第十四章 基因工程菌发酵
基因工程菌发酵
成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
（4）溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。 好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若 能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。 发酵时，随DO2浓度的下降，细胞生长减慢，ST值下 降，发酵后期下降幅度更大。 外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼 吸作用，提高对氧的需求。 维持较高的DO2值，才能提高工程菌的生长，利于外 源蛋白产物的形成。 采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供 给，提高活菌产量。
原核:包涵体,分泌型
真核:穿梭质粒
质粒(plasmid) 载体 粘粒(cosmid) λ噬菌体(λ phage)
细菌：氯化钙；电穿孔;
细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V
动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V 核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。
DNA接头连接法
（三）目的基因导入受体细胞
（四）转化细胞的筛选及表达产物的鉴定
1、重组体的筛选 2、表达产物的鉴定
α 互 补 的 检 测
二、基因工程菌的发酵
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目
标产物，工程菌和常规微生物并无太多的 差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产 过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的 特点。
（一）质粒的稳定性
1、质粒不稳定的类型
• 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程 中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质 粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发 生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化
基因工程菌发酵制药工艺
工程菌发酵制药
表达系统
一、大肠杆菌表达系统
大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征
G－，单细胞，杆状。裂殖，37℃17分钟繁殖一 代。白色至黄白色的菌落，光滑，直径2－3mm。
鞭毛，较长。无芽孢，一般无荚膜。
工程菌发酵制药
传统的重组技术
载体
酶切反应
目标基因
连接反应
转化
可连接的末端 重组分子
重组子
1、DNA片段的酶切
❖ 限制性内切酶催化双链DNA分子断裂，形成相 应的片段。
❖ 反应体系组成：双链DNA、限制性内切酶、缓 冲液组成
❖ 反应条件：一般在37℃反应1小时。
2、DNA片段的连接
❖DNA连接酶催化两条断开的DNA双链分子， 形成 3,5-磷酸二酯键，得到重组DNA分子。 ❖反应体系组成：2个DNA片段（具有可连接 的末端）、连接酶、缓冲液 ❖条件：一般在10－26℃下，反应0.5-8小时
样品池
传感
热敏元件
热泵
温控系统
热池
仪器构造：三传感器， 双区域温度--温度梯度
计算机芯片控 制过程参数
2、PCR仪，热循环仪
The PCRJet from MegaBase gives fast PCR with large samples.
More reactions in the same space with 1,536 wells
孢子萌发形成菌丝，生长分枝形成初级菌丝体，不 同性别菌丝体接合形成次级菌丝体，二倍体细胞。
黑霉
青霉
工程菌发酵制药
表达系统
载体研究
用天然质粒作为载体只成功了少数几例。
基因工程菌发酵操作流程
基因工程菌发酵操作流程1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。
8.种子罐培养基温度、PH(需进一步校准)、罐压、消泡达到发酵条件。
通知菌种室准备菌种转接。
9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。
10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消泡。
11.大罐基础培养基领料及配制。
12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。
13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。
14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、补料管道、碱罐及碱管道上段的灭菌。
