第十一章 荧光分析法
第十一章 荧光分析方法
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
6
激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
23
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
24
31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
32
光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
第十一章荧光分析法解析
1. 长共轭结构
能产生荧光的物质大都含有芳香环或杂环，或是长 共轭双键的脂肪烃
共轭效应增大了荧光物质的摩尔吸收系数，有利于 产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的产生
苯
lex 205nm lem 278nm
0.11
萘
lex 286nm lem 321nm
0.29
蒽
lex 356nm lem 404nm
内部能量转换 当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。 （振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
（2）溶液温度降低通常会使荧光效率 。 （3）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度 。 （4）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（ ）
A. 苯 B. 联苯 C. 萘 D. 芴 E.蒽 （5）下列说法中正确的是（ ）
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
3. 酸度
每一种荧光物质都有其最适宜的pH范围
S
O
3
- H+
S
O
3
p H = 6 .4 ~ 7 .4 OH
O-
无荧光
蓝色荧光
+ H+ p H = 4.8 ~3.4 NH2
蓝色荧光
N H 3+ 无荧光
苯胺在（ C）条件下荧光强度最强 A. pH=1 B. pH=3 C. pH=10 D. pH=13
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
分析化学第11章--荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
第11章荧光分析法(1)
荧光的产生与分子结构的关系
分子产生荧光必须具备的条件
1. 具有强的可见紫外吸收(长共轭分子） 2. 具有一定的荧光效率（f）（刚性平面分子）
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
ห้องสมุดไป่ตู้
长共轭结构
苯
lex 205nm lem 278nm f 0.11
萘 286nm 321nm 0.29
蒽 356nm 404nm 0.36
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光 体系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s， 第一激发三重态的最低振动能级→基态
激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
a
b
a：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光 b：0.1mol/L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光
溶液的荧光测定
入射光 I0
透射光 I
荧光 F
定量依据
荧光强度 F正比于吸收的光强度Ia 和荧光量子效率 ：
F = K’Ia 由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10-cl ) F = K’ I0(1-10-cl ) = K’ I0(1-e-2.3cl ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：
4.荧光熄灭剂：重金属离子、卤素离子、 氧分子、硝基化合物、重氮化合物、 羰基和羧基化合物。 5.散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响。 瑞利光（Reyleigh scattering light) 拉曼光(Raman scattering light) 波长比入射光更长的拉曼光 ，对荧光测定的 干扰更大。
第11章荧光分析法2012
顺式：非平面构型
反式：平面构型 强荧光体
非荧光体
40
• 3．取代基的影响：
• 第一类：-OH、-NH2、-OCH3等能增 加分子的π电子共轭程度，
f
化合物
↑，λem长移。
苯 苯酚 苯胺 苯基氰 苯甲醚
285~345 278~310 285~365 310~405 280~390
λ emmax (nm)
固定 ex 激发光波长
4800
4400
4000
3600
3200
2800
2400
2000
1600
1200 800 400
获得方法：先把第一单 色器的波长固定，使激 发的ex不变，改变第二 单色器波长，让不同波 长的光扫描，测定它的 发光强度，以I 为纵坐 标， em为横坐标得左 图，即荧光物质的发射 光谱
•
2. 比例法 在线性范围可选用比例定量法。
Fs F0 Fs F0 C s Cs 或 Cx Fx F0 Fx F0 C x
51
• •
3. 联立方程式法 对混合物在不同波长处，测F，利用F 的加合性联立方程求解。
52
第三节 荧光分光光度计和荧光分析新技术 • 一、荧光分光光度计 1.荧光光度计的主要部件
相对荧光强度
10
18
20
20
20
41
• 第二类：-NO2、-COOH、X-等吸电 子基团——减弱荧光。 • 第三类：-R、-SO3H——影响不大。
42
什么样的物质可以产生荧光呢？
• 两个条件： • 一、有强的紫外—可见吸收 • 二、有高的荧光效率 • 分子的长共轭或刚性共平面结构具有 高的荧光效率。
