显微标本制作的一般原理及步骤(精)
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• 脱水的过程一般是： 脱水应逐步进行，而不应跨越太大的浓度梯度，否 则将引起组织强烈的收缩或变形。在经无水乙醇处 理时，应保证试剂的纯度。演示
2.4 透明
• 透明过程的作用是用一种既能与脱水剂（如酒精） 又能与包埋介质混合的液体来置换样品中的脱水剂 （酒精），从而为最终的包埋创造一个有利的条件。 现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。
• 2 常用试剂-2.1 常用固定剂
包音氏(Bouin`s)固定液
苦味酸饱和水溶液 75ml
甲醛 （40%） 25ml
冰醋酸
5 ml
海利氏(Helly`s)液
重铬酸钾 氯化汞 蒸馏水 40%甲醛液
2.5g 6g 100ml 5 ml
卡诺(Carnoy)固定液
纯酒精 冰醋酸
15 ml 5 ml
约翰森固定液
2 常用试剂
• 2.2 常用脱水剂：酒精，正丁醇，叔丁醇，丙酮等
• 2.3 常用透明剂：二甲苯，甲苯，氯仿，丁香油等。
• 2.4 常用粘贴剂
• 明胶粘贴剂
明 胶 1g 蒸馏水 石碳酸 2g 甘 油 蛋白粘贴剂
100ml 15ml
新鲜蛋清 25 ml 甘 油 25 ml 石炭酸 0.5 g • 2.5 包理剂：石蜡，火棉胶，明胶等。 • 2.6 封固剂：阿拉伯树胶，加拿大树胶。
2.6 包理 演示
• 组织块经石蜡渗透后，其内部间隙已完全 被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石 蜡包理成蜡块以利于后续的切片。包理可 用专用的器具，也可用牛皮折叠成的纸盒。
• 将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻 轻将浸好蜡的组织块夹起浅埋在纸盒中的 石蜡内，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。
2.7 切片 演示
2.8 染色 演示
• 切片可用不同方法，使其干燥，然后进行染色。因 为每一张载片上粘贴的是蜡带，因此必须先用二甲 苯去除石蜡再用酒精去除二甲苯，再进入水中，才 能染色。染色的方法很多，要根据每张标本要求显 示的目的选择不同的染剂。最常用的是苏木精，伊 红染色（简称 H·E 染色）。苏木精使细胞核呈深紫 色，伊红使细胞质显粉红色。染色后再根据制片的 基本原理，使带水的载片经历脱水→透明步骤最后 用光学树胶封片。
显微标本制作的一般原理及步骤
湖州师院 杨建民
一、实验原理
• 显微标本的制作技术是组织学、胚胎学、生理学及细胞学等 学科研究观察细胞、组织的生理及病理形态变化的一种主要 方法。
• 大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微镜观察的， 因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构。细胞 内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过， 也难以辩明。
1.1 涂片法
• 主要用于血液、精液、尿、痰、微 生物等不能切成薄片的液态材料， 可在载玻片上涂成单层细胞，再经 固定，脱水，染色等手段制成永久 标本。演示
1.2 铺片法
• 主要用于动植物组织的表皮层观察。 可活体取待观察动植物组织，用尖 镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载 玻片上。 如: 洋葱表皮细胞的铺片制 备。演示
甘油 甲醇
Hale Waihona Puke Baidu
100ml 100ml
伊红(Eosin)
伊红 水
0.1-1g 100ml
伊红又称曙红，是酸性染料， 一般与苏木精共同使用，(H，E 染色)主要染细胞质，胶原纤维 及肌纤维
番红-固绿对染
固绿染液：0.5g固绿溶于100ml 95%酒精溶液； 番红染液: 1g番红溶于100ml 50% 酒精溶液。
2.2 固定
• 动植物的任何组织部位取材后，首先用化 学试剂将其固定。固定的作用在于通过固 定剂，在尽量短的时间内使原生质体停止 生命活动，并如同生前一样精细的保存其 细胞结构，同时易于后步骤的染色。演示
•
良好的固定剂应该具备以下条件：
• 迅速渗入组织，杀死原生质体，在短时间内， 组织内外完全固定；
• 显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的 多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失 败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能有所结果。