15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。
连接补料瓶调节至发酵条件。
16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子罐。
17.利用压力差将种子罐里的种子液移接到大罐。
18.补碱时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，控制流量。
19.补料罐补料培养基的领料定容配制。
20.补料罐补料培养基在位灭菌，同时对管道上段灭菌。
21.补料时，将管道上阀门打开。
程序设为自动，设置流量。
22.诱导剂领料，在配料罐中加水配制定容。
23.将诱导剂打入种子罐，灭菌后保持罐压。
24.利用压力差将种子罐里的诱导剂移接到大罐。
25.一段时间后，大罐的PH、DO呈上升形态即为发酵结束，可放罐离心。
芽孢杆菌发酵操作流程1.检查发酵车间是否达到发酵要求(所以设备处于待用状态)。
2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。
3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。
4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。
5.种子罐进料，调PH。
6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵
第十三章基因工程菌的发酵近年来，重组DN双术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。
它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症一一癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。
现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、十扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。
但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程(genetic engineering )是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。
基因工程的核心技术是DNA勺重组技术。
重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DN"子，然后在将重组DN"子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
除DN济组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。
基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DN"段，这种DN隔段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病蠹DN础接成重组DNR三是把重组DN闻|入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
DNA分子很小，其直径只有20埃，约相当于五白万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。
制药工艺学国家精品课习题
10-12 发酵过程中温度和搅拌有何影响，如何控制？ 10-13 发酵过程中 pH 和溶氧有何影响，控制策略有哪些？为什么？ 10-14 分析发酵中泡沫形成的原因及其对发酵的影响，提出消沫措施和方式。 10-15 微生物发酵制药的基本过程是什么?各阶段的主要任务是什么？ 10-16 如何确定发酵终点？如何实现发酵过程的最优化控制？
第八章 8-1 路线 1 与路线 2 有哪些不同？ 8-2 在制备氢化可的松过程中，哪些步骤采用化学合成，哪些为生物法？ 8-3 制备氢化可的松哪步采用 Oppenauer 氧化反应，其机理是什么？ 8-4 制备 17α-羟基黄体酮时，氢解除溴为什么要加入吡啶？ 8-5 制备氢化可的松中可能产生的“三废”是什么？
第二章 2-1 工艺路线设计有几种方法，各有何特点？如何应用？ 2-2 工艺路线评价的标准是什么？为什么？ 2-3 如何进行工艺路线的选择？
第三章 3-1 化学合成药物工艺研究的的主要内容是什么？ 3-2 分析影响反应的各种条件与工艺之间的关系是什么？ 哪些反应条件需要进行极限试 验？为什么？ 3-3 合成工序的确定一般在哪个阶段？对于整个生产过程具有什么重要意义？ 3-4 单分子反应、双分子反应、一级反应、二级反应之间的关系？ 3-5 比较重结晶的溶剂要求与普通反应溶剂的异同点？ 3-6 化学反应中不符合 Van’tHoff 经验规则具有哪些情况？ 3-7 冠醚类属于哪种催化剂，其最适合哪类反应？除此以外，还有哪些催化剂也具有类似的
基因工程菌发酵
基因工程菌发酵、表达与纯化
一、原理
