酵母双杂交试验流程

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酵母双杂交四缺实验步骤

酵母双杂交四缺实验步骤一、酵母双杂交四缺实验的原理简单说说酵母双杂交四缺实验呢，就是一种很神奇的实验啦。

它主要是用来研究蛋白质之间相互作用的。

你想啊，在细胞这个小小的世界里，蛋白质们就像一个个小工人，它们之间的相互配合可重要了。

这个实验就像是给这些小工人安排了一个特殊的考场，看看哪些蛋白质之间会“拉手”合作呢。

二、实验前的准备工作1. 酵母菌株的选择我们得选对酵母菌株呀，就像挑选手下的得力助手一样。

这个菌株得是那种适合做双杂交实验的，要健康、活力满满。

可不能选那种病恹恹的菌株，不然实验肯定做不好。

一般呢，有一些特定的酵母菌株是大家常用的，我们可以参考之前师兄师姐们的经验，或者查查文献。

2. 培养基的准备培养基就像是酵母菌株的食物啦。

四缺培养基可不是那么容易做的哦。

我们要准备好各种成分，像氮源、碳源这些是必不可少的。

比如说葡萄糖啦，它就是酵母很爱的一种碳源。

然后还要加入各种氨基酸，不过因为是四缺嘛，有四种氨基酸是不能加的哦，这就是这个实验的特别之处。

而且在配制培养基的时候，要特别注意无菌操作，要是不小心混入了细菌或者其他杂菌，那就像在一群好人里混进了几个小坏蛋，会把整个实验搞砸的。

3. 构建质粒构建质粒也是很关键的一步呢。

质粒就像是一个小快递，里面装着我们想要研究的基因信息。

我们要把目的基因准确地装到质粒里面，这就需要一些特殊的工具和技术啦，像酶切啊、连接啊这些。

这就好比把我们要送的礼物精心包装好，准备送到酵母细胞这个“收件人”那里。

三、酵母转化1. 酵母细胞的处理首先要把酵母细胞处理得服服帖帖的，让它们处于一种容易接受质粒的状态。

这就像是要把一个小房子打扫干净，准备迎接新客人一样。

我们可以用一些化学试剂来处理酵母细胞，让它们的细胞膜变得更“友好”，这样质粒就能更容易地进入细胞啦。

2. 质粒导入然后就把我们之前构建好的质粒导入到处理好的酵母细胞里面。

这个过程就像是把快递送到收件人手里一样。

可以用一些物理或者化学的方法，比如说热激法。

酵母双杂交实验流程(精)

模块七蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。

主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。

2. 实验原理1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。

该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。

相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。

(2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

(3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。

(4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。

(5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。

同时,酵母表型、 X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。

酵母双杂交系统也具有一定的局限性。

首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。

酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性” 。

在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。

由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。

另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域, 能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。

酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。

很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。

这两个结构域各具功能，互不影响。

但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。

不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。

如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。

(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。

(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

而菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。

后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

酵母双杂交实验

酵母双杂交实验酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA提取方法（蜗牛酶法）1。

酵母质粒提取试剂bufferi0.9mol/lsorbitol0.1mol/ledtabufferii50mm/ltris20mm/ledtabufferiii10mm/l tris1mm/ledta2、操作步骤：（1）收集新鲜细菌，加入150μlbufferi、25μL蜗牛酶（30mg/ml）（2）37℃水浴1小时。

(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μlbufferii。

(4)加入25μl10%sds，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。

(5)加入25μl5mol/l醋酸钾，冰浴60min。

(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。

（7）向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，充分混合，并在-20℃下静置1小时以上。

（8）取出，在4℃12000rpm下离心15分钟，丢弃上清液。

(9)加入150μlbufferiii溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。

(10)12000rpm离心15min。

（11）将上清液转移到新的离心管中，并添加6μl（10u/μl）核糖核酸酶，在37℃下放置30分钟。

（12）取上清液并添加等量的异丙醇。

（13）在4℃下静置10分钟超过1小时或过夜。

（14）在4℃下以10000 rpm离心5分钟。

(15)弃上清，并把沉淀溶于10μlbufferiii中。

二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：除PEG过滤灭菌外，其他转化试剂需要在与普通培养基灭菌相同的条件下进行高温高压灭菌。

(1)m醋酸锂（lithiumacetate）（2）聚乙二醇（PEG）分子量3350，浓度50%（w/V）（3）PEG/liac溶液的制备（即用）800μl50%peg100μl10×te100μl10×liac1ml总体积（4）1.1×TE/liac溶液（用于使用和制备）11ml10×TE（5）11ml10×liac（6）78mlddh202。

酵母双杂交技术流程

酵母双杂交技术流程
酵母双杂交技术是一种用于鉴定蛋白质相互作用的实验方法，它可以识别某个蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用关系。

