基因文库的建立
基因文库名词解释
基因文库名词解释基因文库（Gene Library）是指一种储存和维护大量基因序列信息的资源库。
它可以是物理上的储存设施，也可以是数据库或在线平台。
基因文库对基因研究和生物学研究具有重要的作用，可以用于基因克隆、基因功能研究、基因组测序等领域。
基因文库的建立通常是通过基因克隆的方法。
首先，将感兴趣的生物体组织中的所有基因提取出来。
然后，利用限制性内切酶将DNA分割成许多小片段，选择合适的载体（如质粒）将这些小片段连接到上面。
接下来，将这些载体转化到宿主细胞中，使其复制和扩增。
最后，将这些复制和扩增的载体分离并存储，形成一个基因文库。
基因文库通常分为多种类型，根据目的和特点的不同而有所不同。
其中，基因文库中最常见的类型是cDNA文库（Complementary DNA Library）。
cDNA文库由转录本（即mRNA或反义RNA）转录为一链cDNA，然后通过逆转录酶的作用合成双链cDNA，并用合成酶合成第二链。
这种文库可以用于研究某一特定组织或状态下基因的表达情况。
另外，基因文库还可以根据应用范围和目标进行分类。
例如，EST文库（Expressed Sequence Tag Library）主要用于寻找不同组织或细胞中的特定基因的表达情况。
基因组文库（Genomic Library）则可以用于对生物体的整个基因组进行克隆和研究。
基因文库的建立和维护对基因研究起着重要的作用。
它可以提供大量的基因序列信息，帮助科学家们研究基因的结构和功能。
通过基因文库，科学家们可以查找和克隆感兴趣的基因，研究其表达模式和调控机制，甚至开展基因治疗和基因工程等领域的研究。
总的来说，基因文库是储存和维护大量基因序列信息的资源库，通过基因克隆的方法建立，可以用于基因克隆、基因功能研究、基因组测序等领域。
基因文库在基因研究和生物学研究中具有重要的作用，对于我们深入理解基因的结构和功能以及开展相关研究具有重要意义。
基因组文库构建的基本过程
基因组文库构建的基本过程构建基因组文库，听起来是不是有点高大上？其实啊，这个过程就像是做一碗丰富的杂烩，里面有各种各样的成分，味道可好了。
今天就让我们轻松愉快地聊聊这个过程，从头到尾都不复杂，保证让你听完后恍若领悟了宇宙的奥秘！1. 基因组的准备首先，咱们得有“食材”，也就是目标基因组。
想象一下，像个侦探一样，你得先找到你要研究的生物，这可能是一只可爱的青蛙，或者一株神秘的植物。
然后，从这些生物体中提取DNA，这一步就像是把青蛙放在水里，慢慢观察它的变化。
提取DNA的过程其实也没那么神秘，简单来说，就是用一些化学试剂把细胞里的DNA分离出来。
就像剥蒜一样，简单又有效。
接下来，得把提取的DNA切割成小片段。
这就好比在厨房里把食材切成小块，方便后面的烹饪。
这个切割的过程，通常用一些特殊的酶，听上去高端，但实际上就是让DNA变得易于处理。
你可能会想，这么多小块到底怎么存起来呢？别急，接下来就要介绍基因组文库的“容器”了。
2. 构建文库2.1 载体的选择在我们的基因组文库中，载体就像是一个个小小的运输箱，专门用来存放那些切割好的DNA片段。
这里面有各种各样的选择，最常见的就是质粒，这种小圆圈状的DNA 能在细胞中独立复制，真是个省心的好伙伴！当然，也有其他的载体选择，比如病毒载体，听起来就有点神秘，实际上它们也只是利用病毒的特性来运送我们的DNA而已。
2.2 转化过程有了载体后，咱们就可以把这些小DNA片段装进去，进行转化了。
转化就像是给每个小箱子上锁，把它们装上货车，准备运输到指定地点。
通常我们会把这些装有DNA的载体放入细胞中，等待它们“安家落户”。
这一步可有讲究了，要控制好温度和环境，让细胞在“舒适”的状态下接纳这些新朋友。
3. 筛选与鉴定3.1 筛选一旦我们的载体和DNA片段都进了细胞，接下来就是筛选这些“小箱子”了。
这一步可以想象成是在参加一个聚会，大家都是陌生人，但你只想和那些有趣的、能引起你兴趣的人交朋友。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章概述CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具，可以用于克隆和表达特定基因。
本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线，包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。
第一步：RNA提取构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。
这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。
在提取RNA的过程中，需要注意样品的保存和处理，以确保所提取的RNA完整无损。
第二步：逆转录逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。
逆转录反应通常使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）进行，该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。
在逆转录反应中，需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶，以及适当的缓冲液。
逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。
第三步：cDNA合成在逆转录反应完成后，需要对产生的cDNA进行纯化。
一种常用的方法是通过酶切和连接反应，将cDNA连接到载体上，形成重组DNA，再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。
在cDNA 合成的过程中，需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制，以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。
第四步：文库构建文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中，形成cdna基因文库。
常用的载体包括质粒和噬菌体等。
在文库构建的过程中，需要对cDNA和载体进行受限酶切，然后使用DNA连接酶将其连接起来。
连接后的DNA需要进行转化，将其导入到适当的宿主细胞中，形成文库。
不同的文库构建方法有所差异，可以根据实验需求选择合适的方法。
第五步：筛选构建cdna基因文库后，需要对文库进行筛选，以寻找感兴趣的基因。