基因工程菌是利用基因重组技术构建的生物工程菌，带外源基因的重组载体，通过生物工程菌的发酵获得大量的外源基因产物,并尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染，所以需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出一套适于外源基因高效表达的发酵、表达和纯化工艺。
二、仪器
发酵罐、SDS-PAGE电泳仪
三、试剂
LB培养基（包括Yeast Extract、Polypeptone等）、琼脂、甘油
四、实验步骤
1. 在LB 培养基中加入细菌培养用琼脂(15 g/L ) 铺平皿, 用接种环划线接种甘油管基因工程菌菌种, 30℃培养过夜；
2. 挑取单菌落接种于含5 m l LB (含50ug/mL Amp ) 的试管中, 30℃、120 rpm摇菌培养到OD600 为0.2-0.8；
3. 取1 mL于另一试管中42℃培养3 小时, 离心收集菌体；
4. 以10%的接种量上发酵罐发酵培养；
5. 接种LB培养液诱导表达，采用SDS-PAGE电泳分析其表达量；
6. 据基因工程菌表达产物的不同采用不同的分离纯化方法，如盐析、层析、萃取等。
五、注意事项
在基因工程菌的发酵过程中，培养基的种类、pH值、培养的温度及接种量和发酵时间都会对其发酵效果及表达产物的分离纯化产生不同的影响，所以应多次试验进行全方面的优化。
生物思考题
第八章发酵过程1，发酵过程的定义2，为何要研究发酵过程3，发酵过程的主要控制参数主要分为哪三大类4，发酵过程中通常测定的参数有哪些5，发酵过程中参数测定的方法有哪两种6，简述发酵过程的代谢变化规律。
为什么要了解这一规律。
7，分批发酵、补料分批发酵和连续发酵的定义。
对这三种发酵方式进行比较。
8，按照产物生成与菌体生长是否同步，可将分批发酵分为哪两种类型，并用公式进行表述。
这种分类方法对实际生产有何指导意义9，代谢变化、代谢曲线10，温度对发酵过程有何影响？11，pH值对发酵过程有何影响？12，简述发酵过程中引起pH下降和上升的因素13，发酵过程中pH的控制方式。
14，发酵过程中泡沫产生的原因15，发酵过程中泡沫的产生有何不利的影响16，在发酵过程中影响泡沫稳定性的因素有哪些17，发酵过程中泡沫控制的方法。
18，化学消泡的机理。
19，发酵过程中补料控制的目的，所补的物料包括哪些类型，补料的原则及控制策略20，临界氧浓度21，请叙述发酵过程中溶解氧的一般变化规律。
22，二氧化碳对发酵的影响及其机理，发酵过程如何控制二氧化碳23，发酵过程的基本自控系统包括哪些24，发酵动力学的定义，研究发酵动力学的目的。
25，研究发酵动力学方法有哪两种？26，简述Monod方程与米氏方程的区别与联系。
根据实验结果计算Monod方程的参数27，恒化器和恒浊器的定义。
28，在连续培养过程中，其实际结果为何会和理论推导的结果发生偏差29，宏观产率系数30，理论代谢产物产率的计算31，分批发酵、补料分批发酵和连续发酵动力学方程的推导32，研究连续培养动力学有何用途第九章厌氧发酵设备1、酒精发酵设备的基本要求2、酒精发酵罐的冷却装置有哪三种形式？3、微生物在厌氧发酵过程中总的发酵热4、酒精发酵罐罐数的计算5、啤酒圆筒体锥底发酵罐的优缺点第十章通风发酵设备1，常用的通风发酵罐有哪几种类型2，机械搅拌发酵罐的基本要求3，机械搅拌发酵罐的搅拌器的作用和种类4，挡板的作用5，全挡板条件6，消泡器的作用和种类7，发酵罐上常用的轴封有哪两种，比较其优缺点8，机械搅拌发酵罐的冷却装置有哪三种？各适用于什么场合？比较其优缺点？9，自吸式发酵罐的充气原理10，气升式发酵罐的工作（充气）原理11，搅拌器的轴功率12，影响搅拌器输入搅拌液体的功率的因素13，功率准数14，根据功率准数所表征的意义推导下式15，机械搅拌发酵罐主要由哪三个部分组成及各自的作用16，根据产品的年产量计算所需发酵罐的数量，并计算发酵罐的结构尺寸17，了解机械搅拌发酵罐的结构18，空气中的氧进入到细胞中要经过哪些步骤19，根据氧的传质方程，请叙述影响氧传递的因素。
第十四章 固定化细胞发酵详解
三、固定化细胞的缺点 1. 仅能利用胞内酶； 2. 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用； 3. 载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性； 4. 可能有副反应。
四、固定化细胞的分类 1. 按固定的细胞类型 （1）微生物 （2）动物 （3）植物
2. 按细胞的生理状态
（1）死细胞：包括完整细胞、细胞碎片、细胞器。 适用于一种酶催化的反应。
第十四章 固定化细胞发酵
第一节 概述
一、定义
固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受 到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内， 但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用 的活力。
二、固定化细胞的优点 1. 与游离细胞相比 （1）固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应； （2）可以获得更高的细胞浓度； （3）细胞可以重复使用；
1. 细胞再循环系统
2. 固定床反应器
3. 流化床反应器
4. 絮凝细胞系统
第五节 固定化细胞的应用
一、抗生素的生产 二、有机酸的生产 三、氨基酸的生产
