DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告

DNA的定量测定（二苯胺法）实验报告

一、实验目的

掌握用二苯胺法定量测定DNA含量的基本原理和方法。

二、实验原理

➢在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤，脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。其中脱氧核糖在酸性条件下，脱水生成ω－羟基－y－酮基戊糖，后者与二苯胺作用呈现蓝色，在595nm处有最大光吸收。当样品DVA的含量在40－400µg范围时，光密度与DNA的浓度成正比。

➢样品中含有少量RNA不影响测定结果，但是蛋白质，脱氧核糖，阿拉伯糖和芳香醛等能与二苯胺形成各种各样有色物质，干扰结果。在反应中加入少量乙醛，可以提高反反应灵敏度。

三、试剂与仪器

DNA标准液，二苯胺试剂，样品溶液

试管与试管架，吸管与洗耳球，可见分光光度计

四、DNA标准液曲线的制作与样品DNA含量的测定

1.取8支洁净干燥的试管，按下表操作：

五、实验结果与讨论

由图可知，标准曲线为y=0.0098x，则求出的

X1=40.71µg/ml,X2=39.39µg/ml

平均DNA浓度为40.05µg/ml，含量n%=40.05/100%=40.05%

分析：由实验的标准曲线求得的DNA浓度40.05µg/ml，在40－400µg范围内，光密度与DNA 的浓度成正比，用标准曲线求得的浓度为准确值，另外，由DNA的标准曲线的线性关系R2 = 0.9966，证明DNA光密度的关系密切，则求出的浓度也就比比较精确。但本实验测得的DNA 含量比整体水平偏低，造成的原因可能是：

①在吸取DNA溶液样品时，未充分摇匀，便吸取2.0mlDNA样液，造成DNA含量不均，造成实验存在误差，另外，在加完试剂后，未摇后便至于60度水浴保温，造成二苯胺与DNA的脱水物结合不充分，造成吸光值的偏低，从而造成后续的计算，样品DNA浓度偏低。

②进行分光光度测量时，可能由于比色皿未充分洗涤，有少量自来水的残留，相当于稀释了样品ＤＮＡ浓度，使测得ＤＮＡ吸光值偏低。

③在吸取二苯胺试剂分别加入８支试管时，由于采用了不同试瓶的二苯胺溶液，造成试剂间存在部分差异，导致ＤＮＡ的脱水物结合情况有所差别，影响最后ＤＮＡ吸光值的测定。

六、思考题

１.如何定何判断某些样品是否有核酸？

答：取了４支试管，按下表操作（ml）：

沸水浴中加热１０min

观察试管内颜色变化，若１管变蓝，４管不变，则样品中含ＤＮＡ，若３管变变绿，２管无变化，则样品中含ＲＮＡ，若２，３管不变绿，则样品中不含ＲＮＡ，若样品中不含ＲＮＡ，含１，４管不变蓝，则样品中不含ＤＮＡ。

２.实验中加入乙醛的目的是什么？

答：加入乙醛后，增加了二苯胺在溶液中的溶解度，同时使得ＤＮＡ的显色量加深，便于观察和增加测定对ＤＮＡ含量的灵敏度，另外又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖等的干扰。