二、实验用品
1器械 2 常用试剂 2.1 常用固定剂 2.2 常用脱水剂 2.3 常用透明剂 2.4 常用粘贴剂 2.5 包理剂 2.6 封固剂 2.7 常用染剂
• 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂。它具有渗透力 强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点。其缺点是易 使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组 织块大小及质地酌情而定。演示
2.5 渗蜡
• 将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石 蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至 用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便 于今后的包理与切片。 石蜡有液态与固态 二种，渗蜡要在恒定温箱（60℃）中进行， 以保证石蜡处于液态中。 演示
• 尽可能避免使组织膨胀或收缩，并且软硬合适 于切片；
• 增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别，同时 增加媒染作用和染色能力； 固定液同时是防腐液，使材料不致变质腐败。
2.3 脱水
• 脱水过程的作用是用一种既能与水又能与透明液混 合的液体来逐渐置换样品中游离的水。
• 现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水。 脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。
• 但在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后就可把材料切成 较薄的片子，再用不同的染色方法以显示不同细胞组织的形 态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚 地看到其中不同的区域组分状态。切片也便于保存，所以是 教学和科研中常用的方法。
一、实验原理
• 生物显微制片方法 非切片法：涂片，铺片，压片，磨片，整装片 切片法：石蜡切片法，火棉胶切片法，冰冻切片法
• 1器械
• 电 温 箱：体积较小，温度调节一般在60-75oc，用于融腊及滲腊 • 显 微 镜：用于观察染色情况，及检查切片效果 • 切 片 机：切片用。通常为了能够得到连续切片，多用转动切片机[图] • 切 片 刀：为切片机必备配件 [图] • 磨 刀 机：磨刀用 [图] • 电热温台：为了展平蜡带或烤干制片 [图] • 天 平：配溶液用 • 玻璃器皿：染色缸，烧杯，量桶，试剂瓶，移液管等 • 其 它：剪子，镊子，解剖针，毛笔，刀片，小木块等
实验：淀粉的显示和观察
• 切片：徒手切取马铃薯薄片，放置于载 玻片上。
• 染色：用吸管吸取革兰碘液1滴于马铃薯 薄片上，5-10分钟，盖上盖玻片。
• 观察：低倍镜下所见多角形的薄壁细胞 中有许多椭圆形蓝色颗粒，即淀粉粒。
制备植物石蜡切片常用固绿--番 红对染，结果是木质化的细胞 壁及细胞核染成红色，薄的细 胞壁（纤维素）和胞质染成绿 色。
苏丹ш染液
苏丹ш 0.3-0.5g 70%酒精 100 ml
此染液主要用于染脂滴。
三、操作步骤
1 非切片法
• 非切片法即不用切片机、不经切片手续 而制成切片的方法。根据材料性质的不 同，有不同的处理方法。该类方法操作 简单快捷。其中铺片法、封藏法可使原 有组织结构不被破坏；涂片法、压片法 弥补了用包埋、切片法有时观察不清楚 的不足，因此是显微标本制备中常用的 手段。
2.7 常用染剂
代氏（Delafield`s）
苏木精 95%酒精
4g 25ml
苏木精
10%铵明矾水溶液 400ml
（上述试剂配好后，瓶口用纱布
封盖，置向阳处，3-4天后加入下
列试剂。）
该液两月后成熟，色彩蓝紫色， 时间越长效果越好，为生物制 片技术中最常用 的核染剂，染 色后，一般用0.1% 盐酸水溶液 褪去浮色，可使染色显出不同 层次（此过程称为分色）。
• 下边以石蜡切片为例，介绍显微标本的制备方法。
2.1 取材
• 根据不同的实验目的，选择相应的材料。材料要求 新鲜，准确。材料要避免挤压，挫伤，干枯。