四、酶制剂的生产 五、生物转化
六、废水处理 1. 处理氨、氮废水 2. 含酚废水 3. 含芳香烃废水 4. 处理重金属废水
二、共价结合法
利用细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、 巯基、咪唑基）与活化的无机或有机载体反应，形 成共价键将细胞固定。
用该法制备的固定化细胞一般为死细胞。
三、交联法
利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团 （如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）反应，从 而使细胞固定。
常用的交联剂包括：戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双 重氮联苯胺。
四、包埋法
包埋法是细胞固定化最常用的方法
包埋法可以分为：
1. 微胶囊法：利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起 来，形成微型胶囊；
《基因工程菌发酵》PPT课件
整理ppt
12
分批培养中选择不同的碳源，连 续培养中控制稀释速率等都能一定范 围内控制菌体的生长，从而控制乙酸 的产生，减少它的抑制作用。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减 少乙酸的产生。
整理ppt
13
大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长 速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为 宿组主细胞，阻止乙酸产生，可提 高产量。
整理ppt
17
它的浓度增加会导致在合成mRNA和 rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生 停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的 RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动 子如rrnA等的转录减少。
也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶 与PL启动子专一识别反应。
整理ppt
18
第七节基因工程菌发酵
基因工程菌的培养过程包括: ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基 础条件,如温度、pH、培养基各种组分、 碳氧比，分析表达产物的合成、积累 对受体细胞的影响; ⑵通过培养罐操作确定培养参数和控 制方案以及顺序。
高拷贝质粒的工程菌（240拷贝） 中，生长速率和菌体总蛋白合成均减 少。这与工程菌大量前体被利用引起 前体不足，从而产生“严紧反应”有 关。
整理ppt
16
“严紧反应”是当氨酰tRNA不 足时,核糖体在密码子上停留,并合 成被称为魔点的ppGpp的结果。
ppGpp是一个重要的调控分子。 它通过影响RNA链的延深过程减少 转录。
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
整理ppt
32
发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
基因工程大肠杆菌发酵的研究ppt课件
• •
•
•
• •
•
• • •
Hale Waihona Puke 生产型发酵罐： 夹套：设计压力0.3 Mpa，夹套材质： 304不锈钢，用于温控、辅助灭菌；采 用优化导流设计，提高了交换效率和罐 内温度的均匀性； 进气过滤：采用一路深层通气质量流量 计显示，采用精度为0.2μm的进口除菌 过滤器，配空气分布器，防倒流装置； 确保安全并可独立灭菌，大大延长使用 寿命； 电机：采用德国汉森公司的调速电机 （加强型冷却装置，确保电机能在恶劣 的环境中长期运行）； 调 速 器：日本变频调速器 专用无菌取样阀：在位灭菌、微量取样 不染菌，无死角，不积料，使用方便； 专用无菌放料阀：在位灭菌、材质特制， 可无杂菌放料，无死角，不积料，使用 方便； 灭菌：蒸汽在位灭菌。设置灭菌程序， 灭菌温度100-130℃； 移种：316L不锈钢光亮管，隔膜阀。 在位灭菌； 控制系统： 德国西门子PLC控制核心+ 工业平板电脑；
生物工程下游技术
• 一、什么叫生物工程下游技术？其主要研 究那些内容？ 下游技术指的是生物工程技术具体的工 业实现方面的技术开发。 例如生物工程菌的发酵技术、发酵菌的 代谢产物中目标产品的分离提取技术、工 艺过程中的质量控制技术、质量控制标准 的研究和相关的分析技术等。
• 二、生物工程下游技术的必要性 近年来，不少基因工程药物、疫苗、 酶制剂及某些检测试剂，如人（牛、猪） 生长激素、α-（β-，γ-）干扰素、链激酶、 凝乳酶、葡激酶、白细胞介素、人胰岛素、 肿瘤坏死因子、表皮生长因子、心房肽、 降钙素、仔猪腹泻疫苗、C-型肝炎检测试 剂等都是应用基因工程大肠苗菌进行生产 的。
基因工程大肠杆菌发酵的研究
• 一、什么是基因工程菌？ • 二、为什么要制备基因工程菌？ • 三、生物工程下游技术
《基因工程菌发酵》课件
通过将目标基因插入宿主菌株的染色体，实现对目标基因的表达和调控。
