定蛋白复合，呈现阻 滞的条带。
的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
DNasel足迹试验过程
首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制酶去掉其
中的一个末端，得到只一条链单末端标记的双链DNA分子
体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者A作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的 用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取
物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNasel消化之后便会产生出距
放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等一系列前后长度均 仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
分子生物学研究法
2021/6/1624• 构建基因组的基本程序：2021/6/16
25• 构建基因组的基本程序：2021/6/16
26• 构建基因组的基本程序：2021/6/16
27基因的建立2021/6/16为模板，由 DNA聚合酶催化。
20
2021/6/16
图5-16 cDNA合 成中的分子修饰。
21
cDNA 的合成
2021/6/16种生物体基因组转 录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段 分别与克隆载体重组，储存于某种受体 达的 基因，缺乏内含子和调控序列，在研11
• 2. 硅胶膜纯化柱法
•
将含有目的RNA的细胞破碎液通过该
柱，RNA吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓
度下可从硅胶上直接洗脱RNA。
2021/6/16
12
• RNA的浓度和纯度的判断：
•
可通过测定其OD260和OD280
• OD260＝1时，相当于浓度为40μg/mL，当 OD260/OD280＝1.8～2.0时，说明RNA纯度 较好。
2021/6/16
7
RNA Extraction by TRIzol
2021/6/16
8
使用BioSpcetrometer分光光度计进行快速检测核酸
2021/6/16
9
mRNA Extraction from Cell Culture
2021/6/16
10
mRNA Extraction from Tissue
2021/6/16
13
5.32. mRNA的纯化
• 寡聚（dT）－纤维素柱色谱法： • 利用mRNA3’端含有PolyA+的特点，当RNA
流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作 用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用 低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次此 柱可得到较高纯度的mRNA.
分子学研究法——DNARNA及蛋
分子学研究法——DNA、RNA和蛋白质PPTxx年xx月xx日contents •引言•DNA和RNA的结构和功能•蛋白质的结构和功能•DNA、RNA和蛋白质的分析方法•分子学研究的应用•结论目录01引言1分子学研究的重要性23分子学研究对于理解生物体和疾病的机制至关重要分子学研究有助于疾病的预防、诊断和治疗分子学研究为新药发现和开发提供理论基础DNA是生物遗传信息的载体，负责编码生物体的所有特征RNA在细胞内扮演多种角色，包括转录、翻译和调节蛋白质是细胞内功能最丰富的分子，参与细胞构造、代谢和信号传导等DNA、RNA和蛋白质的生物角色分子学研究的历史和发展分子生物学起源于19世纪末，遗传学家孟德尔的实验研究分子生物学在20世纪末得到了迅速发展，推动了基因组学和蛋白质组学的研究20世纪中叶，DNA双螺旋结构被揭示目前，分子生物学已经渗透到生物学、医学和农学等多个领域，为人类健康和发展做出了巨大贡献02DNA和RNA的结构和功能DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，通过氢键相互作用形成双螺旋结构。
DNA双螺旋结构脱氧核糖核苷酸是DNA的基本单位，由一分子脱氧核糖、一分子磷酸和一分子含氮碱基组成。
DNA的基本单位DNA是生物体的遗传物质，负责储存和传递遗传信息。
DNA的功能DNA的结构和功能03RNA的功能RNA在蛋白质合成过程中起关键作用，负责将DNA中的遗传信息转录成mRNA，并将氨基酸转运到核糖体中。
RNA的结构和功能01RNA的分类RNA分为信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）。
02RNA的结构RNA分子由核糖、磷酸和含氮碱基组成，通过磷酸二酯键形成线性分子。
DNA和RNA的相互转化DNA和RNA在细胞内可以相互转化，DNA可以转录成mRNA，而mRNA可以翻译成蛋白质。
DNA和RNA在生物体内的相互作用DNA和RNA的遗传信息传递DNA中的遗传信息通过DNA复制传递给子代细胞，并通过mRNA的转录和翻译传递给蛋白质。
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polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，
按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已
经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及研
究蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。
琼脂糖是从琼脂中提纯到的。它由β-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合形成
的线性多聚糖。利用琼脂糖热溶液冷却
时能凝胶化的特点，采用不同浓度的琼
PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右
±äÐ Ô 90¡ «95¡ æ
70¡ «75¡ æ
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40¡ «60¡ æ
PCR指 数扩增时 循环次数 与DNA产 物数量的 比较。
PCR的基本原理
DNA 94 模板 温 DNA引物 dNTP 度 72 TaqDNA聚合 （℃） 酶 55
分离超大片段的DNA
5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分子的增殖
细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株
的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。
•提供转化DNA的菌株叫作供体菌株；
•接受转化DNA的细菌菌株称为受体菌株。
大多数细菌，正常条件下转化效率很低。
为了高效转化这些细菌，必需对受体细菌进行一些理
•琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为 0.2~50kb之间。 •聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱 基对之间。 •凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小， 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色
，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷
50℃ 95℃
引物1
PCR的基本原理
Taq酶
DNA引物
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
50℃ 72℃
引物1
引物2
Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
72℃ 95℃
第2轮开始
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 Taq PCR的特点
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的 方法。
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数。
荧光染料SYBR Green Ⅰ探针的实时定量PCR
题；
