酵母双杂交试验流程

4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC

配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。

需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨

注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。

4月6号星期三

（1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。

需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。

4月7号星期四

（2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。

下午4点开始 8号 8点结束

Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。

4月8号星期五

（3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。

（5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。

（6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。

（8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。

（10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。

需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。

1.1x TE/LIAC 10ML

10xTE 1.1ml

10xliac 1.1ml

Dh2O 8.8ml

酵母转化

进行以下操作之前，配置适量的PEG/LIAC溶液，设置水浴锅。

（11）取适量的CarrierDNA，沸水浴变性5-10min，后立即置于冰水混合物中。

（每转一个质粒需准备5ul CarrierDNA，每10个样多准备5ul）

（12）取数支灭菌的1.5ml EP管编号，置于冰水混合物上冷却。

（13）每个EP管中加入5ul变性后的CarrierDNA，再加入5ul待转化的质粒DNA，用枪头混匀。（14）向每个EP管中再加入50ul感受态细胞，轻敲管壁混匀（不要用枪头吹打）。

（15）向每个EP管中再加入500ul PEG/LIAC溶液，上下颠倒混匀（不要用枪头吹打）。

（16）30°水浴30min，每10min拿出来上下颠倒混匀（此过程中倒SD平板）。

（17）向每个EP管中再加入20ul DMSO，上下颠倒混匀（多颠倒几次，充分混匀）。

（18）42°水浴15min，每5min拿出来上下颠倒混匀。

（19）高速离心15s，用枪头吸出上清（由于液体粘稠，不能直接倒）

（20）加入1mlYPDA液体培养基，重悬菌体后，高速离心15s。

（21）弃掉上清，加入1ml灭菌的0.9%NaCl溶液重悬菌体。

（22）取100-200ul菌液涂板于相应的SD缺陷培养基上。

需要物品：BD质粒（需提前准备）、carrier DNA、PEG/LIAC、DMSO、灭菌1.5mlEP管、YPDA培养基、0.9%无菌NACL、水浴锅、灭菌10ul、200ul、1ml枪头。

PEG/LIAC YPDA

PEG3350 8ml 20g/l 蛋白胨

10X TE 1ml 10g/l 酵母提取物

10X LIAC 1ml 0.03g/l 腺嘌呤

20g/l 葡萄糖

报告基因的检测

1 涂板于缺陷形SD固体培养基30°培养直至长出酵母细胞。

2 长出酵母细胞后，挑菌至缺陷型SD液体培养基培养（3份）

3 摇菌至OD=0.6-1.0

4 高速离心去上清，用无菌水重悬。

5 稀释菌液形成4个梯度 1:1 1:10 1:100 1:1000

6 分别涂板于双缺，三缺，四缺的固体培养基、

7 观察平板上是否有菌落长出

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