2
发酵过程
利用菌株进行发酵过程，通过代谢产物合成目标化合物。
3
纯化和提取
通过有效的纯化和提取技术，获取目标化合物的高纯度。
基因工程菌发酵的优势
1 高效
菌体能够高效合成目标化合物，提高生产效率。
2 可控
通过基因调控和发酵条件优化，可以精确控制产品成分和质量。
总结和展望
基因工程菌发酵是一项具有广泛应用和巨大潜力的技术，将在医药、工业、 环境和农业等领域继续发展和创新。
《基因工程菌发酵》PPT课件
通过深入浅出的解释和精美的图片，本课件将详细介绍基因工程菌发酵的背 景、原理、应用领域以及发展前景。
背景介绍
基因工程菌发酵是一种重要的生物工艺技术，利用基因工程手段改造菌株， 通过发酵生产目标物质。
基因工程菌发酵的定义
基因工程菌发酵是指利用重组DNA技术构建具有特定基因组的菌株，并通过 菌体生物代谢过程来合成目标化合物的过程。
3 环保
利用菌株的生物降解能力，减少废弃物产生和环境污染。
基因工程菌发酵的发展前景
创新性
基因工程菌发酵将会不断结合新 技术和新领域，推动科技创新。
研究和发展
越来越多的研究机构和企业投入 基因工程菌发酵领域的研究和开 发。
生物技术发展
基因工程菌发酵是生物技术发展 的重要方向之一，有着广阔的应 用前景。
基因工程菌发酵的应用领域
制药业
利用基因工程菌发酵生产药物，提高药物生产 效率和纯度。
环境治理
利用基因工程菌发酵进行废水处理和有机废弃 物降解。
工领域
利用基因工程菌发酵生产化工原料和生化产品， 替代传统化工合成过程。
第十四章 基因工程菌发酵
对于底物
对于产物
dS 1 dX 1 dX dt Y dt Y dt
dP dX X dt dt
第四节 培养装置与产物的提取
• 工程菌的培养与普通微生物的培养方法
类似。在进行以工业化为目的的DNA重 组实验，以及为生产异种基因产物而培 养重组菌时，当然应采用简便易行的培 养系统。现在多半使用大肠杆菌为宿主， 而在一般的通气搅拌罐中大肠杆菌能生 长良好。
• 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以
防止传染给实验人员和向外界扩散。实 验规模在20L以下时，物理密封由密封设 施、实验室设计和实验注意事项组成。 密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字 越大，密封水平越高。 • 生物学密封要求用只有在特殊培养条件 下才能生存的宿主，同时用不能转移至 其它活细胞的载体，通过这样组合的宿 主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。 按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要 求最严格。
第十四章 基因工程菌的发酵
第一节 工程菌的来源和应用
一、何谓基因工程 • 基因工程（genetic engineering）是指在 基因水平上，采用与工程设计十分类似 的方法，根据人们的意愿，主要是在体 外进行基因切割、拼接和重新组合，再 转入生物体内，产生出人们所期望的产 物，或创造出具有新的遗传特征的生物 类型，并能使之稳定地遗传给后代。
5，接种
• 向罐内直接接种的方法是不安全的。简
单的安全接种法是将种子瓶与培养罐以 管相连接后，用无菌空气加压压入的方 法。另一种方法是先把种子液在安全柜 内移至供接种用的小罐内，再将其与培 养罐连接，用蒸汽对连接部分灭菌后， 把种子罐中的种子液接入培养罐内。
6，排液
• 培养后要将培养液输送至贮罐等下一道
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2，其它发酵产品 • 酶制剂 • 氨基酸（苏氨酸、色氨酸分离、纯化
目标产物，工程菌和常规微生物并无太 多的差异。但工程菌在保存过程中及发 酵生产过程中表现出不稳定性，以及安 全性等问题，使得工程菌的培养有着自 身所特有的特点。
一、安全问题
第三节工程菌分批培养动力学
对于质粒脱落性不稳定，细胞在分裂时 丢失质粒的概率为p， 则
dX S m (1 p ) X dt KS S dX S S m X m pX dt KS S KS S
所以
dX m X m X p dX (1 p) m X
• 基因工程一般分为4个步骤： 取得符合人们要求的DNA片段，这种
DNA片段被称为“目的基因”； 将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重 组DNA； 把重组DNA引人某种细胞； 把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
二、工程菌的获得
• 确定目的产物。 • 找出产该产物的细胞。 • 将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使
• 基因工程的核心技术是DNA的重组技术。 • 重组即利用供体生物的遗传物质或人工
合成的基因，经过体外或离体的限制酶 切割后与适当的载体连接起来形成重组 DNA分子，然后在将重组DNA分子导入 到受体细胞或受体生物构建转基因生物， 该种生物就可以按人类事先设计好的蓝 图表现出另外一种生物的某种性状。 • 除DNA重组技术外，基因工程还应包括 基因的表达技术，基因的突变技术，基 因的导入技术等。