② 50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交 替问题； ③ 50年代末至60年代，提出了“中心法则”和操
纵子学说，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
重组DNA技术史上的主要事件
（GMO转基因生物）
2003 美国科学家完成狗基因组全序列测定 2004 中国科学家完成家蚕基因组全序列测定 2005 中、美、日科学家联合完成水稻基因组序 列测定
地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使
每条DNA带中仅含有0.05μg的微量 ，也可
以被清晰地检测出来。
EB（Ethidium bromide，溴化乙锭），分子式：
C21H20BrN3，熔点：260 - 262°C ，是一种高度灵敏
的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中
的DNA。
溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙 红色信号，可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶 成像处理系统拍摄。 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是
重组DNA操作过程：
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂
种分子后，将其重新导入到寄主细胞中，通过细
菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛
选，获得DNA重组表达。 并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式 从细胞中被分离纯化出来。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
5. 2 DNA操作技术 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（
第4轮扩增 第5轮扩增
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
PCR引物设计
① 一对引物，与3′端互补 ② 长度：15～30个核苷酸
③ 碱基分布随机
④ 引物内、引物间不应有互补序列
⑤ 引物与非特异扩增区无同源性
⑥ 3′端必须互补 ⑦ 5′端可游离
5.2.4 实时定量PCR （Real-time Quantitative PCR） 实时定量PCR是20世纪90年代中期发展起来的基于 PCR技术的利用不同的荧光检测来给核酸定量的技术 。具备了传统PCR的优点，又克服了传统PCR的许多 缺点。
培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂
布于选择性培养基中分离转化子。
电击法是细菌转化的另一种高效法： 由于转化载体上一般带有LacZ基因（大肠杆菌编码 β-半乳糖基酶），实验室常用带有不同抗生素的选 择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞 。 感受态细胞转化频率的计算方法为： •转化体总数=菌落数×（转化反应原液总体积/涂 板菌液体积） •插入频率=白色菌落数/(白色菌落数+蓝色菌落数 ） •转化频率（每μgDNA转化菌落数）=转化体总数 /加入质粒DNA总量(μg）。
强诱变剂,具有高致癌性!
EB可以被皮肤吸收。做实验时一定要带手套。
1 严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发， 挥发至空气中，危害很大。 2 废 EB溶液的处理方法 (1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入 等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； c. 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放 置1小时； b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 3 废EB接触物，如抹布，枪头。 一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。
λ噬菌体作 为克隆载 体构建基 因流 程图细菌转化及蓝白 斑筛选
蓝白斑筛选是重 组子筛选的一种 方法： 含空载体的菌 落为蓝斑； 含外源DNA的 菌落为白斑； 未转化的细菌 不能在抗性培养 基上生长。
5.2.3 聚合酶链反应技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR) 是1985年问世的一种体外扩增DNA片段的技术。 首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚 合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种 dNTP合成新生的DNA互补链。 因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“ 引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由 一小段寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点 所决定。
72℃ 50℃ 95℃
Taq
Taq
Taq
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
72℃
第2轮结束
第1轮扩增 模板DNA 第2轮扩增
PCR反应条件 PCR过程 第 3轮扩增 PCR的特点
重复30轮后 30 2 =1,073,741,824
第6轮扩增 理想拷贝数=2n
n 循环次数
2005 美、德、日、意、以科学家完成黑猩猩基
因组全序列测定
限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定 碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产 生具有粘性末端的小片段。
PCR反应的全过程，即三步，可以被不断重复：
•DNA解链（变性），
•引物与模板相结合（退火），
•DNA合成（链的延伸）。
经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链
DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段
的拷贝数，理论上的最高值应是2n。
PCR的主要步骤
将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（ >94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形 成单链模板DNA。 然后降低反应温度（约50℃），致冷1分钟，使寡 核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结 合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。 最后，将反应混合物的温度上升到72度左右保温1数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加 入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向 延伸，合成新生DNA互补链。
应用TaqMan探针实时定量PCR技术
利用荧光染料SYBR Green Ⅰ可以检测PCR反应中 获得的全部双链DNA，但不能区分不同的双链 DNA。为了进一步确保荧光检测确实是靶DNA序 列，人们又设计了只能与目的DNA序列特异结合 的荧光探针，如TaqMan探针。 这种探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中 间部位结合的单链DNA（50-150bp）。随着PCR 反应进行，这种探针结合到目的DNA序列上，并 且会被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除 而降解。被切下的荧光基团会在激发光下发出荧 光，荧光强度直接反映了扩增靶DNA的总量。
95℃
1
模板DNA 2 3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
55
条变 单性 链
22 DNA双螺旋 1 2 3
时间（min）
DNA 2 DNA单链 与引物复性
子链延伸 DNA加倍
4
5
PCR的基本原理
DNA引 物
引物2
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点