常用的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选和基于功能的筛选等。
根据所研究的基因或表达产物的特性，可以选择合适的筛选方法。
筛选后的阳性克隆可以进一步进行测序和鉴定，以确认所克隆的基因的准确性和完整性。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
怎样构建基因组文库
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
基因组文库构建
构 建 基 因 组 D N A 和 cD N A 文 库 的 流 程 示 意 图
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算， 基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
H in d I I I C os N otI Z T7 P a rC CM SP6 N otI
r
H in d III 部 分 酶 切
P a rB P a rA
BAC o r iS PFG L re p E H in d I I I C IP
P u lse d -fie ld g e l e le c tro 使其成为一定大小的片段连接到适当载体常为噬菌体上经体外包装转染细菌得到一群含不同dna片全部基因的随酶切使其成为一定大小的片段，连 接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装 转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组 噬菌体颗粒。此即是基因。这群DNA片 段含盖基因组全部基因。
但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或DNA。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
真 核 基 因 组 DNA
λ 取 代 型 λ 噬 菌 体 载 体
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
yac构建基因文库的原理
yac构建基因文库的原理基因文库是DNA片段的集合，其中每个片段都包含来自基因组的某个部分。
这些片段可以来自不同的染色体区域，并且可能包含整个基因或其部分。
YAC（酵母人工染色体）是一种用于构建基因文库的载体，它允许研究人员在酵母细胞中克隆和表达大片段的基因组DNA。
下面将详细介绍YAC构建基因文库的原理，主要包含以下几个方面：1. 构建构建YAC载体的第一步是制备适合克隆大片段DNA的载体。
通常，YAC载体包含一个选择标记（如抗性基因），允许在含有特定抗生素的培养基上筛选和识别含有YAC的克隆。
此外，YAC载体还应包含一个多克隆位点，用于插入感兴趣的基因组DNA片段。
2. 转化一旦制备了YAC载体，就可以将其转化到酵母细胞中。
转化过程通常涉及将酵母细胞与YAC载体共孵育，以使载体与酵母细胞的DNA结合。
然后，通过加入选择标记来筛选和识别成功转化的细胞。
3. 克隆化在成功转化后，研究人员需要筛选和识别含有重组YAC载体的细胞克隆。
通常，这可以通过多轮筛选和鉴定来完成。
首先，研究人员可以使用特定抗生素来筛选含有选择标记的细胞。
然后，他们可以使用 Southern 印迹分析或 PCR 等技术来鉴定含有重组YAC载体的克隆。
4. 筛选筛选是YAC构建基因文库的关键步骤之一。
通过筛选，研究人员可以识别包含所需基因组区域的有效克隆。
这通常涉及对重组YAC进行分子遗传分析，以确定其包含的基因组区域。
通过比较筛选结果和基因组图谱，研究人员可以选择正确的克隆用于进一步研究。
5. 鉴定一旦筛选出正确的克隆，研究人员需要对其进行进一步鉴定。
这可以通过一系列技术来完成，包括 Southern 印迹分析、PCR、测序和功能分析等。
通过这些技术，研究人员可以确定重组YAC中的基因组区域是否包含所需的目标基因或DNA片段。
此外，他们还可以验证克隆的可靠性和稳定性，以确保其可以用于进一步实验和研究。
总之，YAC构建基因文库是一个复杂的过程，涉及多个步骤和关键环节。
基因文库的构建
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体
由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下：
质粒
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
ABC
DEF G
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
A
1
1
1
1
B
1
11
1
C
1
1111D Nhomakorabea1
1
11
1
E
1
1
1
1
F
1
1
11
G
1
1
1
1
01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 0的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排 列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息基因的基本概念 基因的构建程序 基因组重组克隆的排序
基因的基本概念基因库与基因
基因库（gene pool） 特定生物e bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存序列为探针，进行第二步走 读，直至线型染色体DNA的端点
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列
基因文库的构建
5. 重组 重组cDNA分子的转移和的建立 分子的转移和的建立选用载体为质粒，可直接转化 载体， 选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为 载体，则 ；若为λ载体 需进行体外包装、感染等。 需进行体外包装、感染等。
ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切
cDNA的段或条件的某种细胞分 定义：
离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重 经反转录成 离到的全部 后再重 组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。 组和增殖所性