• 所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集 时间、地点、名称、组织部位等。取组织块要大小 适当，既要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能 力。
• 一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小；植物组织 取材稍小，动物组织取材要稍大。
福尔马林 丙酸 酒精
5 ml 5 ml 90ml
该液适用于固定无脊柱动物， 其渗透力强，组织收缩小， 不易变形。
该液适用于骨髓，脾，肝等 造血器官的固定。
该液渗透迅速，可用作植物 组织或培养细胞的固定，亦 适用于动物组织，但不易时 间太长，防止组织过度硬化。
该液用于固定植物根尖，茎 尖，有较好的效果，通常固 定24小时，亦可做保存液。
2 切片法
• 切片法即必须依靠切片机将组织切成薄片来进行观 察的方法。为了能清晰地观察到动植物的组织结构 及细胞形态，必须先经过一系列步骤使组织内渗入 某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片。根据 所用支持剂的种类不同，可分为石蜡切片法、火棉 胶切片法、冰冻切片法等类型。切成薄片后还需要 去蜡，染色，脱水，透明等手段，将其制成永久标 本。
• 修块： 切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡 块切开，使每一小块都含有一块组织，并将这块组 织周围的石蜡切除，将组织修成一小块蜡块并粘在 大小适宜的硬木块上，以便于固定在切片机上。
• 贴片： 一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片 连成一长条蜡带。
• 切下的蜡带放在一干净黑纸上，用小刀根据需要切 成数段，分别贴在干净载玻片上。在恒温展片台上 展平，烘干。
1.3 压片法
• 一些较幼嫩、柔软的材料可将其置于载 玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料 一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力 挤压，使组织散成一薄片，再进行观察。 如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发 育阶段等。演示
1.4 离析法
• 该方法是利用化学试剂使组织的细 胞间质溶解，使细胞能分散成单个 个体，经染色、脱水、透明即可观 察其个体形态，适用于平滑肌、叶 片等部位。演示
2.4 透明
• 透明过程的作用是用一种既能与脱水剂（如酒精） 又能与包埋介质混合的液体来置换样品中的脱水剂 （酒精），从而为最终的包埋创造一个有利的条件。 现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。
• 2 常用试剂-2.1 常用固定剂
包音氏(Bouin`s)固定液
苦味酸饱和水溶液 75ml
甲醛 （40%） 25ml
冰醋酸
5 ml
海利氏(Helly`s)液
重铬酸钾 氯化汞 蒸馏水 40%甲醛液
2.5g 6g 100ml 5 ml
卡诺(Carnoy)固定液
纯酒精 冰醋酸
15 ml 5 ml
约翰森固定液
2 常用试剂
• 2.2 常用脱水剂：酒精，正丁醇，叔丁醇，丙酮等
• 2.3 常用透明剂：二甲苯，甲苯，氯仿，丁香油等。
• 2.4 常用粘贴剂
• 明胶粘贴剂
明 胶 1g 蒸馏水 石碳酸 2g 甘 油 蛋白粘贴剂
100ml 15ml
新鲜蛋清 25 ml 甘 油 25 ml 石炭酸 0.5 g • 2.5 包理剂：石蜡，火棉胶，明胶等。 • 2.6 封固剂：阿拉伯树胶，加拿大树胶。
2.6 包理 演示
• 组织块经石蜡渗透后，其内部间隙已完全 被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石 蜡包理成蜡块以利于后续的切片。包理可 用专用的器具，也可用牛皮折叠成的纸盒。
• 将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻 轻将浸好蜡的组织块夹起浅埋在纸盒中的 石蜡内，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。
2.7 切片 演示
2.8 染色 演示
• 切片可用不同方法，使其干燥，然后进行染色。因 为每一张载片上粘贴的是蜡带，因此必须先用二甲 苯去除石蜡再用酒精去除二甲苯，再进入水中，才 能染色。染色的方法很多，要根据每张标本要求显 示的目的选择不同的染剂。最常用的是苏木精，伊 红染色（简称 H·E 染色）。苏木精使细胞核呈深紫 色，伊红使细胞质显粉红色。染色后再根据制片的 基本原理，使带水的载片经历脱水→透明步骤最后 用光学树胶封片。