以下是酵母双杂交技术的流程：
1. 构建酵母菌株：将感兴趣的两个蛋白质编码序列分别克隆至酵母表达载体中，并插入适当的启动子和终止子后，将其转化至酵母细胞中，并筛选出正确的菌株。

2. 转化酵母菌株：将构建好的酵母菌株分别转化至两个含有互补杂交部位的酵母菌株中，使其产生可杂交的菌株。

3. 筛选正面杂交菌株：通过选择菌株在适当培养基中的生长情况或染色体特征，筛选出正面杂交的菌株。

4. 验证杂交结果：通过进一步实验验证杂交结果的准确性，例如，利用质粒转染或重组DNA重组实验等方法。

5. 鉴定蛋白质相互作用：最终确定两个蛋白质之间的相互作用关系，并进一步研究其生物学意义。

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酵母双杂交具体实验流程

酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。

酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。

这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。

2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。

3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。

4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。

例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。

总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。

酵母双杂杂交回复验证实验

酵母双杂杂交回复验证实验一、引言酵母双杂杂交回复验证实验是一项常用于研究酵母菌遗传性状的实验方法。

通过将两个不同株系的酵母菌互相杂交，观察其后代的表型，可以确定不同基因型对于特定性状的影响，以及基因之间的相互作用关系。

这项实验提供了一种有效的手段来研究酵母菌的遗传特性，并为从酵母菌到其他生物的研究提供了重要参考。

二、实验设计1. 实验目的确认酵母菌的遗传性状以及基因型之间的相互作用关系。

2. 实验步骤1.选取两个不同基因型的酵母菌株进行杂交。

2.将两个酵母菌株分别培养在适宜的培养基上，以获得足够数量的酵母菌细胞。

3.将两个酵母菌株的细胞混合在一起，使其进行杂交。

4.将混合后的酵母菌细胞培养在选择性培养基上，以筛选出杂交后的酵母菌子代。

5.观察酵母菌子代的表型特征，并将其形态记录下来。

3. 实验材料•两个不同基因型的酵母菌株•培养基及培养仪器•选择性培养基4. 实验结果通过观察酵母菌子代的表型特征，可以得到各个基因型对于特定性状的影响情况。

如果两个酵母菌株的基因型在某一性状上有不同表现，那么杂交后的子代在该性状上可能表现出两种不同的表型。

这种表型的分离现象可以帮助确定酵母菌的遗传性状。

5. 实验分析通过对大量的酵母菌子代进行观察和统计，可以得到不同基因型对于特定性状的影响程度，以及基因之间的相互作用关系。

这些数据可以用来构建酵母菌的遗传模型，推测特定基因在遗传性状中的作用机制。

三、实验应用酵母双杂杂交回复验证实验在酵母研究领域具有广泛的应用价值。

以下是一些应用示例：1. 基因功能研究通过观察不同基因型的酵母菌子代的表型，可以推测特定基因在酵母菌生命周期、代谢途径等方面的作用。

这对于全面理解基因功能具有重要意义。

2. 病原机制研究酵母双杂杂交回复验证实验可以帮助研究人员解析酵母菌导致疾病的机制。

通过分析酵母菌的基因型与特定疾病的发生关系，可以发现关键基因及其表达调控途径，为疾病治疗和预防提供新思路。

酵母双杂交试验流程

4月4日划线配培养基TE/LIAC PEG/LIAC配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30° 生长3天。

需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。

4月6号星期三（1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。

需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。

4月7号星期四（2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。

下午4点开始8号8点结束Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。

4月8号星期五（3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。

（5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。

8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。

（6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。

（8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。

（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。

（10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。

需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。

酵母双杂交系统步骤

酵母双杂交系统的步骤酵母双杂交法的原理：典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域和转录激活结构域。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

酵母双杂交法的步骤：1. 阳性克隆的筛选2. 用质粒自然分选法筛除只含有AD-文库杂合子的克隆3. 酵母杂合试验确定真阳性克隆4. 阳性克隆的进一步筛选和确证5. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究6. 阳性克隆的筛选7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆9. 阳性克隆的进一步筛选和确证扩展资料：酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。

2、信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。

3、杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。

4、通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。

同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中，有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。

针对实际工作中的这种需要，Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。

这项技术的关键是报道基因URA3的引入。

URA3基因在这里起到了反选择的作用，它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。

酵母双杂交实验步骤

LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。

分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株： KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

酵母双杂交步骤

酵母双杂交系统1．原理酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。

研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。

例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。

GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。

但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

2．试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。

2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。

2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。

2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。

利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。

3．特点优点蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。

酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。

缺点尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。

1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。

双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。

因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。

酵母双杂实验步骤

2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。

其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。

通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。

获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。

进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。

酵母双杂相关步骤

YPD:Difco peptone 20 g/LYeast extract 10 g/L葡萄糖20 g/LYPD固体:Difco peptone 20 g/LYeast extract 10 g/L葡萄糖20 g/LDifco Agar (for plates only) 20 g/L调pH至6.5，灭菌条件为高压1210C灭15 min(以下所涉及的需要加入碳源的培养基类型均与此相同)。