常来自结构基因， 常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信 且只代表那些正在表达的基因的遗传信息： 息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—n(1―p) ln(1―f)
f为某一特定 为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部 为某一特定 （ ） cDNA (mRN1. 载体 载体DNA片段的制备 片段的制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 多聚（ ） 的分离与纯化 3. 双链 双链cDNA 的合成
2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样， 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的 表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所 表达就具有器官特异性. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段） 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结 构基因表达亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分 中，不同类是大不相同的，尽管它们都是由单拷 贝基因转 贝基因均有相同的克隆数相较，这是两种文 库的另一差别。 库的另一差别。
NotI primer/adaptor
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
SalI adaptor
基因工程中为什么要建立基因文库
基因工程中为什么要建立基因文库？基因文库是如何建立的？基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。
目的：当我们要对某一基因结构和功能进行研究时，首先要获得此基因，最简便的方法就是直接从基因文库中获取。
构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到载体中，从而获得含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组文库。
打个比方让你建图书馆，你就得把所有书分门别类放，以便于找。
这么多书你一个人又搞不定，所以你得找一群人，一个人负责一部分，各自干各自的，然后最后一汇总就行了。
基因组文库和cDNA文库一.基因组文库用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。
由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。
这样的一套克隆便称作基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库(genomic library)。
二.cNDA 文库的构建及应用cDNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。
与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA 为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。
cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低。
随着分子克隆研究在理论和技术上的进步，cDNA 基因文库的构建不仅是分离基因的重要手段，也是当前真核分子生物学研究的强有力工具。
首先，在基因工程的操作中，以cDNA为探针可从基因组文库中分离出相应的特异基因；其次，cDNA序列只与基因中的编码序列有关，有助于对真核生物mRNA结构和功能的认识；再者，cDNA 克隆还可以有效地分析真核基因的结构和功能。
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
基因组文库的构建培训讲学
3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基 中
方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为25% 的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。
缺点：需保存的列合成引物， 扩增特异性片段
结束语
谢谢大家聆听！！！
24
• 对于高等真核生物而言，基因组DNA十 分庞大,基因可达数万个，且基因组成结 构复杂，除编码序列，还有非编码序列 及调控序列，基因间还存在大量的间隔 序列和重复序列，因此，单个目的基因 在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以克隆子的保存与筛选1、基因组DNA的保存1) 影印膜滤保存法
2）在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培加的序列过多或过少。
（一）生物基因组DNA的提取 染色体DNA
（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024
2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb
①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的
提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的
部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染
宿主细胞； ⑤重
基因重组
体外包装
转化细菌四、生物基因组DNA的构建一个理想的基因组DNA应具备下列条件： • 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 • 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 • 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序基因组文库构建程序基因组文库构建是基因组学研究中的重要步骤之一，它是将DNA 分子切割成小片段，并将这些小片段插入到载体DNA中，形成文库。