显微标本制作的一般原理及步骤
湖州师院 杨建民
一、实验原理
• 显微标本的制作技术是组织学、胚胎学、生理学及细胞学等 学科研究观察细胞、组织的生理及病理形态变化的一种主要 方法。
• 大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微镜观察的， 因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构。细胞 内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过， 也难以辩明。
1.1 涂片法
• 主要用于血液、精液、尿、痰、微 生物等不能切成薄片的液态材料， 可在载玻片上涂成单层细胞，再经 固定，脱水，染色等手段制成永久 标本。演示
1.2 铺片法
• 主要用于动植物组织的表皮层观察。 可活体取待观察动植物组织，用尖 镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载 玻片上。 如: 洋葱表皮细胞的铺片制 备。演示
甘油 甲醇
Hale Waihona Puke Baidu
100ml 100ml
伊红(Eosin)
伊红 水
0.1-1g 100ml
伊红又称曙红，是酸性染料， 一般与苏木精共同使用，(H，E 染色)主要染细胞质，胶原纤维 及肌纤维
番红-固绿对染
固绿染液：0.5g固绿溶于100ml 95%酒精溶液； 番红染液: 1g番红溶于100ml 50% 酒精溶液。
2.2 固定
• 动植物的任何组织部位取材后，首先用化 学试剂将其固定。固定的作用在于通过固 定剂，在尽量短的时间内使原生质体停止 生命活动，并如同生前一样精细的保存其 细胞结构，同时易于后步骤的染色。演示
•
良好的固定剂应该具备以下条件：
• 迅速渗入组织，杀死原生质体，在短时间内， 组织内外完全固定；
• 显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的 多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失 败，因此需要耐心细致，不断总结经验，才能有所结果。
二、实验用品
1器械 2 常用试剂 2.1 常用固定剂 2.2 常用脱水剂 2.3 常用透明剂 2.4 常用粘贴剂 2.5 包理剂 2.6 封固剂 2.7 常用染剂
• 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂。它具有渗透力 强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点。其缺点是易 使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组 织块大小及质地酌情而定。演示
2.5 渗蜡
• 将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石 蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至 用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便 于今后的包理与切片。 石蜡有液态与固态 二种，渗蜡要在恒定温箱（60℃）中进行， 以保证石蜡处于液态中。 演示
• 尽可能避免使组织膨胀或收缩，并且软硬合适 于切片；
• 增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别，同时 增加媒染作用和染色能力； 固定液同时是防腐液，使材料不致变质腐败。
2.3 脱水
• 脱水过程的作用是用一种既能与水又能与透明液混 合的液体来逐渐置换样品中游离的水。
• 现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水。 脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。
• 但在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后就可把材料切成 较薄的片子，再用不同的染色方法以显示不同细胞组织的形 态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚 地看到其中不同的区域组分状态。切片也便于保存，所以是 教学和科研中常用的方法。
一、实验原理
• 生物显微制片方法 非切片法：涂片，铺片，压片，磨片，整装片 切片法：石蜡切片法，火棉胶切片法，冰冻切片法
