基因文库的建立
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第四章
基因文库的建立
基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) cDNA文库(cDNA library)
第一节
基因组文库的构建
定义：
含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。
一. 基因组文库的规模
N= ln（1-P） ln（1-f）
N—基因组文库克隆总数 P—所需机率 f—插入片段与基因组DNA长度之比
S
cos Ori
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamHwenku.baidu.comI 小片段
Cos
H
Cos ori Apr S
35-45kb DNA 片段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S 库载
感染E.coli
体
六. 利用P1载体构建基因组文库
构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
二．建立基因组文库的一般程序
1．载体DNA片段的制备
DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应
2． 供体DNA片段的制备
总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段
酶法
部分酶切
分离特定大小DNA片段
完全酶切
3. 供体与载体DNA连接
要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓 度和两种DNA分子的克分子比率。
protein
Cre
Recombilation
DNA
Amplification
七. 利用YAC载体构建基因组文库
1. 两臂DNA片段的制备:
pYAC4 BamHI/EcoRI 脱磷酸化
2. 供体DNA片段的制备:
琼脂糖凝胶-DNA样品的制备 EcoRI部分酶切 凝胶电泳 片段回收和纯化
3. DNA的连接 4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法 5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中
利用P1载体 构建基因组文库
loxP Amp
Ad10 XbaI
pAD10 sacBII
(29.3 kb)
plasmid Rep
+
kanr
95 kb DNA fragment
ScaI pac loxP
sacB
lyt Rep
BamHI
sacB
Kanr
pac loxP
DNA headful
+
+ pac cleavage
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
5. 基因组文库的扩增
包装的λ颗粒 感染E.coli 培养 分离λ颗粒 -70℃保存
1） λDNA的包装物的制备
使用的大肠杆菌菌株：
E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])包装蛋白
E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])头部蛋白
i. 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
2) 重组DNA分子的包装与感染
与λ重组子包装相似, 然后感染E.coli NS3529 = E.coliK12 recA
mcrA Δ(hsdR hsdM mcrB mcrC mrr)(λimm434 nin5X1-cre) (λimmλLP1), 每微克DNA可在Kanr平板上4 X 105 - 2 X 106 Kanr。
五. 利用COS质粒载体构建基因组文库
构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备， 供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包 装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。
为提高文库质量，可采取以下措施：
1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
1) 包装物制备用菌株:
E.coli NS3208[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm-2 c1.100 am10.1)] : 制备pacase E.coli NS3210[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm c1.100 am131)] : 制备头部蛋白
4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增
利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞， 让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能 发生变化）
5. 基因组文库质量的评价
1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质 粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计 算文库大小。 2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续 筛选基因工作量。
三. 利用质粒载体 构建基因组文库
EcoRI HindIII BamHI
PstI
SalI
ScaI
AmpR
pBR322
(4.36 kb) TcR
Ori
该法简单、快速、易于 P 操作，但仅适合一些低 HO 等真核生物和原核生物。
BamHI
脱磷酸化
OH
OH
T4 连接酶
EcoRI HindIII
总DNA
MboI
载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG
4. 采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失
COS
利 用 单 质 粒 载 体 文 库
BH
BH
Ap r Ap r
cos Ori
Hind Cos
H
S
H
S1 Cos
S
BamH I 大片段 Cos
PstI
ScaI AmpR 重组DNA
Ori
SalI
转化E.coli
基因组文库
四. 利用λ载体构建基因组文库
1. 载体DNA片段的制备方法: 左右臂DNA片段的获得 2. 供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法 3. 重组DNA分子的形成：
控制克分子比率，使其形成串状DNA分子
4. 重组DNA分子的包装
基因文库的建立
基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) cDNA文库(cDNA library)
第一节
基因组文库的构建
定义：
含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。
一. 基因组文库的规模
N= ln（1-P） ln（1-f）
N—基因组文库克隆总数 P—所需机率 f—插入片段与基因组DNA长度之比
S
cos Ori
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamHwenku.baidu.comI 小片段
Cos
H
Cos ori Apr S
35-45kb DNA 片段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S 库载
感染E.coli
体
六. 利用P1载体构建基因组文库
构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
二．建立基因组文库的一般程序
1．载体DNA片段的制备
DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应
2． 供体DNA片段的制备
总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段
酶法
部分酶切
分离特定大小DNA片段
完全酶切
3. 供体与载体DNA连接
要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓 度和两种DNA分子的克分子比率。
protein
Cre
Recombilation
DNA
Amplification
七. 利用YAC载体构建基因组文库
1. 两臂DNA片段的制备:
pYAC4 BamHI/EcoRI 脱磷酸化
2. 供体DNA片段的制备:
琼脂糖凝胶-DNA样品的制备 EcoRI部分酶切 凝胶电泳 片段回收和纯化
3. DNA的连接 4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法 5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中
利用P1载体 构建基因组文库
loxP Amp
Ad10 XbaI
pAD10 sacBII
(29.3 kb)
plasmid Rep
+
kanr
95 kb DNA fragment
ScaI pac loxP
sacB
lyt Rep
BamHI
sacB
Kanr
pac loxP
DNA headful
+
+ pac cleavage
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
5. 基因组文库的扩增
包装的λ颗粒 感染E.coli 培养 分离λ颗粒 -70℃保存
1） λDNA的包装物的制备
使用的大肠杆菌菌株：
E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])包装蛋白
E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])头部蛋白
i. 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
2) 重组DNA分子的包装与感染
与λ重组子包装相似, 然后感染E.coli NS3529 = E.coliK12 recA
mcrA Δ(hsdR hsdM mcrB mcrC mrr)(λimm434 nin5X1-cre) (λimmλLP1), 每微克DNA可在Kanr平板上4 X 105 - 2 X 106 Kanr。
五. 利用COS质粒载体构建基因组文库
构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备， 供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包 装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。
为提高文库质量，可采取以下措施：
1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
1) 包装物制备用菌株:
E.coli NS3208[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm-2 c1.100 am10.1)] : 制备pacase E.coli NS3210[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm c1.100 am131)] : 制备头部蛋白
4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增
利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞， 让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能 发生变化）
5. 基因组文库质量的评价
1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质 粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计 算文库大小。 2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续 筛选基因工作量。
三. 利用质粒载体 构建基因组文库
EcoRI HindIII BamHI
PstI
SalI
ScaI
AmpR
pBR322
(4.36 kb) TcR
Ori
该法简单、快速、易于 P 操作，但仅适合一些低 HO 等真核生物和原核生物。
BamHI
脱磷酸化
OH
OH
T4 连接酶
EcoRI HindIII
总DNA
MboI
载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG
4. 采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失
COS
利 用 单 质 粒 载 体 文 库
BH
BH
Ap r Ap r
cos Ori
Hind Cos
H
S
H
S1 Cos
S
BamH I 大片段 Cos
PstI
ScaI AmpR 重组DNA
Ori
SalI
转化E.coli
基因组文库
四. 利用λ载体构建基因组文库
1. 载体DNA片段的制备方法: 左右臂DNA片段的获得 2. 供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法 3. 重组DNA分子的形成：
控制克分子比率，使其形成串状DNA分子
4. 重组DNA分子的包装