文库构建的成功与否直接影响到后续的测序结果和分析结果。
因此，开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
基因组文库构建程序的主要步骤包括DNA片段切割、文库构建、文库质量控制等。
其中，DNA片段切割是文库构建的关键步骤之一。
DNA片段切割的方法有多种，如限制性内切酶切割、超声波切割、化学切割等。
不同的切割方法适用于不同的样品类型和研究目的。
例如，限制性内切酶切割适用于较小的基因组，而超声波切割适用于大型基因组。
文库构建是基因组文库构建程序的核心步骤之一。
文库构建的方法有多种，如插入式文库构建、接头式文库构建等。
插入式文库构建是将DNA片段直接插入到载体DNA中，而接头式文库构建则是在DNA片段的两端加上接头序列，再将其插入到载体DNA中。
接头式文库构建相对于插入式文库构建具有更高的文库构建效率和更低的文库构建偏差。
文库质量控制是基因组文库构建程序的最后一步。
文库质量控制的目的是检测文库的质量和纯度，以保证后续的测序结果和分析结果的准确性。
文库质量控制的方法有多种，如琼脂糖凝胶电泳、荧光定量、质量评估等。
其中，质量评估是文库质量控制的重要步骤之一，它可以评估文库的质量和纯度，并确定文库的适用范围和测序深度。
基因组文库构建程序是基因组学研究中不可或缺的步骤之一。
开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
未来，随着基因组学研究的不断深入，基因组文库构建程序的研究和开发将会越来越重要。
第7章 基因文库的构建
cDNA 只能反映基因表达的转录及加工后的 mRNA 产物所携带的信息 , 也即 cDNA 序列只与 基因的编码序列有关 , 不能反映基因的内含 子 , 也不能反映基因的转录启动子和终止子 等,所以cDNA便于克隆及大量扩增,构建的文 库复杂性低 , 库中总的克隆数较少，则从中筛选
特异基因比较容易，但由于插入片段较 长，以后的分析比较困难。
因为基因组DNA片段是随机克隆的，所以基因组大小除以
克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角
度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率 只有50%。当克隆数增A数
细胞中某种mRNA的拷贝数
例如 某细胞的总mRNA数为500500个
如 获 得 丰 度 为 每 细 胞 3500 拷 贝 (14 拷 贝 ) 的 mRNA 基 因 , 应 构 建 的 文 库 的 最 小 值 为 500500/3500 (14) =143 (35750) ;
通常选质粒载体或噬菌体载体。
以 质 粒 为 载 体 构 建 文 库 示 意 图 cDNA
以 λ 噬 菌 体 作 载 体 构 建 cD织中,并 非所有的基因都表达,通常表达的基因 仅占基因总数的15%,产生出约15000种 不同的mRNA分子,因此在mRNA水平上分 离目的基因,可以大大地缩小搜寻目的 基因的范围,降低分离目的基因的难度.
真核生物mRNA分子的3`端有多聚腺核苷酸组成 的poly(A)尾巴，这种特性为分离纯化mRNA分子 提供了方便。
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成cDNA构建时载体的选择：由于绝大多数真核生物的mRNA00) 个克隆子组成的cDNA文 库中应包含1个如此
第三章基因文库的构建
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
16
一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
17
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant
7 文库构建
粘性末端
末端转移酶 CCCቤተ መጻሕ%的mRNA时 所需要的克隆数目。
ln (1-p) N=n : 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA 占细胞整个mRNA的比例
N：所需的重组载体数（克隆数）
colicoli直接克隆筛选直接克隆筛选dnadna分离分离酵母染色体酵母染色体dnadna与质粒共沉淀与质粒共沉淀简单简单方便的制备方便的制备去除了一步转化去除了一步转化克隆分析克隆分析繁琐的纯化后进行繁琐的纯化后进行直接进行直接进行结果评价结果评价假阳性多假阳性多假阳性少假阳性少决定细菌杂交系统能更灵敏检测难发现特定蛋白结合体决定细菌杂交系统能更灵敏检测难发现特定蛋白结合体对待测蛋白的特性要求低对待测蛋白的特性要求低因此可适合更大蛋白库筛选因此可适合更大蛋白库筛选用于研究蛋白dna蛋白蛋白间相互作用建立基于三个原因
N：所需的重组载体数（克隆数）
ln (1-p) ln (1-99%) N= ln (1-f) = ln (1-f) = 4.61× G f
G N= 4.61× f G：Genome大小；f：fragment大小 例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA 片断的平均长度如果是1.7×104 bp 3×109 G = 4.61× 5 4 = 8.1×10 N= 4.61× f 1.7×10
ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制
所必须的信号。
YAC 载体的选择标记
主要采用营养缺陷型基因
色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu
2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突
变抑制基因 sup4 带有赭石突变 ade 2-1的酵母菌在基本培养基上形成 红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于 细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的 白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载 体中含有外源 DNA 片段插入的重组子。
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序通常包括以下步骤：