YPDA：YPD冷却至550C，添加5mL/L 0.6% Ade。

每升加YMB酵母无氨基氮源 6.7g（威佳），-l eu氨基酸（takara），无水葡萄糖20g，琼脂20g，pH5.8SMART III Oligo ( 5'-AAGCAGTGGTA TCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3') CDS III Primer (5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3')*5' PCR Primer (5'-TTCCACCCAAGCAGTGGTA TCAACGCAGAGTGG-3')3' PCR Primer (5'-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3')AD 5' CTATTCGA TGATGAAGA TACCCCACCAAACCCAD 3' GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGA T一、利用CDSⅢ引物合成单链cDNA1.灭菌离心管加1－2ul RNA( 0.025-1.0ug的m RNA)1.0 ul CDSⅢ引物加入灭菌去离子超纯水至总体积为4.0ul.2.混匀3.72℃水浴2分钟4.冰水中冷却2分钟5.轻微离心6.加入一下试剂2.0 ul 5× First-Strand Buffer1.0 ul DTT( 20m M)1.0ul d NTP (10m M)1.0ul MMLV反转录酶7. 混匀8. 42℃水浴10分钟9．加入 1.0ul的 BD SMART Ⅲ寡核苷酸10．42℃水浴1小时（加石腊油）11. 扩增仪上75℃放置10分钟，终止合成反应12.冷却至室温，加入2.0ul(2.0单位)的RNase H.13 37℃温浴20分钟。

酵母双杂交实验

酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法）1、酵母质粒提取试剂Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol0.1mol/L EDTABuffer II 50mM/L Tris20mM/L EDTABuffer III 10mM/L Tris1Mm/L EDTA2、操作步骤：(1)收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。

.(2)37℃水浴1h。

(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。

(4)加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。

(5)加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。

(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7)在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。

(8)取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9)加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。

(10)12000rpm离心15min。

(11)将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶37℃放置30min。

(12)取上清，加入等体积的异丙醇。

(13)4℃静置10min，1小时以上或过夜。

(14)4℃10000rpm 离心5min。

(15)弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。

二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。

(1)M 醋酸锂（Lithium Acetate）(2)聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度50%（w/v）(3)PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配）800μl 50%PEG100μl 10×TE100μl 10×LiAc1ml 总体积(4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配）11ml 10×TE(5)11ml 10×LiAc(6)78ml ddH202、操作步骤：(1)第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。

酵母双杂交步骤

1.酵母质粒提取参考天根公司酵母小题试剂盒说明书步骤:1)柱平衡步骤:向吸附柱CPZ中(吸附柱放入收集管中)加入500ul的平衡液BL，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中（使用当天处理的柱子）。

2)取1-5ml酵母培养物，12000rpm离心lmin，尽量吸除上清。

3)破除酵母细胞壁:向菌液中加入300ul山梨醇buffer，加入大约50U Lyticase，充分混匀，并在摇床上220 rpm，30℃处理lh。

4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。

加入250ul 溶液YP1(已加RNaseA)，重悬沉淀。

4)向管中加入250ul YP2溶液，温和地上下翻转6-8次，使菌体充分混匀，室温静置5-10min。

5)向管中加入350ul YP3 溶液，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，出现白色絮状沉淀。

12000rpm离心20min。

6)小心地将上清液加入吸附柱CP2中，12000rpm离心1min，弃废液。

7)向吸附柱CP2中加入500ul缓冲液PD，12000rpm离心1min，弃废液。

8)向吸附柱CP2中加入600ul漂洗液PW(己加无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液。

9)重复步骤8。

10)将吸附柱CP2放入收集管中，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。

11)将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2min，收集质粒，-20℃保存。

提取的酵母质粒浓度低很难凝胶电泳监测，可将其转入感受态DH5a，若转化成功即可认为质粒抽提合格，送交测序。

2. 酵母质粒DNA的提取1. 挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于5.0-10.0ml SD/-Trp液体培养基，30℃恒温，250rpm振荡培养20hr。

2. 室温离心5000xg×1min，弃上清，收菌。

酵母双杂交操作步骤

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

酵母双杂交试验步骤

LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3,可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD（202个氨基酸残基组成的LexA蛋白）与目标蛋白（钓饵，Bait）的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexAX8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点（EcoRI与XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白）等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA,但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成1 .载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2 .酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3 .大肠杆菌菌株：E.coliKC8株4 .对照质粒：质粒用途pLexA-53,pB42AD-T阳性对照pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam（LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用）假阳性检测质粒5 .引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

酵母双杂交原理和具体流程

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酵母双杂交是一种利用酵母遗传学方法来研究蛋白质相互作用的技术。