• 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以
防止传染给实验人员和向外界扩散。实 验规模在20L以下时，物理密封由密封设 施、实验室设计和实验注意事项组成。 密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字 越大，密封水平越高。 • 生物学密封要求用只有在特殊培养条件 下才能生存的宿主，同时用不能转移至 其它活细胞的载体，通过这样组合的宿 主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。 按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要 求最严格。
3，取样
• 普通培养罐的取样管道在取样时会流出样品。
取样后对样品管道灭菌时，未灭菌的培养液 污水被排至排水管内。对此，必须采取措施， 如用取样工具进行取样。此法可在培养液不 接触外界的条件下取样。
4，培养后的灭菌
• 培养后对培养液和管道等进行灭菌时，
一开始流出的末灭菌排水有可能存在活 的重组菌。取样、排液的管道中能产生 这类排水，因此，一定要另行安装排水 管并与废液灭菌贮槽等相连接，以便排 放污水。
5，接种
• 向罐内直接接种的方法是不安全的。简
单的安全接种法是将种子瓶与培养罐以 管相连接后，用无菌空气加压压入的方 法。另一种方法是先把种子液在安全柜 内移至供接种用的小罐内，再将其与培 养罐连接，用蒸汽对连接部分灭菌后， 把种子罐中的种子液接入培养罐内。
6，排液
• 培养后要将培养液输送至贮罐等下一道
三、工程菌应具备的条件
• 发酵产品是高浓度、高转化率和高产率
的，同时是分泌型菌株。 菌株能利用常用的碳源，并可进行连续 发酵。 菌株不是致病株，也不产内毒素。 代谢控制容易进行。 能进行适当的DNA重组，并且稳定，重 组的DNA不易脱落。
• • • •
四、工程菌的应用
1，基因药物 • 红细胞生成素 • 胰岛素 • 干优素 • 乙肝疫苗 • 生长激素 • 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信 息。 • 利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的 基因。 • 将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了 重组DNA分子。 • 将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选 择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标 记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。
一、培养罐
• 作为基因重组体的培养装置，与一直沿用的通
气搅拌培养罐要有区别，即不仅要防止外部微 生物侵入罐内，还必须采用不使培养物外漏的 培养装置。按实验准则，可把这类密闭型通气 搅拌式培养罐划分为操作液量20L以上和20L以 下两种。 • 现今使用的微生物培养装置，按其灭菌法又可 分两类。
– 一是在高压灭菌器中进行培养基及培养罐的灭菌， 罐本身通常是玻璃制的，容量在10L以下的居多； – 另一类是20L以上的培养罐，一般为不锈钢制品， 多采用通新鲜蒸气进行灭菌。
• 关于基因工程的社会问题，必须提到它
的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一 旦用于工业化生产，就不可避免地进入 自然界。这些菌能间接地危害人体健康， 使治疗药物失去效用，污染环境等。因 此，安全问题是极其重要的。
• 1974年，提出了DNA重组实验具有潜在
生物危险性的问题。后来，制定了有关 DNA重组实验的准则，其目的是保证实 验的安全和推动重组DNA的研究。 • 这些准则参照了防止病原微生物污染的 措施，以及根据对实验安全度的评定， 采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和 B2)两种方法。
• 另外，对于基因工程产品，还应注意生物安全
(biosafety)问题，即要防止菌体扩散，特别对前 面几步操作，一般要求在密封的环境下操作。 例如用密封操作的离心机进行菌体分离时，整 个机器处在密闭状态，在排气口装有一无菌过 滤器，同时有一根空气回路以帮助平衡在排放 固体时系统的压力，无菌过滤器用来排放过量 的气体和空气，但不会使微生物排放到系统外。
（3）使质粒稳定的措施
• 组建合适载体 • 选择适当宿主 • 施加选择压力
– 抗生素添加法 – 抗生素依赖变异法 – 营养缺陷型法
• 控制基因过量表达 • 控制培养条件
（4）质粒保持率
• 为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持
率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂 n次后，培养液中基因工程细胞数与总细 胞数的比值，即
四、基因工程产品的提取和精制
• 传统的发酵产品和基因工程产品在提取
和精制上的不同，主要表现在下列两方 面：
