蛋白质结晶

1895年，著名的德国物理学家伦琴发现了 X射线； 1912年，德国物理学家劳厄等人发现了X 射线在晶体中的衍射现象，确证了 X射线是一 种电磁波。
1912年，英国物理学家Bragg父子利用X 射线衍射测定了NaCI晶体的结构，从此开创了 X射线晶体结构分析的历史。
X射线的性质
X射线的物理基础
1. X射线是一种电磁波，具有波粒二象性；
Байду номын сангаас
佩鲁茨(Max Ferdinand Perutz)，英国生物化学家。 1947年他与肯德鲁合作，在剑桥创办医学研究理事 会分子生物学组。他们进行血红蛋白的研究，肯德 鲁分工研究肌血红蛋白分子结构，佩鲁茨研究血红 蛋白。因佩鲁茨对球蛋白，特别是血红蛋白的结构 进行X射线衍射分析，而与肯德鲁共获1962年诺贝 尔化学奖。
2. X射线的波长： 10－2 ~ 102 Å 3. X射线的 （ Å）、振动频峰 和传播 速度C（m· s-1）符合
=c/
X射线的性质
X射线的物理基础
4. X射线可看成具有一定能量E、动量P、质 量m的X光流子 E = hv P=h/ h 为普朗克常数，h = 6.62617610-27尔格， 是1900年普朗克在研究黑体辐射时首次引 进，它是微观现象量子特性的表征。
X射线的性质
X射线的物理基础
• X射线具有很高的穿透能力，可以穿过黑纸 及许多对于可见光不透明的物质； • X射线肉眼不能观察到，但可以使照相底片 感光。在通过一些物质时，使物质原子中的 外层电子发生跃迁发出可见光；
• X射线能够杀死生物细胞和组织，人体组织 在受到X射线的辐射时，生理上会产生一定 的反应。
测定方法

他们发展了X射线晶体结构分析技术，通过浸泡把重原子引入到蛋白质中， 然后用同晶置换法解决位相问题，测定了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的空 间精细结构。



原核表达克隆,与表达载体pET21b连接,转化BL21 色谱纯化 charged chelating-Sepharose Fast Flow column RESOURCE S column 浓缩 Centricon-30超 使浓缩蛋白达到低过饱和度结晶
Procedure For protein crystallization
纯化蛋白
色谱法 原核表达 原核表达的蛋白尽量是球形,纯度很高(电泳纯) 并具有活性.
Procedure For protein crystallization

蛋白质浓缩 低温冷冻干燥 超滤 PEG/蔗糖包埋
Procedure For protein crystallization
产生. 因此高浓度的蛋白溶液,通过微调各种因素(如 离子强度, pH值,温度,有机溶剂等)降低目的蛋 白的溶解度, 达到低过饱和度状态,有利于结 晶的产生.
蛋白质结晶技术
微量蒸汽扩散法(浓度增加)
平衡透析法(pH或离子强度) 一批结晶法(沉淀剂) 温度梯度结晶法(温度) 重复结晶法
微 量 蒸 汽 扩 散 法
坐滴法
悬滴法
Procedure For protein crystallization
Crystallography= science+ lucky
X-射线衍射分析
X射线衍射分析
主要内容
• X射线的物理基础
• X射线衍射原理（布拉格方程）
X射线的历史
1 X射线的物理基础
=PQ· （S-So）=0
=
MB+BM = 2dh*k*l*sinhkl = 2dh*k*l*sinnh*nk*nl* = n(N+1)-nN = n ; 2dh*k*l*sinnh*nk*nl* =n
布拉格方程 2d sin =n
衍射级数n=
只有有限几个值
血红蛋白结构模型
近年随着高精密的X射线衍射仪的应用， 使得大分子晶体结构的测定更加方便。
多功能X射线衍射仪（XRD）
能进行高精度的物相定性、定 量分析，晶体结构参数的准确 测定及镶嵌块尺寸、晶格畸变、 宏观内应力的测定和薄膜衍射、 反射实验。高温附件能进行材 料的相变过程研究 。 蛋白质等生物大分子的结构测 定。
X射线的物理基础
X射线的产生
高速运动的电子流
射线
X 射线
在突然被减速时 高能 辐射流
均能产生X射线
中子流
X射线管
X射线的物理基础
图- X射线管示意图
X射线机
X射线的物理基础
图- X射线机的主要线路图
X射线管的工作原理
X射线的物理基础
电子枪：产生电子并将电子束 聚焦，钨丝烧成螺旋式,通以电 流钨丝烧热放出自由电子。 X射线管 金属靶：发射x射线，阳极靶通 常由传热性好熔点较高的 金 属材料制成，如铜、钻、镍、 铁、铝等。
X射线谱
X射线的物理基础
X 射 线 谱
连续谱：
强度随波长连续变化的连续谱。 （见图-6）
特征谱：波长一定、强度很大的特征
谱特征谱只有当管电压超过一定值Vk （激发电压）时才会产生，只取决于光 管的阳极靶材料，不同的靶材具有其特 有的特征谱线。 特征谱线又称为标识谱，即可以来标识 物质元素。（见图-7）
X射线衍射测得多种蛋白质结构