荧光分析法.ppt
或
续前
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11.2.2
激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
&激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex &荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
激发光谱：（与吸收光谱类似）表示不同激发波长的辐射引起
激发光谱 激发光谱
荧光光谱 荧光光谱
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5、磷光（phosporescence）
过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的 任一振动能级而发射的光量子为磷光 特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三 重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约
为10-4～10 s。
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时
间约10-12秒。
或
返回
续前
2、内部能量转换（internal conversion)
过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠
时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换 特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
结果：这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。
续前 影响体系间跨越几率增大的因素：
Ø含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。
原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运
动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反
转的发生。 Ø在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体
系间跨越的发生几率。
返回
注：
发射磷光的能量比荧光的能量小
第11章-荧光分析法-m
荧光分析法的基本原理
分子结构与荧光的关系
化合物的结构与荧光 • 跃迁类型
－π*→π 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数 小，有利于荧光的产生。
»π→π∗跃迁有较大的摩尔吸光系数，荧光效率高。 (一般比n→π∗大100~1000倍） »π→π∗跃迁的寿命短，约10-7~10-9s，有利于荧光发射 （n→π∗跃迁的寿命约10-5~10-7s） »在π∗→π跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率 常数也较小(S1→T1能级差较大)，有利于荧光发射。
蓝色荧光
无荧光
荧光分析法的基本原理
影响荧光强度的因素
⑤荧光猝灭（熄灭）的影响
• 荧光猝灭 –荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用引起 荧光强度降低或荧光强度与浓度偏离线性关系的现象 • 荧光猝灭剂 –引起荧光猝灭的物质 例：重金属离子、卤素离子、氧分子、硝基化合物、 重氮化合物、羰基和羧基化合物。 • 荧光猝灭的形式 –碰撞猝灭 »激发态荧光分子与猝灭剂碰撞产生无辐射跃迁回基态
磷 系 内 外 振 延 荧光：10-7~10-9 s; 光 间 转 转 动 迟 跨 移 移 驰 第一激发单重态的最低 荧 越 豫 振动能级→基态； 光 磷光：10-4~10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
荧光分析法的基本原理
分子荧光光谱的产生－激发态→基态的能量传递途径
内转换 S2 S1 能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 外转换 发 射 磷 振动弛豫 光
荧光分析法概述
荧光分析法分类
根据待测物质的存在形态分
• 分子荧光法；原子荧光法
根据激发所用能源分
• 光致发光法；化学发光法
荧光分析法的优点
• 灵敏度高 –紫外可见光谱~10-7 g/mL，荧光光谱~ 10-10~10-12 g/mL • 选择性好 –既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱 • 标准曲线线性范围宽 –吸收光谱法l~2个数量级，荧光分析法3~5个数量级
荧光分析法ppt课件
28
续前
给电子基团
3、pH影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。 引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂 常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物。
29
续前
返3回5
小结： 掌握
• 基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光； 激发光谱与荧光光谱
• 基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光定量分析的依据、 条件及方法
• 熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）
了解
• 荧光分析仪器
36
练习：
P297，思考题 3、5，8
13
续前 影响体系间跨越几率增大的因素：
➢含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
