色谱基础

色谱法的原理 是利用样品中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等 化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相 中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。
相 特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均 匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。
固定相(Stationary Phase), 流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗脱剂,溶剂
亲和色谱法（AC） Affinity chromatograph
定义：利用蛋白质或生物大分子等样品与固定相上生 物活性配位体之间的特异亲和力进行分离的液相色谱方法。
固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不 溶性固体基质上制得。
生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、 辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多 糖）、抗生素（核苷酸）等。
扩散系数 (cm2/s) 0.1~0.4
10－4~10－3
(0.2~3) ×10－5
“超临界状态是一种亚稳态”
按色谱柱形状
i）柱形——柱色谱（column Chromatography） 填充柱（packed column chromatography） 毛细管柱（capillary chromatography）
GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力， 仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它 对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此， 流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数， 这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
ii） 非理想色谱 （non-ideal chromatography）
按进样方式
i） 间歇式（batch chromatography） ii） 连续式（continuous chromatography）
a） 模拟流动床色谱（SMBC） b） 圆筒色谱（CAC）
按流动相动力源
i） 离 心 色 谱 ii） 重 力 色 谱 iii）高 压 色 谱 iv）电 动 色 谱
分离基于样品组分在非极性固定相和流动相中的溶解度/相互作用不同
iii）离子交换色谱（IEC）
根据样品组份离子交换亲和力的差异分离
iv）亲和色谱（AC）
根据样品组份与固定相疏水相互作用的差异分离
v） 体积排阻色谱（SEC）
GPC：固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 GFC：固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液
柱效 流动相和固定相相互作用达到平衡的时间
分离是一个物理过程
流动相的物态
色谱学分类
i）流动相： a. 气相——气相色谱（G.C） b. 液相——液相色谱（L.C） c. 超临界流体——超临界流体色谱（S.F.C）
ii）固定相 a. 液相（有机高沸点液体，以物理或化学法结合在惰 性固体表面） b. 固相（吸附剂）
Tswett 的实验
1913 实验
一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒 将碾碎之植物叶片的石油醚提取 液灌入柱中 随着石油醚提取液向下流过柱子， 现出展宽的色带
1915 发表
Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即 现在的Chromatography(色谱法)
1938年，Izmailv等发表了薄层色谱法论文 1944年，Consden等发表了纸色谱法论文 1952年，James用气相色谱法分离了低沸点的脂肪 酸，奠定了气相色谱的基础，60年代基本成熟。 1959 商品化GC 出现，效率高 1970s HPLC出现 1980s 毛细管电泳 2004年，Waters提出了UPLC
色谱学基础
谱
[新华字典] 依照事物的类别、系统制的表册
-graphy
[edit] Suffix Represents something written or represented in the specified manner, or about a specified subject.
色谱学的发展与分类 HPLC与其它色谱法的比较
自动化程度 TLC < HPLC 高效 快速 HPLC > TLC 费 用 TLC < HPLC
HPLC与LC相比较
（1） 流动相输送 HPLC——高压 LC——低压
（2） 固定相 HPLC——1.7~20um，球形 LC——40~200um，无定形
（3） 检测 HPLC——高灵敏度自动检测器 LC——收集馏分手工比色检测
HPLC与GC比较
GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量 大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析。
vi) 疏水作用色谱 （HIC） vii) 手性色谱 （CC）
吸附色谱 流动相极性小于固定相极性 固定相→吸附剂（硅胶或AL2O3），具表面活性吸附中心
Ka与组分的性质、吸附剂 的活性、流动相的性质及 温度有关
分配色谱
80%
流动相极性大于固定相极性
固定相→机械吸附在惰性载体上的液体或特定修饰物
流动相→必须与固定相不为互溶
超临界流体（ Supercritical Fluid，SCF）
是指在临界温度和临界压力以上的流体，高于临界温度和临 界压力而接近临界点状态，称为超临界状态。处于超临界状 态时，气液两相性质非常接近，以至于无法分辨。
P/Pa
Solid
Triple point
Liquid
Supercritical fluid
柱效 GC > HPLC 应用范围 HPLC > GC
费用 GC < HPLC 结论：凡是用GC与HPLC都可分析的样品原则上用GC。
（2） HPLC与SFC比较 柱效 SFC > HPLC
应用范围 SFC < HPLC （尤其是对极 性分子和生物大分子，如蛋白，核酸）
费用 SFC > HPLC
（3） HPLC与TLC比较
按操作参数
i） 温度 （恒温，程序升温）
ii） 流动相组成 （恒组成—等度 isocratic）
按热力学特性
i） 线性色谱 （linear chromatography）
ii） 非线性色谱 （nonlinear chromatography）
按动力学特性
i） 理想色谱 （ideal chromatography）
ii）平板——平板色谱（plane chromatography） 纸色谱（paper chromatography） 薄层色谱（thin layer chromatography）
按色谱机理
i） 吸附色谱（正相色谱，NPC）
根据样品组分对极性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离
ii） 分配色谱（反相色谱，RPC）
Gas
T/℃
Critical point
流体的一些物理性质比较
流体
密度(wk.baidu.com/mL)
动态粘度 (g/(cms))
气体(101.3kPa, 21℃)
超临界流体(Tc, Pc~4Pc)
有机溶剂（室温）
(0.6~2) ×10－3 0.3~0.8
0.6~1.6
(1~3) ×10－4
(1~3) ×10－4
(0.2~3) ×10-2
载体→惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应
K与组分的性质、流动 相的性质、固定相的性 质以及柱温有关
离子交换色谱（IEC） 固定相→离子交换树脂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液 被分离组分→离子型的有机物或无机物
阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子 待测离子
基质：通常为凝胶，许多无机和有机聚合物都可形成 凝胶，如琼脂糖衍生物、多孔玻璃。
亲和色谱法（AC） Affinity chromatograph
体积排阻色谱（SEC）
固定相→多孔性凝胶 流动相→水（GFC） 流动相→有机溶剂（GPC）
利用被测组分分子大小不同、在固 定相上选择性 渗透实现分离。 Kp 仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径 大小，与流动相的性质无关
选择性系数
KS
[RSO3 X ]S [H ]m [RSO3 H ]S [ X ]m
[RSO3 X ]S [ X ] [RSO3 H ]S [H ]m
依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离。
Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、 离子交换树脂
性质以及温度有关