溶菌酶晶体结构（D.菲利普斯，1965） 羧肽酶A晶体结构（W.N.李普斯科姆，1967） PDB数据库中的三维数已达1.5万个，其中蛋白质的比 例为89.4％，X射线晶体衍射法测定的结构目占82.6％。
原理:使某种蛋白质结晶所需盐的浓度与略 低于这种盐浓度的蛋白质溶液在一个封闭 体系内蒸发扩散,最后达到平衡而使蛋白质 溶液内盐浓度增加,蛋白质溶解度降低,达到 过饱和而结晶.
X射线与物质的作用
X射线的物理基础
X射线与物质作用示意图
X射线的物理基础
X射线与物质的作用
X射线通过整个物质厚度的衰减规律：
I/I0 = exp(-L • d)
式中I/I0称为X射线穿透系数， I/I0 ＜1。 I/I0愈小,表示x射线被衰减的程度愈大。
二. X射线衍射原理 布拉格方程 平面点阵组方程:
= xa（S—So）+yb（S—So）+ zc（S—So） 由劳埃方程
nh nk nl
=?


= xh+yk +zl = xnh* +ynk* +znl*
= n(h*x+k*y+l*z) = nN 相同N值面的点阵点到原点有相同光程差
h*、k*、l*点阵面对于h k l 的衍射是等程面 面上任意两点P、Q的光程差都为零，即有 说明了向量(S-So)和面上任意向量PQ互相垂直 h*、k*、l*点阵面对于h k l 的衍射是反射面


血红蛋白结构


血红蛋白主要功能是在血液中结合并转运氧气，存在 于血液红细胞中。 血红蛋白是由四条多肽链组成的──二条α链(每条α链 含141个氨基酸残基)和二条β链(每条β链含146个氨基 酸残基)。血红蛋白α链和β链的三级结构和肌红蛋白 链的三级结构非常相似。 每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保 护血红素分子不与水接触，Fe2+不被氧化。Fe2+位 于血红素卟啉环的中央，与卟啉环的4个吡咯基、O2 及多肽链上的组氨酸形成六配位体。

1960年J. C. Kendrew和M. F. Perutz用X-射线衍射分 析方法测定肌红蛋白和血红蛋白晶体结构，获得1962年 的诺贝尔化学奖 。
肯德鲁(John Cowdery Kendrew)，英国生物化 学家，1917年3月24日生于英国牛津。肯德鲁用 特殊的X射线衍射技术及电子计算机技术描述了 肌球蛋白螺旋结构中氨基酸单位的排列。他与佩 鲁茨共同研究了X.射线衍射晶体照相术，还分工 合作研究蛋白质和核酸的结构与功能。肯德鲁因 测定了肌球蛋白的结构，而与佩鲁茨共获1962 年诺贝尔化学奖，时年45岁。
肌红蛋白结构