➢在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。
返回14
续前 4、荧光（fluorescence）
30
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
荧光光谱
瑞利光320nm
散射光谱
拉曼光360nm
瑞利光350nm 拉曼光400nm
返3回1
11.3 荧光定量分析
1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。
受激后，可在各个方向发射荧光， 在透过光的方向不易测定F。
5、散射光的干扰 散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，
第十一章 荧光分析法解析
当紫外线照射到某些物质的时候，这 些物质会发射出各种颜色和不同强度 的可见光，而当紫外线停止照射时， 所发射的光线也随之很快地消失，这
种光线被称为荧光(fluorescence)。
由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光 的波长和发射光的波长也不同，利用这个特性可以进 行物质的定性鉴别。如果该物质的浓度不同，它所发 射的荧光强度就不同，测量物质的荧光强度可对其进 行定量测定。
（二）激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质，都具有两种特征光谱，
即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光 谱(fluorescence emission spectrum)。
1. 激发光谱 保持荧光发射波长不变（即固定发射单色
器），依次改变激发光波长（即调节激发单色 器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧 光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发 光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图， 就可得到该荧光物质的激发光谱。
第二节 定性定量分析
一、荧光强度与溶液浓度的关系
分光光度法是测定物质对光的吸收程度；荧光 分析法是测定物质吸收了一定频率的光之后，物质 本身所发射的荧光强度。当溶液中的荧光物质被入 射光激发后，可以在各个方向观察到荧光，由于激 发光一部分可透过溶液，所以在透射光方向观察荧 光是不适宜的，一般是在与透射光垂直的方向观察 荧光。
2. 物质具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency）。荧光效
率也称荧光量子产率，用f 表示。
Φf
发射的荧光量子数 吸收的光量子数
kF
kVR
kIC
kF kISC
kEC
kP
可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可 增加荧光量子产率。通常，kF 由分子结构决定（内因），而其
第十一章 荧光分析法
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
分析化学荧光分析法11
2
,λ 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最 ，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最 第一激发单重态
‘ 2
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光 如λ
)
16
镜像规则的解释
S0 →S2
S0 →S1
17
三、荧光的产生与分子结构的关系 1.荧光寿命和荧光效率
3
•
当基态电子激发到某高能级时, 将有两种激发态： 当基态电子激发到某高能级时, 将有两种激发态 自旋相反多重性为1 称为激发单重态， 自旋相反多重性为1，称为激发单重态，用S表示 激发单重态 表示 自旋平行多重性为M=2×1+1=3，称为激发三重态 称为激发三重态 自旋平行多重性为 称为 state） （triplet state）用T表示
10
二、荧光激发光谱与发射光谱 1.荧光检测的基本原理 1.荧光检测的基本原理
11
2.荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（ 激发光谱（excitation spectrum)：固定测量波长， ) 固定测量波长， 将激发光的光源分光， 将激发光的光源分光，测定不同波长的激发光照射 下所发射的荧光强度的变化， 下所发射的荧光强度的变化，以IF —λ激发作图，便 λ 作图， 可得到荧光物质的激发光谱。 可得到荧光物质的激发光谱。 发射光谱或荧光光谱（fluorescence spectrum)：固 发射光谱或荧光光谱（ ) 定激发光波长和强度, 定激发光波长和强度, 让物质发射的荧光通过单色 分光,以测定不同波长的荧光强度, 分光,以测定不同波长的荧光强度, 以IF—λ荧光作图， λ 作图， 便可得到荧光物质的荧光光谱。 便可得到荧光物质的荧光光谱。
荧光分析法
基态时分子中的电子对填充在能量最低的轨道，
且自旋相反，即总自旋量子数s为0
电子能级多重性：M＝2s+1 单重态S M＝1 自旋相反 三重态T M＝3 自旋相同
4
基态
被激发跃迁过程中：
通常电子不发生自旋方向的改变,电子对自旋相反， 电子发生自旋方向的改变,电子对自旋相同，总自旋
总自旋量子数s为0,处于激发单重态。
第十一章 荧光分析法
（Fluorescence）
1
分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。
hγ
概述
M+ 能量 →M＊
M
2
分类
原子荧光 荧光 分子荧光 光致发光（PL） 紫外可见荧光 磷光 化学发光（CL） 红外荧光 X射线荧光 电致发光（EL） 生物发光（BL）
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3）荧光光谱与激发光谱镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振 动能级分布类似；
20
镜像关系?