– 传统发酵产品多为小分子(工业用酶除外， 但它们对纯度要求不高，提取方法较简单)， 其理化性能，如平衡关系等数据都已知，因 此放大比较有根据；相反，基因工程产品都 是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。 – 基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将 细胞破碎，增添了很多困难。
二、工程菌外漏的防范
• 首先应了解培养微生物在普通通气搅拌罐中可
能发生外漏的部位和操作。归纳起来有： 排气， 机械密封， 接种， 取样， 培养后的灭菌(通入湿热蒸气)， 排液(输至下一工序)。
1，排气
2，机械密封
• 考虑培养液外漏的情况，培养基因工程
菌时，以用上部搅拌的双机械密封为好。
二、工程菌培养的特点
• 工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验
室培养规模为低。 • 为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施， 提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表 达产物自细胞内向细胞外分泌。 • 工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种 氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细 胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。 在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其 浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代 谢物，以保证细胞正常生长。
工序，这时也有可能产生气溶胶和重组 菌的扩散。安全的方法是在培养开始前 就将排液口与下段工序相连接并进行灭 菌，这样培养一结束即可直接输送培养 液。如果排液口未与下段工序相连那就 应与连结废液灭菌罐的排水管道相接， 这样就安全了。
三、培养罐的管道布局
• 下图表示重组菌培养罐(P2、P3级)的整体
流程图。重组菌培养罐中，凡有可能外 漏重组菌的部分都与排污管道相连。图 中所示的管路能分离并排出污染重组菌 的污水。
（1）质粒不稳定的类型 • 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过 程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整 个质粒丢失。 • 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排引起的质粒结构 变化。
（2）影响质粒稳定的因素
• 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身
对其稳定性的影响 • 宿主对质粒稳定的影响 • 质粒拷贝数 • 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响
• 假定在分批培养过程中，细胞在对数生
长期每次分裂时，其质粒丢失率为P，则 Fn为
3，表达效率及质粒拷贝数控制
• 在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数
有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞 内质粒拷贝数。 • 在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同 阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的， 在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此 时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养 中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产 量提高。
第十四章 基因工程菌的发酵
第一节 工程菌的来源和应用
一、何谓基因工程 • 基因工程（genetic engineering）是指在 基因水平上，采用与工程设计十分类似 的方法，根据人们的意愿，主要是在体 外进行基因切割、拼接和重新组合，再 转入生物体内，产生出人们所期望的产 物，或创造出具有新的遗传特征的生物 类型，并能使之稳定地遗传给后代。
对于底物
对于产物
dS 1 dX 1 dX dt Y dt Y dt
dP dX X dt dt
第四节 培养装置与产物的提取
• 工程菌的培养与普通微生物的培养方法
类似。在进行以工业化为目的的DNA重 组实验，以及为生产异种基因产物而培 养重组菌时，当然应采用简便易行的培 养系统。现在多半使用大肠杆菌为宿主， 而在一般的通气搅拌罐中大肠杆菌能生 长良好。
三、工程菌的培养
• 工程菌的营养控制 • 质粒稳定性 • 重组质粒拷贝数的控制及表达效率
1，底物浓度的控制
• 在基因工程茵培养过程，至少要遵循PI级
物理防护的规定，因此必需进行菌体的 高密度培养。 • 从生物安全性考虑，培养的基因工程菌 通常是维生素或氨基酸的营养缺陷型突 变株。
2，质粒稳定性