1. DNA提取：从样品（比如细胞、组织、血液等）中提取DNA，并对其进行质量控制。
2. DNA片段化：将DNA样品通过不同的方式（比如随机切割、酶切等）分解成小片段，一般为200-800bp。
3. 处理DNA片段：对DNA片段进行多个步骤的处理，包括末端修复、加上适配器、文库大小筛选等。
4. PCR扩增：使用PCR技术通过适配器扩增DNA片段，以获得足够多的文库。
5. 纯化文库：对PCR扩增产生的文库进行纯化，以去除杂质。
6. 测序：利用高通量测序技术对文库进行测序，生成原始测序数据。
7. 数据处理：对原始测序数据进行序列质控、序列拼接、比对等处理，最终生成基因组序列。
常用的基因组文库构建程序有：TruSeq DNA Sample Preparation Kit（Illumina）、Nextera DNA Flex Library Prep Kit（Illumina）、KAPA HyperPlus Library Preparation Kit （Roche）等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应
2． 供体DNA片段的制备
总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段酶法Fra bibliotek部分酶切
分离特定大小DNA片段
完全酶切
3. 供体与载体DNA连接
要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓 度和两种DNA分子的克分子比率。
PstI
ScaI AmpR 重组DNA
Ori
SalI转化E.coli基因组四. 利用λ载体构建基因组
1. 载体DNA片段的制备方法: 左右臂DNA片段的获得 2. 供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法 3. 重组DNA分子的形成：
控制克分子比率，使其形成串状DNA分子
4. 重组DNA分子的包装
五. 利用COS质粒载体构建基因组构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备， 供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包 装。单C：
1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生
2) 重组DNA分子的包装与感染
与λ重组子包装相似, 然后感染E.coli NS3529 = E.coliK12 recA
mcrA Δ(hsdR hsdM mcrB mcrC mrr)(λimm434 nin5X1-cre) (λimmλLP1), 每微克DNA可在Kanr平板上4 X 105 - 2 X 106 KanrmHI
PstI
SalI
ScaI
AmpR
pBR322
(4.36 kb) TcR
Ori
该法简单、快速、易于 P 操作，但仅适合一些低 HO 等真核生物和原核生物。
BamHI
脱磷酸化
OH
OH
T4 连接酶
EcoRI HindIII
总DNA
MboI
载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG4. 采用快速构建法以避免扩增时DNA丢失
COS
利 用 单 质 粒 载 体 文 库
BH
BH
Ap r Ap r
cos Ori
Hind Cos
H
S
H
S1 Cos
S
BamH I 大片段 Cos
S
cos Ori
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
Cos ori Apr S
35-45kb DNA 片段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S 库载
感染E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1） λDNA的包装物的制备
使用的大肠杆菌菌株：
E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])包装蛋白
E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])头部蛋白
i. 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
protein
Cre
Recombilation
DNA
Amplification七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
pYAC4 BamHI/EcoRI 脱磷酸化
2. 供体DNA片段的制备:
琼脂糖凝胶-DNA样品的制备 EcoRI部分酶切 凝胶电泳 片段回收和纯化
3. DNA的连接 4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法 5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
1) 包装物制备用菌株:
E.coli NS3208[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm-2 c1.100 am10.1)] : 制备pacase E.coli NS3210[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm c1.100 am131)] : 制备头部蛋白
4. 重组DNA分子的转移和基因组的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞， 让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子机挑取一些转化子或重组子，提取质 粒DNA，电泳量越高，可大大减轻后续 筛选基因 XbaI
pAD10 sacBII
(29.3 kb)
plasmid Rep
+
kanr
95 kb DNA fragment
ScaI pac loxP
sacB
lyt Rep
BamHI
sacB
Kanr
pac loxP
DNA headful
+
+ pac cleavage
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗li 培养 分离λ颗粒全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比