固定em=620nm 固定ex=290nm (MAX)
IF
4 3 2 1
4800 4400
1→ 4 1→ 3
S1
4000
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4.胶束增敏荧光分析 当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，
会缔合为球状胶束， 利用胶束溶液对荧光物质有
增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护
45
荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 2.生物与有机化合物的分析
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第十一章荧光分析法
一、选择题
1．荧光分析法是通过测定( )而达到对物质的定性或定量分析。
A、激发光
B、磷光
C、发射光
D、散射光
2．下面( )分析方法不属于分子发射光谱法。
A、紫外一可见分光光度法
B、荧光分析法
C、磷光分析法
D、化学发光分析法
3．荧光发射光谱含有( )个发射带。
A、1
B、2
C、3
D、不一定
4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是（）
A、荧光光谱的形状与激发光的波长无关
B、荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像
C、荧光光谱属于分子的受激发射光谱
D、荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合
5．下列叙述错误的是（）
A、荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应
B、荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应
C、荧光光谱的形状与激发光波长无关
D、荧光波长大于激发光波长
6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激发三重态，再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称为( )。
A、分子荧光
B、分子磷光
C、瑞利散射光
D、拉曼散射光
7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。
A、振动弛豫只能在同一电子能级内进行
B、振动弛豫属于无辐射跃迁
C、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动能级
D、振动弛豫是产生Stokes位移的原因之一
8．荧光寿命指的是( )。
A、从激发光开始照射到发射荧光的时间
B、受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间
C、从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间
D、除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1／e所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是（）
A、具有长共轭的π→π﹡跃迁的物质具有较大的荧光效率
B、分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大
C、顺式异构体的荧光效率大于反式异构体
D、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同
10．采用下列( )措施可使物质的荧光效率提高。
A、适当降低溶液浓度
B、降低溶剂极性
C、加入重氮化合物
D、剧烈搅拌
11．下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（）
A、苯
B、联苯
C、萘
D、蒽
12．萘在下列( )溶剂中的荧光强度最强。
A、1一氯丙烷
B、1一溴丙烷
C、1一碘丙烷
D、1，2一二氯丙烷
13．苯胺在( )条件下荧光强度最强。
A、pH=1
B、pH=3
C、pH=10
D、pH=13
14．荧光素钠的乙醇溶液在( )条件下荧光强度最强。
A、0℃
B、-10℃
C、-20℃
D、-30℃
15．一般要在与入射光垂直的方向上观测荧光强度，这是由于( )。
A、只有在与入射光垂直的方向上才有荧光
B、荧光是向各个方向发射的，可减小透射光的影响
C、荧光强度比透射光强度大
D、荧光发射波长比透射光波长长
16．荧光法测定硫酸奎宁时，当激发光波长为320nm时, Raman光波长为360nm；当激发光波长为350nm时，Raman光波长为400nm。
若最大发射波长为448nm，则进行荧光测定时应选择( )。
A、λex=320m，λem=400nm
B、λex=320nm，λem=360nm
C、λex=350nm，λem=448nm
D、λex=320nm，λem=448nm
17．荧光分光光度计常用的光源是( )。
A、空心阴极灯
B、氙灯
C、氘灯
D、硅碳棒
18．用波长为320nm的入射光激发硫酸奎宁的稀硫酸溶液时，将产生320nm的( )。
A、荧光
B、磷光
C、Rayleigh光
D、Raman光
19．激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为（）
A、吸收曲线
B、激发光谱
C、荧光光谱
D、工作曲线
20．采用激光作为荧光光度计的光源，其优点是（）
A、可以有效消除散射光对荧光测定的干扰
B、可以提高荧光法的选择性
C、可以提高荧光法的灵敏度
D、可以避免荧光熄灭现象的产生
二、填空
1．荧光光谱的特征是--------、---------和-----------。
2.激发态分子经过--------回到第一电子激发态的最低振动能级后，以-----发射光量子跃迁回到基态的任一振动能级，这时所发射的光量子称为荧光。
3．荧光物质的------和--------是鉴定物质的依据，也是定量测定时最灵敏的条件。
4．荧光物质的激发光谱可能含有-----吸收带，但其发射光谱却只含有------吸收带。
5．能够发射荧光的物质应具备的两个条件是：物质分子有强的------和---------。
------、--------
具有较高的荧光效率
三、简答题
1．哪些因素会影响荧光波长及强度?
