免疫组化染色操作步骤

免疫组织化学染色原理和操作步骤

一、免疫组织化学原理

免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶(PＡP)法、亲和素—生物素—过氧化物酶(ＡBC)法和链霉亲和素—过氧化物酶(ＳP）法。

PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAＰ复合物（含３个酶分子和2个抗体分子),染色时依次加入一抗、二抗、ＰＡ

Ｐ复合物孵育标本,最后用H

２Ｏ

２

和二氨基联苯（DAB)为底物显示过氧

化物酶，即可检测标本中的抗原成分。

生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合４分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAＢ进行显色。AＢＣ法的敏感性较ＰAＰ法更高。

图１. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）

SP法与ABC法相似，其不同于ＡBＣ法之处在于用生

物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在

标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化

物酶使其结合到二抗的生物素上,最后加入ＤAＢ进行显

色。与亲和素相比,链酶亲和素的结合力与亲和素相似而

非特异性结合较亲和素低。SＰ法简化了操作步骤，同时

也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥

化染色技术。

图2. SP法原理示意图二、实验准备：

1．标本准备

①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理

②冰冻组织切片:由病理室常规处理

③细胞爬片:将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞，待细胞生长达到6

０％以上后取出玻片,4%多聚甲醛固定2 h。

2.试剂准备

①抗体选择

单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后

将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体

的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此,不论选择单克隆还是多克隆抗体,最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHＣ的抗体，抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多,可选择文献上常用的经典抗体。

②二抗试剂盒

目前本实验室所用二抗试剂盒为LｉfｅＴｅｃhnolｏgiｅs Ｈistostaｉn－Pｌus Ｋit （HＲP, Brｏａd Sｐectrum),货号85-9043，一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。

③ＤAB试剂盒

目前本实验室所用为加强型DAB显色试剂盒,货号DAB－2032。

④其他试剂

二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、AＰES胶3.抗体特异性验证

所有免疫组化抗体均须Wｅsteｒｎbｌot验证抗体特异性,并需免疫荧光实验验证抗原定位。

4．耗材准备

免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片

5. 溶液配制

①磷酸盐缓冲液（PＢＳ)

1０×ＰBS母液配制

NaCl ﻩﻩ72 g

Na

2ＨPO

４

·12H

2

O ﻩ37.3 g

KH

2PＯ

4

ﻩﻩ４.3g

加蒸馏水至1０00 ｍl,充分混匀贮存。

使用时用蒸馏水10倍稀释，调整ｐH值至7.３—7.4。

②柠檬酸抗原修复液

抗原修复使用柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，配方如下:

称取柠檬酸1０.5 ｇ,溶于５00 ml蒸馏水;称取Na

2ＨPO

4

·12H

２

O

57．3g,溶于800 ml蒸馏水。分别量取358 mｌ柠檬酸溶液和642 m

ｌＮa

2HＰO

４

溶液,充分混匀后调整pH值至6.0,即得2×母液,贮存备

用。

③1%盐酸酒精

浓盐酸与75%酒精按照1:９9比例混合，充分混匀。

三、免疫组化操作步骤

1. 组织片脱蜡水化

①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 ｍiｎ。

②依次放入２个装有无水乙醇的玻璃缸,每缸５ miｎ。

③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸,每缸5 mｉn。

④依次放入90%乙醇、85％乙醇、75％乙醇的玻璃缸,每缸2 miｎ,取出。

⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗,重复３次。

2．抗原修复

将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后停止加热让切片自然冷却。

注意：抗原修复过度或不足,均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片,必须自然冷却！

3.封闭内源性过氧化氢酶

①放入3% Ｈ

2O

２

溶液的玻璃缸中，浸泡15 mｉｎ。

②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复３次。

③放入PＢS缓冲液的玻璃缸中,浸泡５ mｉn。

４．抗体杂交

①甩去PBS余液,将组织片平辅在湿盒中,加正常山羊血清１滴20 µl（试剂盒中的A液,根据组织大小调整用量),2８℃放置2０ｍiｎ，甩干。

②加稀释好的一抗1滴（20~50 µl,根据组织块大小进行调整)，置于湿盒4℃过夜。