• 1器械
• 电 温 箱：体积较小，温度调节一般在60-75oc，用于融腊及滲腊 • 显 微 镜：用于观察染色情况，及检查切片效果 • 切 片 机：切片用。通常为了能够得到连续切片，多用转动切片机[图] • 切 片 刀：为切片机必备配件 [图] • 磨 刀 机：磨刀用 [图] • 电热温台：为了展平蜡带或烤干制片 [图] • 天 平：配溶液用 • 玻璃器皿：染色缸，烧杯，量桶，试剂瓶，移液管等 • 其 它：剪子，镊子，解剖针，毛笔，刀片，小木块等
实验：淀粉的显示和观察
• 切片：徒手切取马铃薯薄片，放置于载 玻片上。
• 染色：用吸管吸取革兰碘液1滴于马铃薯 薄片上，5-10分钟，盖上盖玻片。
• 观察：低倍镜下所见多角形的薄壁细胞 中有许多椭圆形蓝色颗粒，即淀粉粒。
制备植物石蜡切片常用固绿--番 红对染，结果是木质化的细胞 壁及细胞核染成红色，薄的细 胞壁（纤维素）和胞质染成绿 色。
苏丹ш染液
苏丹ш 0.3-0.5g 70%酒精 100 ml
此染液主要用于染脂滴。
三、操作步骤
1 非切片法
• 非切片法即不用切片机、不经切片手续 而制成切片的方法。根据材料性质的不 同，有不同的处理方法。该类方法操作 简单快捷。其中铺片法、封藏法可使原 有组织结构不被破坏；涂片法、压片法 弥补了用包埋、切片法有时观察不清楚 的不足，因此是显微标本制备中常用的 手段。
2.7 常用染剂
代氏（Delafield`s）
苏木精 95%酒精
4g 25ml
苏木精
10%铵明矾水溶液 400ml
（上述试剂配好后，瓶口用纱布
封盖，置向阳处，3-4天后加入下
列试剂。）
该液两月后成熟，色彩蓝紫色， 时间越长效果越好，为生物制 片技术中最常用 的核染剂，染 色后，一般用0.1% 盐酸水溶液 褪去浮色，可使染色显出不同 层次（此过程称为分色）。
• 下边以石蜡切片为例，介绍显微标本的制备方法。
2.1 取材
• 根据不同的实验目的，选择相应的材料。材料要求 新鲜，准确。材料要避免挤压，挫伤，干枯。
• 所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集 时间、地点、名称、组织部位等。取组织块要大小 适当，既要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能 力。
• 一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小；植物组织 取材稍小，动物组织取材要稍大。
福尔马林 丙酸 酒精
5 ml 5 ml 90ml
该液适用于固定无脊柱动物， 其渗透力强，组织收缩小， 不易变形。
该液适用于骨髓，脾，肝等 造血器官的固定。
该液渗透迅速，可用作植物 组织或培养细胞的固定，亦 适用于动物组织，但不易时 间太长，防止组织过度硬化。
该液用于固定植物根尖，茎 尖，有较好的效果，通常固 定24小时，亦可做保存液。
2 切片法
• 切片法即必须依靠切片机将组织切成薄片来进行观 察的方法。为了能清晰地观察到动植物的组织结构 及细胞形态，必须先经过一系列步骤使组织内渗入 某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片。根据 所用支持剂的种类不同，可分为石蜡切片法、火棉 胶切片法、冰冻切片法等类型。切成薄片后还需要 去蜡，染色，脱水，透明等手段，将其制成永久标 本。
• 修块： 切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡 块切开，使每一小块都含有一块组织，并将这块组 织周围的石蜡切除，将组织修成一小块蜡块并粘在 大小适宜的硬木块上，以便于固定在切片机上。
• 贴片： 一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片 连成一长条蜡带。
• 切下的蜡带放在一干净黑纸上，用小刀根据需要切 成数段，分别贴在干净载玻片上。在恒温展片台上 展平，烘干。
1.3 压片法
• 一些较幼嫩、柔软的材料可将其置于载 玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料 一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力 挤压，使组织散成一薄片，再进行观察。 如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发 育阶段等。演示
1.4 离析法
• 该方法是利用化学试剂使组织的细 胞间质溶解，使细胞能分散成单个 个体，经染色、脱水、透明即可观 察其个体形态，适用于平滑肌、叶 片等部位。演示