肌红蛋白是哺乳动物肌细胞贮存和分配氧的蛋白质，分子量较小， 是由153个氨基酸残基组成的一条多肽链组成的，含有一个血红 素辅基。 肌红蛋白分子呈扁平的菱形，分子中多肽主链由长短不等的8段 直的a-螺旋组成，最长的螺旋23个残基，最短的7个残基。 肌红蛋白的内部几乎都是由疏水氨基酸残基组成的，而表面既含 有亲水的氨基酸残基，也含有疏水的氨基酸残基。血红素辅基处 于一个由蛋白部分形成的疏水的、象个笼子似的裂隙内，血红素 中的铁原子是氧结合部位。无氧的肌红蛋白称之脱氧肌红蛋白， 而载氧的分子称之氧合肌红蛋白。
晶胞参数与晶面间距d的关系:
正交晶系, = = = 90o
dh*k*l*=
立方晶系 a = b = c dh*k*l* =
布拉格方程和劳埃方程一
样能决定衍射方向与晶胞 大小和形状的关系
X射线衍射法测定蛋白质结构
—肌红蛋白和血红蛋白结构测定
X射线衍射技术对分子生物学的两大贡献

1953年J. D. Watson和F. H. C. Crick根据Rosalind Franklin X-射线衍射实验建立了脱氧核糖核酸 (DNA) 的 双螺旋结构 ，获得1962年的诺贝尔生理学和医学奖 。
连续X射线谱
图-
X射线的物理基础
各管电压下W的连续谱
X射线的物理基础
连续X射线谱
X射线连续谱的强度随着X射线管的管电
压增加而增大，最大强度所对应的波长
max变小，最短波长界限0减小；
连续谱中接近最短波长处的辐射较多。
原子结构壳层理论
X射线的物理基础
高能电子撞击阳极靶时，会将阳极物 质原子中 K 层电子撞出电子壳层，在 K 壳 层中形成空位，原子系统能量升高，使体 系处于不稳定的激发态，按能量最低原理， L、M、N一层中的电子会跃人 K层的空位， 为保持体系能量平衡，在跃迁的同时，这 些电子会将多余的能量以 X 射线光量子的 形式释放。
蛋白质结晶及X射线衍射分析
Why Crystal?
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the protein structure X-ray diffraction: 0.5 - 2 Å NMR: 2-3 Å Immobilize protein, enhance weak signal from scattering, maintain protein activity.
X射线与物质的作用
X射线的物理基础
产生物理、化学和生化作用，引起各种效应， 如： • 使一些物质发出可见的荧光； • 使离子固体发出黄褐色或紫色的光； • 破坏物质的化学键，使新键形成，促进物质的 合成
• 引起生物效应，导致新陈代谢发生变化；
• x射线与物质之间的物理作用，可分为X射线 散射和吸收。
同晶置换法：isomorphous replacement 利用引入局部置换重原子的衍生物晶体与原母体晶体间形成的同晶对在 结构上的高度相似性(具有相同的空间群、相近的晶胞参数，基本相同的 蛋白构象)及利用重原子在决定结构因子位相上的主导作用，结合同晶对 的二套衍射实验数据进行结构解析。若以多对同晶进行结构解析，则称 作多对同晶置换法。
蛋白质结晶
蛋白质结晶是一个有序化过程:即蛋白质由在溶液中 随机状态转变成有规则排列状态的固体. 当蛋白质溶液达到过饱和状态,能够形成一定大小的 晶核,溶液中的分子失去自由运动的能量(平移,旋转 等) ,不断地结合到形成的晶核上而长成适合X衍射 分析的晶体.

蛋白质结晶
蛋白质结晶往往在高浓度,低过饱和度情况下
h*、k*、l*为晶面指标
h*x + k*y + l*z = N
N为整数
x，y，z为面上点阵点在a、b、c方向的坐标 通过坐标原点的平面对应N = 0,相邻的面N值相差±1。
对于 k、h、l（h = nh*，k = nk*，l = nl*）衍射，N 平面上任一点P（x，y，z）与原点的光程差是: =OP· （S—So）=（xa + yb + zc）· （S — So）