2．在什么条件下荧光强度和荧光物质的浓度成正比?
3．分子结构与荧光的关系。
4．为什么在室温下溶液很少呈现磷光?在什么条件下才能检测到磷光?
5．为什么荧光分析法的灵敏度高于紫外一可见分光光度法?
6．哪些物质容易发生电子由单线激发态到三线激发态的体系间跨越？
7．荧光和磷光在产生机制上有何不同？
8．如何测定激发光谱和荧光光谱？
四、计算题
1．用荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量时，取本品20片(每片含炔诺酮应为0．54～0．66mg，含炔雌醇应为31．5～38．5μg)，研细溶于无水乙醇中，稀释至250mL，过滤，取滤液5mL，稀释至lOmL，在激发波长285nm和发射波长307nm处测定荧光强度。
如炔雌醇对照品的乙醇溶液(1．4μg／mL)在同样测定条件下荧光计读数为65，则合格片的荧光计读数应在什么范围?
2．用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2．00g食品，用lOmL氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2．00mL，再用氯仿稀释为lOmL。
维生素B2氯仿标准溶液浓度为0．100μg／mL。
测得空白溶液、标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F O=1．5，F S=69．5，F X=61．5，求该食品中维生素B2的含量。
（μg／g）
参考答案
一、选择题
1．C 2．A 3．A 4．D 5．A 6．B 7．C 8．D 9．C 10．A
11．D 12．D 13．C 14．D 15．B 16．D 17．B 18．C 19．C 20．C
二、填空题
1．荧光发射波长总是大于激发光波长，荧光光谱形状与激发光波长无关，荧光光谱与激发光谱成镜像关系
2．振动弛豫，辐射形式
3．最大激发波长，最大发射波长
4．几个，一个
5．紫外一可见吸收，一定的荧光效率，长共轭分子、刚性平面结构分子
三、简答题
1．影响荧光波长及强度的因素有温度、溶剂、酸度、荧光熄灭剂、散射光。
2．在低浓度时荧光强度和荧光物质的浓度成正比。
3．分子结构与荧光有如下关系：①长共轭分子具有л→л﹡跃迁的较强紫外吸收，л电子共
轭程度越大，荧光强度越大，而荧光波长也长移。
②刚性平面结构分子具有较高的荧光效率，在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面越大，荧光效率越大，并且荧光波长产生长移。
③共轭体系上的取代基对荧光光谱和荧光强度也有很大影响。
4．由于荧光物质分子与溶剂分子间相互碰撞等因素的影响，处于激发三重态的分子常常通
过无辐射过程失活回到基态，因此在室温下很少呈现磷光，只有通过冷冻或固定化而减少外转换才能检测到磷光。
5．荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度，测量的方式是在入射光的直角方向，即在黑暗背景下检测所发射光的强度信号，因此可采用增强入射光强度或增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度。
在分光光度法中与浓度相关的参数是吸光度，而吸光度A=lgI 0/I,如果增大入射光强度，相应也增大了透射光强度，所以其比值不会变化，如果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度也同时增大，同样不能提高其比值，也就不能达到提高灵敏度的目的。
所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高。
6．7．8．略
四、计算题
1．解 测定液中炔雌醇的浓度范围在
mL
mL mL g mL mL mL g 105250205.38~105250205.31⨯⨯⨯⨯μμ 即1.26～1.54μg ／mL 之间为合格。
1．4μg ／mL 的对照品溶液的荧光计读数为65
由s
x s x c c F F =，得合格片的荧光计读数应在58．5～71．5之间。
2．解 F s -F O =K·C s ， F x -F 0 = K·C x
将F O =1．5，F S =69．5，F X =61．5，C s =0．100μg ／mL 代入方程中解得 C x =0．088μg ／mL
食品中维生素B 2的含量=C x ×00
.20.1000.20.10⨯μg/g=22μg/g。